一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的研制方法

摘要

本发明公开了荧光蛋白表达载体，利用能在全身普遍表达的启动子CMV驱动荧光蛋白在观赏鱼体内的表达，实现观赏鱼通体表达功能的荧光蛋白载体。荧光蛋白表达载体的构建方法及应用方法。本发明还公开了一种性腺组织特异性调控表达载体，是性腺特异性启动子kop驱动rtTA的表达，rtTA与四环素结合后，驱动TRE启动子启动下游Cre蛋白表达的质粒载体。该性腺组织特异性调控表达载体的构建方法及应用方法。本发明同时公开一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的培育方法，培养得到的转基因观赏鱼经鉴定后确定为性腺无转基因成分。

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组载体、构建方法、应用。特别是一种荧光蛋白 表达载体与一种性腺组织特异性调控表达载体，以及载体在培育生态安 全型转基因荧光观赏鱼中的应用。属于基因工程、观赏鱼分子育种领域。

背景技术

如今养殖荧光观赏鱼在全球范围内形成了规模巨大的产业市场。荧 光观赏鱼有别于传统意义的观赏鱼类，其是在一定波长光线照射的情况 下，通过自身携带的荧光蛋白发出不同荧光的人工培育观赏鱼品种。荧 光观赏鱼具有更高的观赏价值与试验研究价值。例如全肾表达绿色荧光 蛋白斑马鱼品系应用于斑马鱼原肾功能的研究，利用绿色荧光蛋白在活 体鱼中的表达可以随时观察在任何时期的原肾绿色荧光蛋白表达特征， 可以满足对斑马鱼原肾功能研究的整体性与完整性要求。

在荧光观赏鱼研究上，美国最早实现商业化生产。其GloFish荧光 斑马鱼在美国境内(除了加州外)已经上市。几乎同时，台湾台港科技 推出了TK系列荧光观赏斑马鱼和青鳉鱼。目前的荧光观赏鱼由于性腺 中存在转基因成分，观赏鱼后代可以繁育并传递转基因元件，因此存在 着一定的生态风险问题。

发明内容

本发明的目的是利用转基因分子动物育种技术构建表达不同荧光蛋 白的载体，同时构建出性腺组织特异性调控表达载体。并将两种表达载 体应用于培育转基因荧光观赏鱼品系。进而，对所获得的转基因荧光观 赏鱼品系进行诱导处理，除去荧光鱼性腺中的转基因成分，以达到观赏 鱼后代回归野生型的目的，保证生态安全。

为实现上述目的，本发明分别提供一种荧光蛋白表达载体及其构建 方法，该表达载体在培育转基因观赏鱼品系中的应用；一种性腺组织特 异性调控表达载体及其构建方法，该表达载体在培育转基因观赏鱼品系 中的应用；两种载体在培育生态安全型转基因荧光观赏鱼中的应用。各 技术方案分别如下：

一种荧光蛋白表达载体，其特征在于：是以全身性表达启动子CMV 或PGK或SV40，驱动荧光蛋白eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、 mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede及 其衍生物的任一表达，并且两端带有转座子I-SceI和LoxP位点的质粒载 体；荧光蛋白表达载体名称为pISceI-LoxP-CMV-R，其中R是荧光蛋白 eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、 mCherry、mKate2、Kaede及其衍生物的任一。

上述荧光蛋白表达载体中，荧光蛋白衍生物是不同颜色荧光蛋白经 碱基突变修饰后，改良荧光性能的一类衍生物质，采用FP表示。

在优先条件下，上述荧光蛋白表达载体的全身性表达启动子是 CMV；上述荧光蛋白表达载体的荧光蛋白是eCFP或eGFP或mCherry， 分别是蓝色荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP、绿色荧光蛋白表 达载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP、红色荧光蛋白表达载体 pISceI-LoxP-CMV-mCherry。三种马鱼荧光蛋白表达载体序列分别是：

荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP序列如SEQIDNO.1；

荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP序列如SEQIDNO.2；

荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-mCherry序列如SEQIDNO.3。

荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-R的构建方法，是以pISceI质 粒载体为出发载体，构建两端带有转座子I-SceI和LoxP的荧光蛋白载体， 其中导入载体的荧光蛋白分别是eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、 mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede及 其衍生物的任一，所用到的启动子是在鱼类全发育期以及所有组织中进 行稳定驱动表达的启动子CMV或PGK或SV40。在优选条件下采用启 动子CMV，其具体技术方案如下：

荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-R构建方法，依如下方法实施：

制备插入片段：PCR扩增CMV-R-SV40片段，其中R是eEBFP2、 eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、 mCherry、mKate2、Kaede及其衍生物的任一，在CMV-R-SV40片 段两端引入LoxP序列，得到PCR产物，通过KpnI与SacI双酶切 PCR产物，回收得到插入片段；

制备载体骨架：质粒载体pISceI-CMV-R，其中R是eEBFP2、 eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、 mCherry、mKate2、Kaede及其衍生物的任一；通过KpnI与SacI双 酶切质粒载体pISceI-CMV-R，回收得到载体骨架；

制备载体pISceI-LoxP-CMV-R：将插入片段连接入载体骨架， 所得产物为载体pISceI-LoxP-CMV-R。

上述荧光蛋白表达载体在培育荧光蛋白表达转基因观赏鱼品系中的 应用。具体是，采用显微注射法，分别将任一荧光蛋白表达载体 pISceI-LoxP-CMV-R与I-SceI酶注射入观赏鱼单细胞受精卵，选育得到 表达荧光蛋白转基因观赏鱼品系。所得表达荧光蛋白转基因观赏鱼品系 分别对应是Tg(CMV-eCFP)、Tg(CMV-eGFP)、Tg(CMV-mCherry)、 Tg(CMV-eEBFP2)、Tg(CMV-SCFP3A)、Tg(CMV-mNeonGreen)、Tg (CMV-EYFP)、Tg(CMV-mOrange)、Tg(CMV-TagRFP)、Tg (CMV-mKate2)、Tg(CMV-Kaede)、Tg(CMV-FP)。

上述培育荧光蛋白表达转基因观赏鱼品系的方法中，选育过程采用 常规方法进行。一般是，将获得的任一荧光观赏鱼亲本Tg(CMV-eCFP)、 Tg(CMV-eGFP)、Tg(CMV-mCherry)、Tg(CMV-eEBFP2)、Tg (CMV-SCFP3A)、Tg(CMV-mNeonGreen)、Tg(CMV-EYFP)、Tg (CMV-mOrange)、Tg(CMV-TagRFP)、Tg(CMV-mKate2)、Tg (CMV-Kaede)或Tg(CMV-FP)的F0与野生型观赏鱼测交，产生荧光 观赏鱼的杂合体F1，从杂合体F1中筛选出全身表达荧光蛋白的杂合体 观赏鱼；选取单只全身表达荧光蛋白的杂合体F1与野生型鱼测交，产生 荧光观赏鱼的杂合体F2，从杂合体F2中筛选出全身表达荧光蛋白的雌 鱼和雄鱼；将筛选出的所述雌鱼和雄鱼进行杂交，得到荧光观赏鱼的F3， 选取全身表达荧光蛋白的F3与野生型观赏鱼进行测交，得到F4，若其 中F4全部为发荧光观赏鱼，则此鱼的亲本即为纯合体荧光蛋白表达转基 因观赏鱼。

一种性腺组织特异性调控表达载体，其特征在于：是观赏鱼性腺特 异性启动子kop或vasa或nanos13'UTR驱动rtTA的表达，rtTA与四环 素结合后，驱动TRE启动子启动下游Cre蛋白表达的质粒载体；性腺组 织特异性调控表达载体名称为pISceI-LoxP-Q.rtTA-TRE.Cre，其中Q是 kop或vasa或nanos13'UTR。

在优选条件下，上述性腺组织特异性调控表达载体的启动子是kop， 性腺组织特异性调控表达载体命名为pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre，其 序列如SEQIDNO.4所示。

上述性腺组织特异性调控表达载体的构建方法，其特征在于：是将 性腺特异性启动子kop或vasa或nanos13'UTR串联Tet-on系统的rtTA 以及TRE启动子和Cre后导入pISceI-LoxP-CMV-eGFP载体中，替换载 体pISceI-LoxP-CMV-eGFP两个LoxP位点之间的原件，构建出性腺组织 特异启动子kop或vasa或nanos13'UTR调控下的tet-on表达系统。其具 体技术方案如下：

一种性腺组织特异性调控表达载体的构建方法，依如下步骤实施：

制备中间质粒载体插入片段：PCR扩增质粒pT2 [kop:Cre-UTRnos,CMV:eGFP]的Cre:UTRnos序列，通过NotI与PstI 双酶切PCR产物，回收得到插入片段；

