一种特异性的分子标记在鉴定雪山草鸡中的应用以及鉴定雪山草鸡的试剂盒和鉴定的方法

摘要

本发明涉及一种特异性的分子标记在鉴定雪山草鸡中的应用以及鉴定雪山草鸡的试剂盒和鉴定的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；所述试剂盒包括DNA提取试剂、鉴定体系和阳性对照；所述方法包括4个步骤。本发明的有益效果为：本发明的鉴定鸡种的方法能够很好的从分子学水平鉴定出雪山草鸡，应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，也为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。

说明书

技术领域

本发明属于动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域，具体涉及一种特 异性的分子标记在鉴定雪山草鸡中的应用、鉴定的试剂盒以及鉴定的方法。

背景技术

雪山草鸡是利用中国优质地方良种藏鸡、茶花鸡为主要素材，经多种杂交 选育而成的草鸡新品种。雪山草鸡性成熟早，长羽快，基本无啄羽现象。抗病 能力强，适合多种方式饲养。雪山草鸡具有耐粗饲，抗病力强等特点，全国各 地都能饲养，特别适合广大农村果园，树林，荒地，山坡放养。肉质鲜美，深 受光大消费者喜爱。雪山草鸡作为一种优良鸡种，不管是为其保种，还是建立 家系和品系工作，都要对鸡种进行明确鉴定和分类。

长期以来，主要是以常规形态学标记分析手段进行动物品种分类和真伪鉴 定。形态学标记分析简便、经济，但由于形态学特征常常受环境因素的影响， 具有表型可塑性和遗传可变性，容易导致不正确的分类与鉴定；并且形态学方 法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元，应用分子生物学技术将有利 于品种鉴定。形态学鉴定的局限性和不断缩减的分类学家队伍，使分类学的发 展面临巨大的挑战。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种特异性的分子标记 在鉴定雪山草鸡中的应用以及鉴定雪山草鸡的试剂盒和鉴定的方法，能够通过 分子生物学技术手段对不同鸡种进行更精确的分类。

本发明所采用的技术方案为：

一种特异性的分子标记在鉴定雪山草鸡中的应用，所述分子标记的包括如 SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。所述分子标记来源于雪山草鸡的16号染色 体BRD2基因的3’UTR区域，雪山草鸡的16号染色体BRD2基因的3’UTR区 域的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，其他鸡种的16号染色体BRD2基因 的3’UTR区域的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。扩增所述分子标记的上 游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；扩增所述分子标记的下游引物的 核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。

一种鉴定雪山草鸡的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：

DNA提取试剂：总体系1000μL，0.02mg的CTAB(十六烷基三甲基溴化 铵)、100μL浓度为100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)(三(羟甲基)氨基甲烷)、 200μL浓度为1mol/L的EDTA(pH8.0)乙二胺四乙酸)、150μL浓度为2.5mmol/L 的NaCl、0.03mg的PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)，余量为ddH₂O。其中EDTA 为抗凝剂；Tris-HCL、NaCl和PVP-40共同作为裂解液使用。

鉴定体系：总体系为20μL：1μL浓度为100ng/μL的待鉴定鸡种的DNA， 2μL10×PCRBuffer，1.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，浓度为10pmol/μL 的上、下游引物各1μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，ddH₂O13.3μL；

阳性对照：总体系为20μL：1μL浓度为100ng/μL的雪山草鸡的DNA， 2μL10×PCRBuffer，1.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，浓度为10pmol/μL 的上、下游引物各1μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，ddH₂O13.3μL；

阴性对照：总体系为20μL：1μL浓度为100ng/μL的其他鸡种的DNA， 2μL10×PCRBuffer，1.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，浓度为10pmol/μL 的上、下游引物各1μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，ddH₂O13.3μL；

其中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，下游引物的核苷酸 序列如SEQIDNO：3所示；雪山草鸡的DNA中的16号染色体BRD2基因的 3’UTR区域核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；其他鸡种的DNA中的16号染 色体BRD2基因的3’UTR区域核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。

