一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法。设计一种三功能双链DNA探针，利用DNA甲基转移酶特异性地识别该三功能双链DNA探针发生甲基化，HpaII限制性内切酶特异性地切割残余的未甲基化的双链DNA，甲基化的双链DNA引发链置换反应，释放大量的8–17DNAzyme，8–17DNAzyme催化大量发夹型分子信标底物的切割，引发显著的荧光增强。本发明所述方法可灵敏检测DNA甲基转移酶活性，检测限为0.0082U/mL，并且该方法在研究抗癌药物对DNA甲基转移酶活性的抑制影响和筛选DNA甲基转移酶抑制剂方面具有潜在的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及酶的检测领域，具体涉及一种基于链置换放大和DNAzyme放大 的检测DNA甲基转移酶活性的方法。

背景技术

DNA甲基转移酶催化DNA甲基化，在调节基因表达和发育方面起关键作用。 异常的DNA甲基转移酶活性导致异常的DNA甲基化，这与许多类型的疾病如 癌症密切相关。显然，DNA甲基转移酶活性被认为是一种潜在的癌症生物标志 物和癌症治疗中的药物作用靶点。因此，发展一种灵敏、选择性的方法用于DNA 甲基转移酶活性的分析和其抑制剂(抗甲基化药物)的筛选对于早期癌症诊断和 治疗至关重要。

用于DNA甲基转移酶活性检测的传统方法包括凝胶电泳、高效液相色谱和 放射性标记法。尽管这些方法已经很好的建立，但大多数存在耗时、费力或需要 放射性试剂等缺点。为了克服这些缺陷，现有技术开发了新的方法包括荧光、比 色、化学发光和电化学方法用于DNA甲基转移酶活性检测。在这些方法中，荧 光方法由于简单、灵敏的特点受到广泛的关注。除了基于碳纳米材料的异相方法， 目前建立了许多荧光方法用于均相分析检测DNA甲基转移酶活性。LiJun等发 展了一种基于发夹荧光DNA探针的简单荧光方法，然而，由于目标物和信号比 为1:1，该方法的灵敏度相对较低，检测限为0.8U/mL。为了提高检测灵敏度， 许多信号放大策略包括DNAzyme放大、切割酶辅助的DNA循环反应和外切酶 III辅助的DNA循环反应，被应用于DNA甲基转移酶活性的检测分析中。相比 于发夹荧光DNA探针为基础的方法，这些方法的灵敏度提高了约一个数量级。 然而为了满足生物研究和临床诊断的发展需求，灵敏度需要进一步的改善。因此， 仍然迫切需要发展一种灵敏的策略方法用于分析DNA甲基转移酶活性。

发明内容

为解决现有技术中的上述问题，基于链置换放大和DNAzyme放大，发明人 通过研究，提供了一种双放大荧光策略用于灵敏检测DNA甲基转移酶活性。具 体为：设计一种三功能双链DNA(dsDNA)探针，包括用于DNA甲基转移酶 识别的甲基化位点、用于合成DNAzyme的8–17DNAzyme互补序列、用于切割 酶切割的切割位点。首先，DNA甲基转移酶特异性地识别和催化该三功能双链 探针发生甲基化，形成甲基化的dsDNA。随后，HpaII限制性内切酶特异性地切 割残余的未甲基化的dsDNA。接下来，甲基化的dsDNA触发链置换放大和 DNAzyme放大反应，实现双放大。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

1、一种检测DNA甲基转移酶活性的方法，其特征在于，通过链置换反应 放大和DNAzyme放大DNA甲基转移酶的识别信号；DNA甲基转移酶的作用使 得限制性内切酶无法切割探针序列，探针序列通过切割酶依赖的链置换反应扩增 出DNAzyme，进行信号一级放大；DNAzyme催化分子信标裂分释放荧光信号， 并重新释放DNAzyme，进行信号的二级放大；缺少DNA甲基转移酶时，探针 序列被限制性内切酶切割，无法进行切割酶依赖的链置换反应。