制备中间质粒载体骨架：通过NotI与PstI双酶切质粒载体 pT2-TRE.SB11-SV40.rtTA，回收得到载体骨架；

制备中间质粒载体：中间质粒载体插入片段连接到中间质粒载 体骨架上，得到中间质粒载体pT2-TRE.CRE-SV40.rtTA；

制备质粒载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre插入片段：PCR 扩增中间质粒载体pT2-TRE.CRE-SV40.rtTA上自PstI位点到包括 rtTA在内的序列，通过PstI与SpeI双酶切PCR产物，回收得到插 入片段；

制备质粒载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre载体骨架：通过 PstI与SpeI双酶切任一质粒载体pISceI-LoxP-CMV-R，其中R是 eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、 TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede及其衍生物的任一，回收得到 载体骨架；

制备质粒载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre：质粒载体 pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre插入片段连接到质粒载体 pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre骨架，所得产物为质粒载体 pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre；

制备性腺组织特异性调控表达载体骨架：通过EcoRI与XbaI 双酶切质粒载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre，回收得到性腺组 织特异性调控表达载体骨架；

制备kop启动子或vasa启动子或nanos13'UTR：

制备kop启动子：PCR扩增质粒载体pT2 [kop:Cre-UTRnos,CMV:eGFP]的中kop序列，通过EcoRI与XbaI 双酶切PCR产物，回收得到kop启动子；或

制备vasa启动子或nanos13'UTR启动子：根据NCBI中斑 马鱼数据库扩增获得；

制备性腺组织特异性调控表达载体 pISceI-LoxP-Q.rtTA-TRE.Cre，其中Q是kop或vasa或nanos13'UTR： 性腺组织特异性调控表达载体骨架与kop启动子或vasa启动子或 nanos13'UTR启动子连接，所得产物为性腺组织特异性调控表达载 体pISceI-LoxP-Q.rtTA-TRE.Cre。

上述性腺组织特异性调控表达载体在培育性腺组织特异调控表达转 基因观赏鱼品系中的应用。具体是采用显微注射法，将所述性腺组织特 异性调控表达载体pISceI-LoxP-Q.rtTA-TRE.Cre与I-SceI酶注射入观赏 鱼单细胞受精卵，筛选得到性腺组织特异调控表达转基因观赏鱼品系。 所得性腺组织特异调控表达转基因观赏鱼品系是Tg(Q.rtTA-TRE.Cre， 其中Q是kop或vasa或nanos13'UTR)。

上述培育性腺组织特异调控表达转基因观赏鱼品系的方法中，选育 过程采用常规方法进行。一般是，将获得的性腺组织特异调控表达转基 因观赏鱼Tg(Q.rtTA-TRE.Cre)的F0与野生型观赏鱼测交，产生所述性 腺组织特异调控表达观赏鱼杂合体F1，用PCR方法扩增在杂合体F1中 基因rtTA，从中筛选出表达rtTA的观赏鱼F1，测交获得杂合体F2。用 PCR方法扩增能杂合体F2中基因rtTA，将检测正确的观赏鱼自交，得 到F3。检测F3中的rtTA，从中筛选出表达rtTA的观赏鱼进行测交，得 到F4。PCR检测F4中rtTA，若F4中全为阳性，则其亲本F3为性腺组 织特异调控表达转基因观赏鱼纯合子。

利用本发明上述技术方案获得的任一荧光蛋白表达转基因观赏鱼品 系Tg(CMV-eCFP)、Tg(CMV-eGFP)或Tg(CMV-mCherry)、Tg (CMV-eEBFP2)、Tg(CMV-SCFP3A)、Tg(CMV-mNeonGreen)、Tg (CMV-EYFP)、Tg(CMV-mOrange)、Tg(CMV-TagRFP)、Tg (CMV-mKate2)、Tg(CMV-Kaede)或Tg(CMV-FP)与性腺组织特异 调控表达转基因观赏鱼品系Tg(Q.rtTA-TRE.Cre，其中Q是kop或vasa 或nanos13'UTR)可进一步应用于生态安全型转基因荧光观赏鱼中的培 育。

一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的培育方法，其特征在于：将任 一荧光蛋白表达转基因观赏鱼品系与性腺组织特异调控表达转基因观赏 鱼品系杂交，产生鱼卵用10ug/mLDox浸泡处理24h，收集后于28℃恒 定水温中进行培育至性成熟，得到生态安全型转基因荧光观赏鱼。

