艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的体外培养方法及其专用培养基

摘要

本发明公开了艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的体外培养方法及其专用培养基。本发明提供的体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的成套培养基由培养基1和培养基2组成；培养基1和培养基2均为哺乳动物细胞无血清培养基，培养基1含有氨基酸序列分别如SEQ？ID？No.1-SEQ？ID？No.9所示的9种多肽，培养基2含有白细胞介素2。采用本发明的成套培养基及体外培养方法能够将分离的不同艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞成功进行扩增培养，获得的细胞活性比较稳定，细胞总数显著增加，可高效识别和溶解患者自体HIV感染后的CD4+T细胞，对于艾滋病的治疗具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域中艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的体外培养方法 及其专用培养基。

背景技术

艾滋病是严重威胁人类生命健康的全球性疾病，尽管抗病毒治疗的出现显著降低 了艾滋病患者的发病率和死亡率，然而，抗病毒治疗要求终身服药，且需达到95％的 依从性，在医疗资源不发达国家和地区可谓是一项沉重的负担。因此，寻找根治艾滋 病的脚步从未停止。

过继性细胞免疫治疗自20世纪80年代开始，过继性细胞免疫治疗在临床上的应 用迅速扩展。近年来，以T细胞为基础的过继性细胞免疫治疗技术已广泛用于恶性肿 瘤及肿瘤转移患者的治疗，具有较好的安全性和有效性。

细胞毒性T细胞(cytotoxicT-lymphocyte，CTL)为一种特异T细胞，专门分 泌各种细胞因子参与免疫作用，对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与 自然细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。它的作用特点：可连续杀伤靶细 胞，具有高效性，抗原特异性和自身MHC限制性。HIV特异性CD8+T细胞与HIV病毒 载量下降直接相关，尤其是急性感染期的后期，病毒载量迅速下降的过程中，CD8+T 细胞起到最重要的作用，体外实验中经IFN-γ分泌实验和tetramer染色可见HIV感染 者的CD8+T细胞具有特异的抗病毒作用。从精英控制者(elitecontroller)和自体 免疫力能长期将病毒载量控制在调定点水平的病人外周血获得的细胞毒性T淋巴细 胞，在体外实验中，不经HIV抗原预先刺激，即可高效识别和溶解其自体HIV感染后 的CD4+T细胞。

CTL细胞免疫传输疗法是利用自身静脉血的淋巴细胞，在体外通过靶细胞抗原和 淋巴因子的诱导，分化扩增成具有强大杀伤力的CTL细胞，再经静脉回输体内，从而 有效的发挥免疫效应，达到清除病毒和杀伤肿瘤细胞的作用。CTL细胞疗法主要应用 于乙肝、丙肝和肿瘤的治疗。

CD3分子分布于成熟T淋巴细胞表面，至少由γ、δ、ε、ζ和η5种多肽链组成， 与T细胞抗原受体非共价连接。CD3单克隆抗体可诱导CD3多肽和TCR共帽形成 (co-capping)，并诱导T淋巴细胞活化。TCR识别外来抗原与自身MHC分子形成的复 合物，CD3对于信号的传递具有重要作用。

CD8分子分布于部分T淋巴细胞和胸腺细胞，是由α和β两条多肽链组成的穿膜 糖蛋白。作为细胞与细胞间的附粘分子MHCⅠ类抗原是CD8分子的配体，CD8分子与 MHCⅠ类抗原结合可以稳定MHCⅠ类抗原限制的T细胞(主要是CTL)与带有MHCⅠ类 抗原与抗原复合物的靶细胞结合。CD8阳性细胞为抑制性T淋巴细胞/杀伤性T淋巴细 胞(suppressorTlymphocyte/cytotoxicTlymphocyte,Ts/Tc)。CD8分子在T细胞 增殖和分化的信号转导中起重要作用。

干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细 胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制，其类型分为三类，α- (白细胞)型、β-(成纤维细胞)型和γ-(淋巴细胞)型；同时还可增强自然杀伤 细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗 病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核 细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生 长分化及调节免疫功能等多种生物活性。

人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)是人类的主要组织相容性复 合体，位于6号染色体上，分为HLA-I类分子和HLA-Ⅱ类分子，与人类的免疫系统功 能密切相关。研究认为抗原提呈细胞表面的HLA分子是影响HIV特异性CTL的关键因 素，不同的HLA分子与疾病进展显著相关。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何进行艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的 体外扩增培养。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性 CTL细胞的成套培养基。