具体的，所述方法包括如下步骤：

(1)制备用于进行链置换反应的三功能双链DNA(dsDNA)探针，探针包 括杂交双链部分和悬垂单链部分，杂交双链部分含有DNA甲基转移酶识别位点， 和包含该位点的限制性内切酶的识别位点，垂悬单链部分包括链置换反应切割酶 识别的切割位点、用于合成DNAzyme的DNAzyme互补序列；

(2)加入步骤(1)探针所对应的DNA甲基转移酶孵育，然后加入步骤(1) 探针所对应的限制性内切酶进行反应；

(3)对步骤(2)反应获得体系进行酶灭活，然后进行切割酶依赖的链置换 反应，扩增DNAzyme；

(4)加入DNAzyme识别的分子信标，进行信号检测。

其中，步骤(1)中，三功能双链DNA(dsDNA)探针被DNA甲基转移酶 识别催化后，无法被对应的限制性内切酶识别，因而可以引发链置换的聚合反应； 当DNA甲基转移酶不存在时，三功能双链DNA(dsDNA)探针被对应的限制 性内切酶识别切割，切割后的片段无法引发链置换的聚合和切割反应，不能产生 DNAzyme，无法产生增强的荧光信号。

优选的，三功能双链DNA(dsDNA)探针由两条单链P1和P2退火形成， P1序列对应三功能双链DNA(dsDNA)探针的杂交双链部分序列，P1为包括 DNA甲基转移酶识别位点的单链，DNA甲基转移酶识别位点区域可被限制性内 切酶识别，P2序列按3′-5′顺序依次为P1互补序列、链置换反应切割酶识别的切 割位点、用于合成DNAzyme的DNAzyme互补序列。

优选的，三功能双链DNA(dsDNA)探针的杂交双链部分中P1的DNA甲 基转移酶识别位点与3’端间的区域为2-7个碱基的抑制区域(或称封闭区域、 保护区域)；最优选的，抑制区域的碱基为5个。

本领域技术人员应当知晓抑制区域(或称封闭区域、保护区域)的含义，其 为双链DNA寡核苷酸上酶的识别位点与末端间的碱基，以保护酶的有效作用。

优选的，分子信标为具有茎环结构的分子信标，其两端分别标记有荧光基团 和猝灭基团，与DNAzyme杂交，从而引发自身二级裂分，释放荧光信号。

在具体方案中，特别优选的，P1序列为SEQIDNO:1所示，P2序列为SEQ IDNO:2所示。

优选所检测的DNA甲基转移酶为M.SssI，所对应的限制性内切酶为HpaII； 限制性内切酶HpaII，识别序列5′-CCGG-3′；M.SssI甲基转移酶，识别序列5′-CG-3′。 当识别序列5′-CCGG-3′中3′端胞嘧啶被甲基化后可抑制限制性内切酶HpaII的切 割；而未被甲基化时，限制性内切酶HpaII可切割识别序列。

更为优选的，分子信标的序列为SEQIDNO:4所示。

2、一种利用上述检测方法进行DNA甲基化转移酶抑制剂/拮抗剂筛选的方 法，其特征在于：在步骤(2)中，在加入DNA甲基化转移酶之前，加入不同 浓度的候选抑制剂，进行孵育。

3、一种检测DNA甲基转移酶活性的试剂盒，其特征在于，包括：

用于进行链置换反应的三功能双链DNA(dsDNA)探针，探针包括杂交双 链部分和悬垂单链部分，杂交双链部分含有DNA甲基转移酶识别位点，和包含 该位点的限制性内切酶的识别位点，垂悬单链部分包括链置换反应切割酶识别的 切割位点、用于合成DNAzyme的DNAzyme互补序列；

可识别DNA甲基转移酶识别位点区域的限制性内切酶；

链置换反应体系，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶、切割酶、扩增 原料dNTPs；

分子信标，具有茎环结构的分子信标，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基 团，与DNAzyme杂交，引发自身二级裂分，释放荧光信号。

