海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法，通过选取单环刺螠内脏，破碎后，制备单环刺螠内脏粉，浓缩后酶解，浓缩冷冻干燥采用Sephadex？G-15凝胶色谱柱层析，高效液相色谱分离纯化得到Gln-Pro-Met-Thr-Phe。本发明的优点是提取、纯化工艺较先进、快速、准确度高，制得的多肽ACE抑制活性显著。

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋生物活性多肽的分离纯化方法，尤其涉及海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法。

背景技术

单环刺螠(Urechisunicinctus)，俗名海肠、海肠子，属于螠虫动物门、螠纲、无管螠目、刺螠科。体粗大，长约100-300mm，宽约25-27mm，长200mm-250mm，体表满布大小不等的粒状突起，吻圆锥形；腹刚毛1对，粗大；肛门周围有一圈9-13条褐色尾刚毛。分布于俄罗斯、日本、朝鲜和我国黄渤海沿岸，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。它个体肥大,肉味鲜美,体壁肌富含蛋白质和多种人体必需氨基酸。自古以来,在我国、日本和朝鲜沿海均作为名贵的海鲜食品,有较高的经济价值。人们的传统做法只食用其体壁，而废弃内脏，菜肴俗称海肠子。

单环刺螠提取的多肽有一定的抗肿瘤及提高小鼠免疫功能的作用,肿瘤的发生是多种原因作用的结果，但最终都要涉及到癌基因的表达调控。不同的肿瘤产生时所需要的酶等调控因子不同，选择特异性小肽作小于肿瘤发生时所需的调控因子等，封闭其活性位点，可防止肿瘤发生。现在已发现很多肿瘤相关基因及肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异结合的多肽，已成为寻找抗癌药物的新热点，值得一提的是，传统的抗肿瘤药物由于缺乏对癌细胞的选择性，往往在治疗的同时产生不良反应。抗肿瘤活性多肽与此不同，在杀伤肿瘤细胞的同时对免疫系统起保护作用。已有实验证明单环刺螠多肽在体外抑制人肝癌细胞生长,并可以增强小鼠免疫力,抑制小鼠S180肉瘤的生长。但由于近几年由于捕捞强度过大，野生资源已显不足。现今，我国也陆续开展了单环刺螠人工培育苗种的生产性研究。本发明专利涉及到对单环刺螠内脏进行酶解获得降压活性多肽，为单环刺螠多肽类活性物质的开发提供重要参考。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种具有较好的ACE抑制活性的、源自单环刺螠的采用高效液相色谱制备的活性多肽的制备方法。

该采用高效液相色谱制备的活性多肽的制备方法如下：

1）选取单环刺螠内脏，破碎处理后，用丙酮脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在35℃至40℃下干燥后粉碎后得到单环刺螠内脏粉；

2）取步骤1）所述的单环刺螠内脏粉按比例加入蒸馏水，于80℃的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，得到的上清液浓缩后为样品；

3）取步骤2）所述的样品按比例加入蒸馏水，然后调节pH6.8，加入木瓜蛋白酶，在60℃水浴中加热，后用100℃水浴加热10min至15min灭酶，在离心机中4500rpm离心20min后取上清液，将该上清液采用胰蛋白酶水解2-4h，控制提取温度为60℃，pH：10；

4）步骤3）提取完成后调pH至中性后100℃水浴加热10至15min灭酶，以4500~6000rpm离心后取上清液；

5）将步骤4）处理得到的上清液浓缩后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为70%~80%，于4℃静置5h至20h，然后将上清液浓缩冷冻干燥得到单环刺螠蛋白酶解产物；

6）生物活性肽的分离纯化：将所述的单环刺螠蛋白酶解产物采用SephadexG-15凝胶色谱柱层析，高效液相色谱分离纯化得到Gln-Pro-Met-Thr-Phe。

SephadexG-15凝胶色谱柱层析含有如下步骤：

取所述的单环刺螠蛋白酶解产物，用蒸馏水溶解成100mg/ml溶液，SephadexG-15凝胶色谱柱2.0cm×100cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5ml/min，收集各峰。

高效液相色谱的分离纯化具有如下步骤：

用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱采用规格为250mm×4.6mm,5μm的反相C18键合硅胶柱；流动相：A水，B乙腈；收集主要色谱峰，冻干备用得到Gln-Pro-Met-Thr-Phe。