本发明所提供的体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的成套培养基， 由成套使用的培养基1和培养基2组成；所述培养基1和所述培养基2均为哺乳动物 细胞无血清培养基，所述培养基1含有氨基酸序列分别如SEQIDNo.1-SEQIDNo.9 所示的9种多肽，所述培养基2含有白细胞介素2。

上述成套培养基中，多肽1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；多肽2的氨基酸 序列如SEQIDNo.2所示；多肽3的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；多肽4的氨基 酸序列如SEQIDNo.4所示；多肽5的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；多肽6的氨 基酸序列如SEQIDNo.6所示；多肽7的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示；多肽8的 氨基酸序列如SEQIDNo.8所示；多肽9的氨基酸序列如SEQIDNo.9所示。

本发明所提供的体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的成套培养基， 分为便于存放的贮存型培养基和由所述贮存型培养基和水配成的即用型培养基。

上述成套培养基中的所述贮存型培养基可为：所述培养基1中所述9种多肽的含 量满足所述9种多肽中的每种多肽的使用浓度均为2μg/mL；所述培养基2中白细胞 介素2的含量满足白细胞介素2的使用浓度为500U/mL。

上述成套培养基中的即用型培养基可为：所述培养基1中所述9种多肽的每种多 肽的含量均为2μg/mL；所述培养基2中白细胞介素2的含量为500U/mL。

上述成套培养基中，所述培养基1是在MD-CM-STM-N培养基中添加所述9种多肽 得到的液体培养基，所述培养基2是在IMSF100培养基中添加白细胞介素2得到的液 体培养基。

为解决上述技术问题，本发明还提供了体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL 细胞的产品。

本发明所提供的体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的产品，包括上 述成套培养基和HLA-A2阳性的艾滋病感染者的离体的外周血单个核细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述A1或A2的制备方法：

A1、上述成套培养基的制备方法，包括如下步骤：分别制备所述培养基1和所述 培养基2，再将所述培养基1和所述培养基2分别进行独立包装，得到所述成套培养 基；

A2、上述产品的制备方法，包括如下步骤：将上述成套培养基和所述HLA-A2阳性 的艾滋病感染者的离体的外周血单个核细胞分别进行单独包装，得到所述产品。

为解决上述技术问题，本发明还提供了体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL 细胞的组合物。

本发明所提供的体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的组合物，由SEQ IDNo.1-SEQIDNo.9所示的9种多肽组成，所述组合物中所述SEQIDNo.1-SEQID No.9所示的9种多肽的质量比为1:1:1:1:1:1:1:1:1。

为解决上述技术问题，本发明还提供了体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL 细胞的成套试剂。

本发明所提供的体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的成套试剂，由 上述组合物和白细胞介素2组成，所述组合物和白细胞介素2配套使用。

上述成套试剂中，所述组合物中的所述多肽1、所述多肽2、所述多肽3、所述多 肽4、所述多肽5、所述多肽6、所述多肽7、所述多肽8、所述多肽9和白细胞介素2 的配套使用可满足如下比例2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2 μg：(4000U-5500U)，具体可满足2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2 μg：2μg：4000U或2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：2μg：5500U。

本申请中所述艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞为HLA-A2阳性的艾滋病感染 者的离体的CD3+CD8+T淋巴细胞。

本发明还提供了下述1)-7)中任一种应用：

1)所述成套培养基在制备体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞产品中 的应用；

2)所述成套培养基在体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞中的应用；

3)所述产品在体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞中的应用；

4)所述组合物在制备体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞产品中的应 用；

5)所述组合物在体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞中的应用；

6)所述成套试剂在制备体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞产品中的 应用；

7)所述成套试剂在体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL 细胞的方法。

本发明所提供的体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的方法，包括如 下步骤：将HLA-A2阳性的艾滋病感染者的离体的外周血单个核细胞和所述培养基1 混合后，培养2天后，加入与所述培养基1体积相同的所述培养基2，以后每3-4天 加入是所述培养基1体积1.5倍的所述培养基2培养，从第一次加入所述培养基2起， 再培养10-16天，完成艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的扩增。整个体外扩增培 养时间以加入所述培养基1的时刻为0时刻，共计12-18天(如12或18天)。