优选的，三功能双链DNA(dsDNA)探针由两条单链P1和P2退火形成， P1序列对应三功能双链DNA(dsDNA)探针的杂交双链部分序列，P1为包括 DNA甲基转移酶识别位点的单链，且限制性内切酶的识别位点包含DNA甲基转 移酶识别位点位点，P2序列按3′-5′顺序依次为P1互补序列、链置换反应切割酶 识别的切割位点、用于合成DNAzyme的DNAzyme互补序列。

特别优选的，P1序列为SEQIDNO:1所示，P2序列为SEQIDNO:2所示。

优选所检测的DNA甲基转移酶为M.SssI，所对应的限制性内切酶为HpaII。

更为优选的，分子信标的序列为SEQIDNO:4所示。

本发明取得了以下有益效果：

(1)基于链置换放大和DNAzyme放大的双放大策略，本发明所述方法可 以实现高灵敏检测DNA甲基转移酶的活性，检测限为0.0082U/mL，检测限低 于现有报道的大多数检测限；

(2)本发明所述方法基于DNA甲基转移酶的特异位点识别，因而本发明 所述方法具有良好的选择性和特异性，并且甚至能检测复杂生物基质中的DNA 甲基转移酶；

(3)通过使用两种抗癌药物5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷用于评估DNA 甲基转移酶的抑制作用，结果表明本发明所述方法在研究抗癌药物对DNA甲基 转移酶活性的抑制影响和筛选DNA甲基转移酶抑制剂方面具有广泛的应用，因 而在早期癌症诊断和治疗中具有潜在的应用前景。

附图说明

图1.基于链置换放大和DNAzyme放大的双放大荧光策略用于灵敏检测M.SssI 甲基转移酶活性的原理。

图2.(A)不同条件下，M.SssI甲基转移酶检测策略的荧光发射光谱：(a)dsDNA +MB、(b)HpaII+dsDNA+MB、(c)M.SssI+HpaII+dsDNA+MB。(B)聚丙 烯酰胺凝胶电泳表征分析M.SssI甲基转移酶：1-3条带分别是dsDNA、M.SssI+ HpaII+dsDNA和HpaII+dsDNA。

图3.抑制区域长度对ΔF的影响。

图4.M.SssI甲基转移酶与ΔF的线性关系。

图5.不同胞嘧啶甲基转移酶对ΔF的影响。

图6.不同浓度的5-氮杂胞苷(5-Aza)和5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对甲 基转移酶活性的抑制作用。

具体实施方式

实施例一：

M.SssI、HaeIII、HhaI和AluI甲基转移酶、HpaII限制性内切酶、Klenow Fragment(3′–5′exo-)聚合酶、Nb.BbvCI切割酶和S-腺苷甲硫氨酸从NEB购得。 5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷从Sigma-Aldrich获得。四种脱氧核糖核酸 (dNTPs)和HEPES购于上海生工生物技术有限公司。实验中所用化学品都为 分析纯，且使用过程中无需进一步的纯化。所有的溶液均采用超纯水制备(>18.25 MΩ·cm)。该工作中的寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成和纯化，其 序列在表格1中列出。

所有样品的荧光光谱测量在日立F-7000荧光分光光度仪上进行。发射光谱 范围为505～600nm，激发波长为494nm。518nm处的荧光强度用于评估该传感 系统的性能。激发和发射的狭缝宽度均为5nm，激发电压为700V。