一种鉴定雪山草鸡的方法，所述方法包括以下步骤：

1)以包括SEQIDNO：1所示的核苷酸序列作为模板，用如SEQIDNO： 2所示的核苷酸序列作为上游引物，如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列作为 下游引物进行PCR扩增；在实际的操作过程中，该步骤只操作一次即可，无需 每次鉴定都进行操作。

2)以待鉴定鸡种的DNA作为模板，用如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列 作为上游引物，如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列作为下游引物进行PCR扩 增；

3)将步骤1)和步骤2)中PCR扩增得到的两种扩增产物分别通过琼脂糖 凝胶电泳进行检测并进行对比；

4)如两种扩增产物相同，则待鉴定鸡种即为雪山草鸡；如两种扩增产物不 同，则待鉴定鸡种为非雪山草鸡。经反复验证后，雪山草鸡的扩增产物的特异 性条带出现在300bp处，因此当待鉴定鸡种的扩增产物出现300bp的特异性扩 增条带时，则判定该待鉴定鸡种为雪山草鸡，反之，则待鉴定鸡种不为雪山草 鸡。

所述步骤1)和步骤2)中PCR扩增反应体系的总体积为20μL：1μL浓 度为100ng/μL的DNA模板，2μL10×PCRBuffer，1.5μL浓度为10mmol/L 的dNTP，浓度为10pmol/μL的上下游引物各1μL，0.2μL浓度为5U/μL的 Taq酶，ddH₂O13.3μL。

所述步骤1)和步骤2)中PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变 性40s，64.6℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min， 4℃保存备用。

所述步骤3)所用琼脂糖凝胶电泳为：将PCR扩增得到的两种扩增产物用 2％浓度的琼脂糖凝胶在电压为100V的条件下，电泳40min，分子量为50-500bp 的DNAMarker作参照。其中琼脂糖凝胶的浓度为质量体积比。

本发明中所用试剂如无特殊说明，均为市购。

本发明的有益效果为：本发明将本发明的鉴定鸡种的方法能够很好的从分 子学水平鉴定出雪山草鸡，应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异 性高而且重复性高，也为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学 依据。

附图说明

图1是本发明的琼脂糖凝胶电泳图。

图中：1、雪山草鸡；2、罗斯鸡；3、斗鸡；4、乌骨鸡；5、鹿苑鸡；6、 安卡鸡；7、油鸡；8、文昌鸡；9、太湖鸡；10、溧阳鸡。

具体实施方式

实施例1

本发明提供了一种特异性的分子标记在鉴定雪山草鸡中的应用，所述分子 标记的包括如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。所述分子标记来源于雪山草 鸡的16号染色体BRD2基因的3’UTR区域。扩增所述分子标记的上游引物的 核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；扩增所述分子标记的下游引物的核苷酸序 列如SEQIDNO：3所示。

如表1所示为雪山草鸡与其他鸡种16号染色体BRD2基因的3’UTR区域 的基因片段，由于雪山草鸡与其他鸡种在16号染色体BRD2基因的3’UTR区 域内存在明显的不同，如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列为雪山草鸡特有的 一段核苷酸序列，因此可以将雪山草鸡该段核苷酸序列作为区分雪山草鸡和其 他鸡种的分子标记，应用于鉴定雪山草鸡上。

表1雪山草鸡与其他鸡种16号染色体BRD2基因的3’UTR区域基因片段

雪山草鸡 AAGGTTTGGGGTTTTTAAAAAAAAAAAATTAAGAAAAATTAA 其他鸡种 AAGGTTTGGGGTTT--------------TTAAGAAAAATTAA

实施例2

一种鉴定雪山草鸡的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：

DNA提取试剂：总体系1000μL，0.02mg的CTAB、100μL浓度为 100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)、200μL浓度为1mol/L的EDTA(pH8.0)、150μL 浓度为2.5mmol/L的NaCl、0.03mg的PVP-40，余量为ddH₂O；