本发明所提供的体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的方法具体如1) 或2)的步骤：

1)将HLA-A2阳性的艾滋病感染者的离体的外周血单个核细胞和所述培养基1混 合后，培养2天后，得到培养体系1；向所述培养体系1中加入与所述培养基1体积 相同的所述培养基2培养3天，得到培养体系2；向所述培养体系2中加入是所述培 养基1体积1.5倍的所述培养基2培养3天，得到培养体系3；向所述培养体系3中 加入是所述培养基1体积1.5倍的所述培养基2培养4天，完成艾滋病感染者HLA-A2 特异性CTL细胞的扩增。整个体外扩增培养时间以加入所述培养基1的时刻为0时刻， 共计12天。

2)将HLA-A2阳性的艾滋病感染者的离体的外周血单个核细胞和所述培养基1混 合后，培养2天后，得到培养体系1；向所述培养体系1中加入与所述培养基1体积 相同的所述培养基2培养4天，得到培养体系2；向所述培养体系2中加入是所述培 养基1体积1.5倍的所述培养基2培养4天，得到培养体系3；向所述培养体系3中 加入是所述培养基1体积1.5倍的所述培养基2培养4天，得到培养体系4；向所述 培养体系4中加入是所述培养基1体积1.5倍的所述培养基2培养4天，完成艾滋病 感染者HLA-A2特异性CTL细胞的扩增。整个体外扩增培养时间以加入所述培养基1 的时刻为0时刻，共计18天。

上述体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的方法，还包括从培养体系 中收集细胞的步骤。

上述体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的方法中，所述培养均在如 下条件下进行：温度可为35℃-37℃，具体可为37℃；CO₂体积含量可为4.0％-10.0％， 具体可为5.0％。

本发明的体外制备艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的成套培养基为无血清 培养基，本发明的体外制备艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的方法采用无血清 培养基进行培养，避免了使用血清可能导致的病源微生物污染及其它对细胞生长的不 利因素，也避免了可能带来的安全性因素。

实验证明，采用本发明的成套培养基及体外培养方法能够将分离的不同艾滋病感 染者HLA-A2特异性CTL细胞-CD3+CD8+T细胞成功进行扩增培养，获得的细胞活性比 较稳定，保持在90％以上，而且在培养12天时获得的不同艾滋病感染者的具有HLA-A2 特异性的CTL细胞-CD3+CD8+T细胞数显著高于第0天时的CD3+CD8+T细胞数，增加的 倍数范围是1.97-21.32倍，不同艾滋病感染者CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数占CD3+CD8+T 细胞数的百分比范围是0.90％-11.70％。CD3+CD8+T细胞与HIV病毒载量下降直接相关， 可高效识别和溶解患者自体HIV感染后的CD4+T细胞，对于艾滋病的治疗具有重要的 意义。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell， PBMC)来自血液样本，血液样本的采集为EDTA抗凝的全血样本，室温保存。血液 样本采集6小时内分离PBMC。

下述实施例中的“MD-CM-STM-N”培养基为天津美德太平洋科技有限公司的产 品；IMSF100培养基为北京永泰免疫应用科技有限公司的产品。

下述实施例中的白细胞介素2(IL-2)为辽宁卫星生物制品研究所(有限公司) 的产品，产品编号为赛迪恩，规格为200万IU/支；白细胞介素4(IL-4)(产品目 录号为554605，规格为5μg)，白细胞介素7(IL-7)(产品目录号为554608，规 格为5μg)，FITC标记的CD3抗体(产品目录号为555339)，PerCP-Cy5.5标记的CD4 抗体(产品目录号为560650)，APC标记的CD8抗体(产品目录号为340584)，PE标记 的IFN-γ抗体(产品目录号为559326)均为BD公司的产品。

下述实施例中的Ficoll为通用电气医疗集团生命科学部(GEHC)的产品，产 品目录号为17-5442-03。

实施例1、体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞

一、体外扩增艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的成套培养基

细胞培养基如RPMI-1640或DMEM等在培养细胞时必须添加胎牛血清或者人血 清，然而添加血清将带来一些问题，例如引入血清来源病源体污染，不同批次血清 间可能存在的差异，免疫排斥风险等等。适于在本发明的方法中使用的均为无血清 培养基。

成套培养基包括培养基1和培养基2。

培养基1是在MD-CM-STM-N培养基中添加名称为多肽1-多肽9的9种多肽得到 的液体培养基；多肽1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；多肽2的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；多肽3的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；多肽4的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示；多肽5的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；多肽6的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示；多肽7的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示；多肽8的氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示；多肽9的氨基酸序列如SEQIDNo.9所示。

培养基1中9种多肽的含量均为2μg/mL。

培养基2是在IMSF100培养基中添加白细胞介素2得到的液体培养基；白细胞介 素2在培养基2中的含量均为500U/mL。

二、采用不同细胞因子和不同培养时间对艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细 胞进行体外扩增培养