表1.该工作中所使用的寡核苷酸序列

M.SssI甲基转移酶活性分析

P1和P2在95℃退火5min，然后缓慢冷却至30℃，保持2h，以形成三 功能双链DNA探针。

向10μL1×NEBuffer2(50mMNaCl,10mMTris-HCl,10mMMgCl₂,1mM dithiothreitol,pH7.9)中加入160μMSAM、600nMdsDNA和不同量的M.SssI 甲基转移酶，37℃孵育2h。随后，向上述混合液中加入20U/mLHpaII和1 ×CutSmart(50mMKAc,20mMTris-HAc,10mMMg(Ac)₂,100μg/mLBSA,pH 7.9)，37℃孵育2h。将反应系统于85℃加热20min使酶失活，然后缓慢冷 却至30℃。之后，向反应混合液中加入1.5UKlenowFragment(3′–5′exo-)、3U Nb.BbvCI和0.5mMdNTPs，总体积为30μL，37℃孵育1h。将反应系统于 85℃加热20min使酶失活，然后缓慢冷却至30℃。最后，取上述5μL反应产 物，加入200nMMB、0.1mMZn²⁺和1×HEPES缓冲液(25mMHEPES,100mM NaCl,pH7.0)，37℃孵育30min。

凝胶电泳分析甲基化

凝胶电泳实验用于验证该传感系统的可行性。在凝胶电泳分析中，除了40 U/mLM.SssI甲基转移酶，样品中其他所有的成分和上述实验相同。随后，制备 好的样品和1×loadingbuffer混合，然后使用15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将 裂解产物从底物中分离出。使用1×TBE(89mMTris,89mMBoricAcid,2.0mM EDTA,pH8.3)作为电泳缓冲液，在恒定电流为30mA的条件下电泳2h。凝胶 使用溴化乙锭染色5min，在蒸馏水中去染色5min。

药物对M.SssI甲基转移酶活性的影响

为了进一步研究该方法的抑制剂筛选能力，该工作中使用两种典型的抗癌药 物，5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷，评估了其对M.SssI甲基转移酶活性的抑 制作用。甲基化实验在10μL1×NEBuffer2中进行，包含160μMSAM、600nM dsDNA、10U/mLM.SssI甲基转移酶和不同浓度的抑制剂，37℃孵育2h。剩 余的步骤和上述描述的相同。M.SssI甲基转移酶的相对活性使用下面的公式进行 估算：相对活性＝(F_抑制剂–F₀)/(F_无抑制剂–F₀)。其中，F_抑制剂和F_无抑制剂分别为 存在或不存在抑制剂时，10U/mLM.SssI甲基转移酶的荧光强度；F₀为0U/mL M.SssI甲基转移酶的荧光强度。

M.SssI甲基转移酶活性分析的选择性

为了考察该M.SssI甲基转移酶活性分析的选择性，选择另外三种胞嘧啶甲 基转移酶(HaeIII、HhaI和AluI甲基转移酶)作为潜在的干扰酶。选择性实验 中除了使用10U/mLHaeIII、HhaI或AluI甲基转移酶代替M.SssI甲基转移酶， 其余的步骤与上述描述的相同。

实施例二：

原理分析

所提出的甲基转移酶活性分析的原理如图1所示。我们设计了一种三功能 dsDNA探针，包括用于DNA甲基转移酶识别的甲基化位点、用于合成DNAzyme 的8–17DNAzyme互补序列、用于切割酶切割的切割位点。首先，M.SssI甲基 转移酶特异性地识别和催化该三功能dsDNA探针发生甲基化，形成甲基化的 dsDNA。随后，HpaII限制性内切酶特异性地切割残余的未甲基化的dsDNA。随 后，在KlenowFragment聚合酶和dNTPs作用下，甲基化dsDNA中的P1作为 引物引发聚合反应，形成具有切割位点的完整DNA双链。接下来，Nb.BbvCI 切割该完整DNA双链，为下一级聚合反应产生一个新的复制位点。通过这种重 复的聚合和切割反应，产生大量的8–17DNAzyme。而产生的8–17DNAzyme可 与发夹型分子信标杂交。当加入辅因子Zn²⁺时，8–17DNAzyme催化分子信标底 物裂分，则分子信标底物中的荧光团与淬灭团相互分离，产生增强的荧光信号和 重新释放8–17DNAzyme。释放的8–17DNAzyme可与另外的分子信标底物杂交， 从而引发二级裂分。最终，每个释放的8–17DNAzyme都可进行多个循环，引发 大量分子信标底物的裂分，从而产生放大的信号。而当M.SssI甲基转移酶不存 在时，HpaII限制性内切酶特异性地切割dsDNA，产生两个部分。其中一个部分 是一条新的dsDNA，另一部分是一条6个碱基对的杂交双链。但是由于杂交双 链的T_m约为14℃(T_m＝(4℃)(G/C碱基对)+(2℃)(A/T碱基对))，反应温度 37℃条件下，其不稳定而分裂为两个短单链DNA(ssDNA)。两个ssDNA无 法引发聚合和切割反应，不能产生8–17DNAzyme，无法产生增强的荧光信号。