提取上述培养方法得到的生态安全型转基因荧光观赏鱼自交产生鱼 卵的基因组DNA，利用设计PCR扩增检测转基因成分rtTA，与对照相 比电泳结果显示无特异型扩增条带表明此鱼卵中以全部去除转基因成 分。

本发明生态安全型荧光观赏鱼制作方法适用于所有观赏鱼类，包括 温带淡水观赏鱼、热带淡水观赏鱼和热带海水观赏鱼。温带淡水观赏鱼 中红鲫鱼、中国金鱼、日本锦鲤等；热带淡水观赏鱼中灯类系列：如红 绿灯、头尾灯、蓝三角、红莲灯、黑莲灯等，神仙鱼系列：如红七彩、 蓝七彩、条纹蓝绿七彩、黑神仙、芝麻神仙、鸳鸯神仙、红眼钻石神仙 等，以及龙鱼系列：如银龙、红龙、金龙、黑龙鱼等。热带海水观赏鱼 如较常见的雀鲷科、蝶鱼科、棘蝶鱼科、粗皮鲷科等。同时，本发明还 可适用包括虾、水母、乌贼其他水生生物品种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)提供了荧光蛋白表达 载体，利用能在全身普遍表达的启动子CMV驱动荧光蛋白在观赏鱼体 内的表达，实现观赏鱼通体表达功能的荧光蛋白载体。(2)荧光蛋白表 达载体的构建方法及应用方法。(3)利用荧光蛋白表达载体实现的荧光 蛋白表达转基因观赏鱼品系培育方法，该方法获得的转基因观赏鱼具有 单色荧光蛋白通过表达的特征。(4)提供了一种性腺组织特异性调控表 达载体，是性腺特异性启动子kop驱动rtTA的表达，rtTA与四环素结合 后，驱动TRE启动子启动下游Cre蛋白表达的质粒载体。(5)性腺组织 特异性调控表达载体的构建方法及应用方法。(6)利用性腺组织特异性 调控表达载体实现的性腺组织特异调控表达转基因观赏鱼品系培育方 法。(7)提供了一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的培育方法，培养得 到的转基因观赏鱼经鉴定后确定为性腺无转基因成分。

附图说明

图1是荧光蛋白表达载体质粒pISceI-LoxP-CMV-eCFP结构图。

图2是荧光蛋白表达载体质粒pISceI-LoxP-CMV-eGFP结构图。

图3是荧光蛋白表达载体质粒pISceI-LoxP-CM-V-mCherry结构图。

图4是性腺组织特异性调控表达载体质粒 pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre结构图。

图5是三种带荧光蛋白基因载体分别注射鱼卵后24h照片，其中图 5a是带蓝色荧光蛋白基因载体、图5b是带绿色荧光蛋白基因载体、图 5c是带红色荧光蛋白基因载体。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。实施例中 所使用生物试剂、化学试剂等，除特别说明外，均经普通商业途径获得。

实施例一：构建蓝色荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP

如图1所示，利用PCR方法构建带LoxP位点的斑马鱼蓝色荧光蛋 白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP。

步骤S1、制备插入片段

以载体pISceI-CMV-eCFP为模板，利用PCR扩增其中CMV-R-SV40 片段，在其两端引入LoxP位点。PCR扩增上下游引物分别是LoxP-KpnI-F (如SEQIDNO.5所示)、LoxP-SacI-R(如SEQIDNO.6所示)。

所需PCR反应程序为：94℃5min；94℃20s，55℃30s，72℃2min 共30个循环；72℃5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后用PCR 产物纯化试剂盒纯化产物，除去PCR反应体系中的盐离子、酶及引物等 杂物。纯化后产物以KpnI和SacI进行双酶切，反应体系为20ul，其中 KpnI和SacI限制性内切酶各1ul，反应缓冲液2ul，纯化后的PCR产物 5ul，无菌水11ul，37℃孵育1h。

酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收得到约1700bp片段作为插入片段。

步骤S2、制备载体骨架

质粒pISceI-CMV-eCFP同时以KpnI和SacI进行双酶切，体系如上。 酶切完成后，将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收约2900bp片段 作为载体骨架。

步骤S3、制备载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP

插入片段与载体骨架用T4DNA连接酶4℃连接过夜，连接体系为插 入片段10ul，载体骨架5ul，连接缓冲液2ul，T4连接酶0.2ul，灭菌水 2.8ul。得到连接产物。