步骤2）所述的比例为质量比1：10至1：50或质量体积比50g：500mL至50g：2500mL。

步骤3）所述的比例为质量比1：1至1：5或质量体积比50g：50mL至50g：2500mL。

步骤3）所述的木瓜蛋白酶占样品溶液质量分数的2%。

与现有技术相比，本发明的优点在于：提取、纯化工艺较先进、快速、准确度高，制得的多肽ACE抑制活性显著。

附图说明

图1是本发明Gln-Pro-Met-Thr-Phe的质谱（ESI-MS）图；

图2是本发明Gln-Pro-Met-Thr-Phe的结构式；

图3是本发明凝胶纯化图；

图4是本发明液相纯化图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例：单环刺螠内脏来源的生物活性肽，具体为具有如下序列的短肽：Gln-Pro-Met-Thr-Phe。

其制备步骤如下：（1）内脏剪碎后用组织搅碎器搅成匀浆。丙酮搅拌脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在40℃的鼓风干燥箱内烘干过夜后粉碎。取单环刺螠内脏粉按1:20（质量体积比，50g：1000mL）加入蒸馏水，于80℃的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，重复三次上述步骤，最终得到的上清液为实验样品，浓缩。将样品按1：5（质量体积比，10g：50mL）加入蒸馏水，然后调节pH6.8，加入2%（质量分数）木瓜蛋白酶在60℃水浴中加热4h，后用100℃水浴加热15min灭酶,在离心机中4500rpm离心20min后取上清液。接着采用胰蛋白酶水解4h，提取温度60℃，pH：10，加酶量0.5%（质量分数）。提取完成后调pH至中性后100℃水浴加热15min灭酶，在离心机中4500rpm离心20min后取上清液。减压浓缩至原体积的1/20后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为80%，于4℃冰箱中放置过夜。上清浓缩冷冻干燥。

（2）生物活性肽的分离纯化；将单环刺螠蛋白酶解产物采用SephadexG-15凝胶色谱柱层析，高效液相色谱分离纯化得到一个新的五肽，体外活性显示其具有较好的ACE抑制活性。

生物活性肽的分离纯化包括如下步骤：

（1）SephadexG-15凝胶色谱柱层析；

取单环刺螠内脏蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成100mg/ml溶液，SephadexG-15凝胶色谱柱2.0cm×100cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5ml/min，自动部分收集器收集，每管收集3mL，280nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用。

（2）高效液相色谱的分离纯化；

用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱(ZorbaxC18,250mm×4.6mm,5μm)；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品。液相纯化图中的折线为流速示意，供参考。

表1高效液相色谱分离条件

时间(min)A (水，%)B (乙腈，%)0100041000167030170100350100

4.序列测定

利用氨基酸序列分析仪及质谱仪，对收集所得的组分进行氨基酸序列分析。

5.ACE抑制活性的测定

将Cushman-Cheung(1971)方法略作修改。原理是37℃、pH8.3条件下，ACE催化水解血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)产生马尿酸(Hip)，它在紫外228nm处具有特征吸收峰，通过生成物Hip的变化计算ACE抑制率。具体操作如下：用1.5ml离心管，空白对照组加入100μl5mmol/lHHL，用硼酸缓冲液(pH8.3)补足至120μl，37℃恒温水浴保温5min，加入5μl0.1U/mlACE启动反应；样品组加入100μl5mmol/lHHL和20μl水解液后，37℃恒温水浴保温5min，加入5μl0.1U/mlACE启动反应。之后两组均37℃恒温保持30min后，加入1mol/LHCl200μl中止反应，补加175μl硼酸缓冲液。用高效液相色谱法测定Hip含量。对应的峰面积分别为S_对照和S_样品。

ACE抑制率(%)=(S_对照－S_样品)/S_对照×100

本发明分离得到的1个新的生物活性肽，具有较好的ACE抑制活性，其IC₅₀为8.80±0.52μg/ml。本发明的所得的生物活性肽为白色粉末，易溶于水。

本发明的有益效果是：采用了酶解-柱色谱联技术对海蜇进行了深层次开发，具体体现在：1.以单环刺螠内脏作为酶解原料；2.采用凝胶色谱法和高效液相色谱法从单环刺螠酶解产物中分离纯化生物活性肽。3.该肽具有较好的体外ACE抑制活性，可用于制备防高血压保健食品。

尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。