该传感系统的可行性分析

我们通过观察荧光发射光谱以验证该策略的可行性，如图2A所示。系统中 只存在分子信标时，荧光信号很弱(曲线a)，表明分子信标中荧光团的荧光被 淬灭团有效地淬灭。与之相比，当加入HpaII限制性内切酶后，背景信号稍微的 增强(曲线c)，这可能归因于HpaII限制性内切酶对dsDNA的不完全切割。然 而，当加入M.SssI甲基转移酶后，可以观察到明显的荧光强度增强(曲线b)， 这归功于HpaII限制性内切酶无法切割甲基化的dsDNA。此外，聚丙烯酰胺凝 胶电泳用于进一步的验证M.SssI甲基转移酶的甲基化过程。如图2B所示，当 M.SssI甲基转移酶和HpaII限制性内切酶都不存在时，只有dsDNA的一条亮带 (条带1)，表明无甲基化和切割事件发生。与之相比，当只有HpaII限制性内切 酶存在时，可以观察到两条亮带(条带3)且条带1中dsDNA位置的亮带消失， 表明dsDNA被HpaII限制性内切酶切割成两部分。然而，当M.SssI甲基转移酶 和HpaII限制性内切酶都存在时，只有一条亮带(条带2)且与dsDNA的亮带 位置相近，表明甲基化反应发生，而HpaII限制性内切酶无法切割甲基化的 dsDNA。实验结果和上述描述的荧光发射光谱实验结果相一致。

三功能dsDNA探针序列设计的优化

P1中3′末端的短黑线长度(称为抑制区域)是合理的三功能dsDNA探针设 计的重要因素。合理的设计可以有效地降低背景信号且M.SssI甲基转移酶存在 时显著地增强荧光信号。在此，我们设计了六种具有不同抑制区域长度的三功能 dsDNA探针。如图3所示，随着封闭区域的长度从2增加到5个碱基(P4,P5,P6 和P1)，传感系统的净信号ΔF(ΔF＝F1–F2,其中，F1和F2分别为存在或不 存在M.SssI甲基转移酶时的荧光强度)逐渐地增加，表明抑制区域长度的增加 利于M.SssI甲基转移酶识别碱基对的杂交，以促进高效的酶反应。然而，当抑 制区域的长度进一步的从6增加到7个碱基(P7和P8)，净信号ΔF降低，表明 经HpaII限制性内切酶切割后，过长的抑制区域还会引发双放大反应。因此，我 们选择5个碱基长度的抑制区域为最优的设计。

3.4该传感系统的分析性能

为了评估该方法的分析性能，我们在最优条件下测量了不同浓度的M.SssI 甲基转移酶。如图4A所示，随着M.SssI甲基转移酶浓度的增加，荧光强度增加。 这和事实相一致，更高浓度的M.SssI甲基转移酶可以产生更多的8–17DNAzyme。 所产生的8–17DNAzyme可催化大量分子信标底物裂分，产生增强的荧光强度。 如图4B的内插图所示，净信号ΔF与M.SssI甲基转移酶浓度(0.02～40U/mL) 的对数呈线性关系，检测限为0.0082U/mL。当M.SssI甲基转移酶浓度高于40 U/mL时，荧光强度趋于平稳。其原因为，M.SssI甲基转移酶浓度较高时，几乎 所有的dsDNA都发生甲基化，且HpaII限制性内切酶无法切割甲基化的dsDNA。 检测限低于现有报道的大多数检测限，表明该方法是一种有效的检测M.SssI甲 基转移酶活性的方法。该方法令人满意的灵敏度可能归因于以下两个因素：(1) 双放大策略的高放大效率；(2)荧光方法的高灵敏度和宽动态范围。