取连接产物10ul转化90ul大肠杆菌感受态细胞DH5α，用移液器 轻轻吸打混匀，冰上孵育30min后，42℃热激90s，立即置于冰上2min， 加入37℃LB培养基900ul，于37℃180rpm摇床活化1h，活化后菌 液5000rpm离心3min富集，吸掉900上清液，100ul菌液混匀后涂于 氨苄抗性培养皿上并于37℃温箱中倒置培养过夜。随机挑选10个单菌 落利用PCR方法进行检测，将阳性克隆扩大培养于6mlLB液体培养基， 37℃250rpm培养过夜，收集菌液并根据质粒提取试剂盒说明书提取质 粒。将得到质粒测序验证，测序结果与预期一致，此载体即为蓝色荧光 蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP。

实施例二：构建绿色荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP

如图2所示，利用PCR方法构建带LoxP位点的绿色荧光蛋白表达 载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP。其与实施例一相同之处不再重复。

步骤S1、制备插入片段：

以实验室已有载体pISceI-CMV-eGFP为PCR扩增模板，其余操作同 实施例一。回收插入片段。

步骤S2、制备载体骨架

质粒pISceI-CMV-eGFP同时以KpnI和SacI进行双酶切，其余操作 同实施例一。回收载体骨架。

步骤S3、制备载体pISceI-LoxP-CMV-eGFP

操作同实施例一。连接产物经验证确认为绿色荧光蛋白表达载体 pISceI-LoxP-CMV-eGFP。

实施例三：构建红色荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-mCherry

如图3所示，利用PCR方法构建带LoxP位点的红色荧光蛋白表达 载体pISceI-LoxP-CMV-mCherry。其与实施例一相同之处不再重复。

步骤S1、制备插入片段：

以实验室已有载体pISceI-CMV-mCherry为PCR扩增模板，其余操 作同实施例一。回收插入片段。

步骤S2、制备载体骨架

质粒pISceI-CMV-mCherry同时以KpnI和SacI进行双酶切，其余操 作同实施例一。回收载体骨架。

步骤S3、制备载体pISceI-LoxP-CMV-mCherry

操作同实施例一。连接产物经验证确认为红色荧光蛋白表达载体 pISceI-LoxP-CMV-mCherry。

实施例四：构建性腺组织特异性调控表达载体 pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre

如图4所示，利用PCR及酶切连接的方法构建性腺组织特异性调控 表达载体pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre。

步骤S1、制备中间质粒载体插入片段

PCR扩增质粒pT2[kop:Cre-UTRnos,CMV:eGFP](购于中国科学院 水生生物研究所)的Cre:UTRnos序列。PCR扩增上下游引物分别为 Cre-NotI-F(如SEQIDNO.7所示)、Cre-PstI-R(如SEQIDNO.8所示)。

所需PCR反应程序为：94℃5min；94℃20s，60℃30s，72℃2min 共30个循环；72℃5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后用PCR 产物纯化试剂盒纯化产物，除去PCR反应体系中的盐离子、酶及引物等 杂物。纯化后产物以NotI和PstI进行双酶切，反应体系为20ul，其中 NotI和PstI限制性内切酶各1ul，反应缓冲液2ul，纯化后的PCR产物 5ul，无菌水11ul，37℃孵育1h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收得 到插入片段。

步骤S2、制备中间质粒载体骨架

质粒载体pT2-TRE.SB11-SV40.rtTA同时以NotI和PstI进行双酶切， 体系如上。酶切完成后，将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收得 到载体骨架。

步骤S3、制备中间质粒载体

用T4DNA连接酶4℃连接过夜，其中连接反应体系为插入片段10 ul，载体骨架5ul，连接缓冲液2ul，T4连接酶0.2ul，灭菌水2.8ul。 将中间质粒载体插入片段连接到中间质粒载体骨架上，得到中间质粒载 体pT2-TRE.CRE-SV40.rtTA。

步骤S4、制备质粒载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre插入片段

PCR扩增中间质粒载体pT2-TRE.CRE-SV40.rtTA上自PstI位点到包 括rtTA在内的序列。PCR扩增上下游引物分别为PstI-F(如SEQIDNO.9 所示)、SpeI-R(如SEQIDNO.10所示)。