1、外周血单个核细胞(PBMC)的分离

将所收集的HLA分型为HLA-A2(采用血清学分型法鉴定)的艾滋病感染者的离 体的外周血(血样样本)放入50mL离心管中，加入与血样样本等体积的注射用生 理盐水，混匀后缓慢加到已分装好每管15mLFicoll淋巴细胞分离液的50mL离心管 中,2000rpm离心20min。离心结束后，吸取界面间细胞层到一新的50mL离心管中， 按照1:1的体积比再加入注射用生理盐水，混匀，1200rpm离心10min，倾去上清， 收集细胞沉淀。用50mL注射用生理盐水重悬细胞沉淀，1200rpm离心10min，倾去 上清，收集细胞沉淀。加5mL注射用生理盐水重悬细胞沉淀，混匀后取10μL细胞 悬液进行细胞计数，然后补充注射用生理盐水至50mL，1200rpm离心10min，倾去 上清，收集细胞沉淀，即为外周血单个核细胞(PBMC)。

2、采用不同细胞因子和不同培养时间对艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞 进行体外扩增培养

体外扩增培养的方法包括方法A和B，具体步骤如下：

方法A用12mL培养基1重悬步骤1获得的外周血单个核细胞(PBMC)后接种 到6孔板(Corning公司，美国，货号3516，生长面积9.5cm²)中，每孔细胞密度 为2.0×10⁶，每孔2mL，放入细胞培养箱在37℃、5％CO₂中开始培养，记为0时刻。 接种培养2天后，得到培养体系1；从细胞培养箱中取出培养板，向培养体系1的 每孔加入2mL培养基2，放入细胞培养箱中继续在37℃、5％CO₂中培养3天得到培 养体系2；从细胞培养箱中取出培养板，向培养体系2的每孔加入3mL培养基2， 放入细胞培养箱中继续在37℃、5％CO₂中培养3天得到培养体系3；向培养体系3 中的每孔加入3mL培养基2，放入细胞培养箱中继续在37℃、5％CO₂中培养4天， 完成艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的扩增，共计12天，收集细胞悬液，得到 细胞培养12天的细胞悬液。

方法A用12mL培养基1重悬步骤1获得的外周血单个核细胞(PBMC)后接种 到6孔板(Corning公司，美国，货号3516，生长面积9.5cm²)中，每孔细胞密度 为2.0×10⁶，每孔2mL，放入细胞培养箱在37℃、5％CO₂中开始培养，记为0时刻。 接种培养2天后，得到培养体系1；从细胞培养箱中取出培养板，向培养体系1的 每孔加入2mL培养基2，放入细胞培养箱中继续在37℃、5％CO₂中培养4天得到培 养体系2；从细胞培养箱中取出培养板，向培养体系2的每孔加入3mL培养基2， 放入细胞培养箱中继续在37℃、5％CO₂中培养4天得到培养体系3；向培养体系3 中的每孔加入3mL培养基2，放入细胞培养箱中继续在37℃、5％CO₂中培养4天， 得到培养体系4；向培养体系4中的每孔加入3mL培养基2，放入细胞培养箱中继 续在37℃、5％CO₂中培养4天，完成艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞的扩增， 共计18天，收集细胞悬液，得到细胞培养18天的细胞悬液。

分别将细胞培养12天的细胞悬液和细胞培养18天的细胞悬液收集到50mL离 心管中，1200rpm离心10min，倾去上清并振开沉淀，补充注射用生理盐水至50mL， 1200rpm离心10min，再次倾去上清并振开沉淀，然后用50mL含有1％人血白蛋白的 注射用生理盐水重悬细胞，获得方法A的培养12天的细胞悬液和18天的细胞悬液。

方法B中除将方法A中的培养基2替换为对照培养基2外，其它操作步骤均不 变，分别获得方法B的培养12天的细胞悬液和18天的细胞悬液；对照培养基2是 在IMSF100培养基中添加白细胞介素4和白细胞介素7得到的液体培养基；白细胞介 素4在对照培养基2中的含量为400U/mL；白细胞介素7在对照培养基2含量为 10ng/mL。

通过细胞计数板和台盼兰染色镜检确定获得的细胞悬液中活细胞和死细胞的 数量，并计算活细胞百分率：活细胞百分率(％)＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数) ×100％。