鉴定体系：总体系为20μL：1μL浓度为100ng/μL的待鉴定鸡种的DNA， 2μL10×PCRBuffer，1.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，浓度为10pmol/μL 的上、下游引物各1μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，ddH₂O13.3μL；

阳性对照：总体系为20μL：1μL浓度为100ng/μL的雪山草鸡的DNA， 2μL10×PCRBuffer，1.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，浓度为10pmol/μL 的上、下游引物各1μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，ddH₂O13.3μL；

阴性对照：总体系为20μL：1μL浓度为100ng/μL的其他鸡种的DNA， 2μL10×PCRBuffer，1.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，浓度为10pmol/μL 的上、下游引物各1μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，ddH₂O13.3μL；

其中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，下游引物的核苷酸 序列如SEQIDNO：3所示；雪山草鸡的DNA中的16号染色体BRD2基因的 3’UTR区域核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；其他鸡种的DNA中的16号染 色体BRD2基因的3’UTR区域核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。

本试剂盒鉴定体系的量为一头份，根据实际情况，如需要大批量进行检测 时，可增加鉴定体系的份数，此时阳性对照和阴性对照只要操作一次即可。

实施例3

为了对本发明鉴定雪山草鸡的方法进行说明，本实施例选取雪山草鸡、罗 斯鸡、斗鸡、乌骨鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、文昌鸡、太湖鸡、溧阳鸡，十 个不同鸡种的鸡作为待鉴定鸡种进行验证，以上鸡种均来源于扬州大学动物科 学与技术学院遗传资源实验室。

1)对每个鸡种采集10个样本，翅静脉采血0.4mL，加入0.5mol/LNa₂EDTA抗凝剂2μL，加入裂解液4mL后，通过苯酚-氯仿抽提法提取DNA；苯 酚-氯仿抽提法的具体步骤如下：加入裂解液后，再加入终浓度为20mg/mL的 蛋白酶K和终浓度为100μg/mL的RNaseA(核糖核酸酶A)，55℃消化2-3 个小时；用体积比为25：24：1的苯酚：氯仿：异戊醇混合液抽提两次； 然后用900μL的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解 于TE(缓冲液)中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μL，并保存在-20℃ 备用；

2)以步骤1)获得的DNA作为模板，用如SEQIDNO：2所示的核苷酸序 列作为上游引物，如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列作为下游引物进行PCR 扩增；

上述中PCR扩增反应体系的总体积为20μL：1μL浓度为100ng/μL的 DNA模板，2μL10×PCRBuffer，1.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，浓度为 10pmol/μL的上下游引物各1μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，ddH₂O13.3 μL；

上述中PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性40s，64.6℃退火 40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存备用；

3)将步骤1)和步骤2)中PCR扩增得到的两种扩增产物分别通过琼脂糖 凝胶电泳进行检测并进行对比；所用琼脂糖凝胶电泳为：将PCR扩增得到的两 种产物用2％浓度的琼脂糖凝胶在电压为100V的条件下，电泳40min，分子量 为50-500的DNAMarker作参照。

4)如图1所示，1号与2-10号有非常明显的区别，待鉴定鸡种中只有1号 的扩增产物出现300bp的特异性扩增条带，因此判定该待鉴定鸡种为雪山草鸡， 2-10号的罗斯鸡-2，斗鸡-3，乌骨鸡-4，鹿苑鸡-5，安卡鸡-6，油鸡-7，文昌鸡 -8，太湖鸡-9，溧阳鸡-10，九个鸡种的扩增产物的特异性条带出现在200bp至 300bp之间，因此都不是雪山草鸡。

通过以上实验，可以说明本发明的鉴定鸡种的方法能够很好的从分子学水 平鉴定出雪山草鸡，应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而 且重复性高，为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其 他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请 相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。