选择性和特异性分析

为了考察该方法的选择性，我们选择三种不同的胞嘧啶甲基转移酶作为潜在 的干扰酶，包括AluI、HaeIII和HhaI甲基转移酶，其识别序列分别为5′-AGCT-3′、 5′-GGCC-3′和5′-GCGC-3′。如图5所示，10U/mLM.SssI甲基转移酶可以诱导 显著的荧光强度增加。相反，其余的胞嘧啶甲基转移酶不能诱导显著的荧光强度 变化。该结果表明该方法对于M.SssI甲基转移酶具有良好的选择性。

精密度和重现性是衡量分析方法实际应用的重要参数，我们通过计算日内和 日间实验的相对标准偏差(RSD)来评估方法的精密度和重现性(n＝3)。选择 的高、中、低三个浓度分别为0.1U/mL、1.0U/mL和10U/mL。日内RSD分别 为1.8％、2.4％和3.5％。相同浓度下，日间RSD分别为2.7％、3.6％和4.7％。这 些结果表明该方法具有可接受的精密度和重现性。

复杂生物样品的分析

为了评估该方法在复杂生物样品中的实际应用，对10％稀释的人血清样品加 标不同浓度的M.SssI甲基转移酶进行了考察。选择的高、中、低三个浓度分别 为0.1U/mL、1.0U/mL和10U/mL。其回收率分别为109％、101％和99.8％，且 RSD分别为4.1％、3.2％和2.5％。这些结果表明，该方法在复杂生物样品中准确 定量M.SssI甲基转移酶方面具有很大的潜力。

DNA甲基转移酶活性的抑制评估

为了评估该方法潜在的抑制剂筛选能力，我们选择5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′- 脱氧胞苷为典型的甲基转移酶抑制剂。5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷是两种 典型的抗癌药物，经常用于大多数的甲基化抑制实验和大量的临床实验中。如图 6所示，随着抑制剂浓度的增加，M.SssI甲基转移酶的相对活性降低。且5-氮杂 -2′-脱氧胞苷相比于5-氮杂胞苷具有较高的抑制效率，原因是5-氮杂-2′-脱氧胞苷 无需修饰成脱氧形态，更容易嵌合到DNA中。从图6曲线中可得，5-氮杂胞苷 和5-氮杂-2′-脱氧胞苷的IC50值(降低50％酶活性所需的抑制剂浓度)分别约为 2.5和0.5μM。该结果与先前报道的甲基转移酶活性分析结果相一致。这些结果 表明，该方法在研究抗癌药物对DNA甲基转移酶活性的抑制影响和筛选DNA 甲基转移酶抑制剂方面具有潜在的应用。

简而言之，基于链置换放大和DNAzyme放大，我们发展了一种双放大荧光 策略用于灵敏检测M.SssI甲基转移酶活性。由于双放大策略的高放大效率，该 方法可灵敏检测M.SssI甲基转移酶，检测限为0.0082U/mL，低于大多数报道的 DNA甲基转移酶活性检测方法。此外，由于M.SssI甲基转移酶具有特异识别位 点，该方法能够区分M.SssI甲基转移酶与其他的胞嘧啶甲基转移酶，具有良好 的选择性。而且该方法在人血清中的应用进一步证实该方法具有在复杂生物样品 中检测M.SssI甲基转移酶活性的潜力。此外，使用两种抗癌药物5-氮杂胞苷和 5-氮杂-2′-脱氧胞苷用于评估DNA甲基转移酶的抑制作用，结果表明该方法在研 究抗癌药物对DNA甲基转移酶活性的抑制影响和筛选DNA甲基转移酶抑制剂 方面具有潜在的应用。上述结果表明，该方法在早期癌症诊断和治疗方面具有潜 在的应用。