扩增的细胞的表型检测使用FITC标记的CD3抗体、PerCP-Cy5.5标记的CD4抗 体、APC标记的CD8抗体、PE标记的IFN-γ抗体，通过流式细胞术进行测定。

CD3+CD8+细胞增加倍数＝(第12天或第18天的CD3+CD8+T细胞总数-第0天的 CD3+CD8+T细胞总数)/第0天的CD3+CD8+T细胞总数。

实验结果如表1所示，CD3+CD8+T细胞是具有HLA-A2特异性的CTL细胞，采用方 法A对艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞进行体外扩增培养后细胞总数和 CD3+CD8+T细胞数均高于采用方法B对艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞进行体 外扩增培养的细胞总数和CD3+CD8+T细胞数。采用方法A对艾滋病感染者HLA-A2 特异性CTL细胞进行体外扩增培养12天和18天后，细胞存活率均在90％以上，体 外扩增培养12天后CD3+CD8+T细胞总数比第0天增加8.31倍，体外扩增培养18天 后CD3+CD8+T细胞总数比第0天增加10.07倍。对艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL 细胞进行体外扩增培养12天，采用方法A扩增得到的CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数(8.30 ×10⁴个)、CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数占CD3+CD8+T细胞数的百分比(1.50％)均明显 高于采用方法B扩增得到的CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数(5.34×10²个)、 CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数占CD3+CD8+T细胞数的百分比(0.20％)。对艾滋病感染者 HLA-A2特异性CTL细胞进行体外扩增培养18天，采用方法A扩增得到的 CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数(2.83×10⁵个)、CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数占CD3+CD8+T 细胞数的百分比(4.30％)均明显高于采用方法B扩增得到的CD3+CD8+IFN-γ+T细 胞数(1.23×10³个)、CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数占CD3+CD8+T细胞数的百分比 (0.30％)。CD3+CD8+IFN-γ+T细胞为分泌IFN-γ的CD3+CD8+T细胞。上述结果显示采 用方法A可以有效地对艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞-CD3+CD8+T细胞进行体 外扩增培养。

表1、在不同细胞因子和不同培养时间下HLA-A2特异性CTL细胞的体外扩增结果

注：培养时间以接入所述培养基1的时刻为0时刻。

三、采用白细胞介素2对不同艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞进行体外培 养

1、外周血单个核细胞(PBMC)的分离

同步骤二。

2、采用白细胞介素2进行对艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞进行体外培 养

按照步骤二中方法A的体外扩增培养12天的方法培养，完成艾滋病感染者HLA-A2 特异性CTL细胞-CD3+CD8+T细胞的扩增，收集细胞悬液，分别获得培养12天的不同 艾滋病感染者的细胞悬液。

通过细胞计数板和台盼兰染色镜检确定获得的细胞悬液中活细胞和死细胞的 数量，并计算活细胞百分率：活细胞百分率(％)＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数) ×100％。

扩增的细胞的表型检测使用FITC标记的CD3抗体、PerCP-Cy5.5标记的CD4抗体、 APC标记的CD8抗体、PE标记的IFN-γ抗体，通过流式细胞术进行测定。

CD3+CD8+细胞增加倍数＝(第12天的CD3+CD8+T细胞数-第0天的CD3+CD8+T细胞 数)/第0天的CD3+CD8+T细胞数。

结果如表2所示，采用方法A体外扩增培养12天后所有细胞活性比较稳定，均保 持在90％以上；不同艾滋病感染者的HLA-A2特异性CTL细胞-CD3+CD8+T细胞数显著高 于培养第0d的CD3+CD8+T细胞数，增加的倍数范围是1.97-21.32倍。采用方法A体 外扩增培养12天后，不同艾滋病感染者CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数占CD3+CD8+T细胞 数的百分比范围是0.90％-11.70％，CD3+CD8+IFN-γ+T细胞为分泌IFN-γ的CD3+CD8+T 细胞(表3)。

表2、采用IL-2对不同艾滋病感染者HLA-A2特异性CTL细胞进行体外扩增的结果

注：培养时间以接入所述培养基1的时刻为0时刻。

表3、CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数占CD3+CD8+T细胞数的百分比

表1-表3中的CD3+％为CD3+T细胞数占细胞总数的百分比，CD3+CD8+％为 CD3+CD8+T细胞数占CD3+T细胞数的百分比，CD3+CD4+％为CD3+CD4+T细胞数占CD3+T 细胞数的百分比，CD3+CD8+IFN-γ+％为CD3+CD8+IFN-γ+T细胞数占CD3+CD8+细胞数 的百分比。