所需PCR反应程序为：94℃5min；94℃20s，58℃30s，72℃3min 共30个循环；72℃5min。。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后用PCR 产物纯化试剂盒纯化产物，除去PCR反应体系中的盐离子、酶及引物等 杂物。纯化后产物以PstI和SpeI进行双酶切，反应体系为20ul，其中 PstI与SpeI限制性内切酶各1ul，反应缓冲液2ul，纯化后的PCR产物 5ul，无菌水11ul，37℃孵育1h。

酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收得到插入片段。

步骤S5、制备质粒载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre载体骨架

质粒载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP或pISceI-LoxP-CMV-eGFP或 pISceI-LoxP-CMV-mCherry同时以PstI和SpeI进行双酶切，体系如上。 酶切完成后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收得到载体骨架。

步骤S6、制备质粒载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre

用T4DNA连接酶4℃连接过夜，其中连接反应体系为插入片段10 ul，载体骨架5ul，连接缓冲液2ul，T4连接酶0.2ul，灭菌水2.8ul。 质粒载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre插入片段连接到质粒载体 pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre骨架，所得产物为质粒载体 pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre。

步骤S7、制备性腺组织特异性调控表达载体骨架

通过EcoRI与XbaI双酶切质粒载体 pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre，回收得到性腺组织特异性调控表达载 体骨架；

步骤S8、制备kop启动子

PCR扩增质粒载体pT2[kop:Cre-UTRnos,CMV:eGFP]的中kop序列。 PCR扩增上下游引物分别为Kop-EcoRI-F(如SEQIDNO.11所示)、 Kop-XbaI-R(如SEQIDNO.12所示)。

所需PCR反应程序为：94℃5min；94℃20s，55℃30s，72℃5min 共30个循环；72℃5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后用PCR 产物纯化试剂盒纯化产物，除去PCR反应体系中的盐离子、酶及引物等 杂物。纯化后产物以EcoRI和XbaI进行双酶切，反应体系为20ul，其 中EcoRI和XbaI限制性内切酶各1ul，反应缓冲液2ul，纯化后的PCR 产物5ul，无菌水11ul，37℃孵育1h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收 得到kop启动子。

步骤S9、制备性腺组织特异性调控表达载体 pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre

性腺组织特异性调控表达载体骨架与kop启动子连接，采用kop启 动子序列替换载体pISceI-LoxP-SV40.rtTA-TRE.Cre中的SV40启动子， 所得产物为性腺组织特异性调控表达载体 pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre。

实施例五：培育荧光蛋白表达转基因斑马鱼品系

利用显微注射仪并参照显微注射法，分别将实施例一、二、三中构 建好的斑马鱼荧光蛋白表达载体pISceI-LoxP-CMV-eCFP、 pISceI-LoxP-CMV-mCherry、pISceI-LoxP-CMV-eGFP注射斑马鱼单细胞 受精卵。注射液体系为10ul，其中质粒30ng/ul，I-SceI缓冲液0.5x，I-SceI 酶0.3U/ul，补水至10ul。取2ul注射液注入毛细针管中，将其装入注射 仪中，按顺序注射受精卵动物极。整个操作过程在45min内完成，以确 保在细胞第一次卵裂之前注射完成。

注射后的受精卵培养于28℃，受精卵于24h后利用体视荧光显微镜 进行观察，筛选带有荧光的鱼卵进行孵育直至成鱼，此为F0代荧光蛋白 表达转基因斑马鱼。

筛选稳定遗传的纯系转基因斑马鱼。首先选择受精卵中表达荧光的 嵌合体F0与野生型斑马鱼进行杂交，筛选后代中发荧光的个体为杂合 体F1代。将这些发荧光的杂合体F1代中的单个个体和野生型进行测交， 它们的后代仍然有荧光的是杂合体F2。由于杂合体来源于同一个亲本 (杂合体F1和野生型)，因此转入的荧光片段在基因组的位置是一致的。 将杂合体F2的雌鱼和雄鱼自交，其后代F3中，有1/4概率得到荧光鱼 的纯合体F3。为验证纯合子F3，将其继续与野生型测交并统计F4鱼卵 是否发荧光。若F4鱼卵全部为发荧光，则可以确定亲本F3为纯系。

培育得到的荧光蛋白表达转基因斑马鱼品系分别是蓝色荧光蛋白表 达转基因斑马鱼品系Tg(CMV-eCFP)、绿色荧光蛋白表达转基因斑马鱼 品系Tg(CMV-eGFP)、红色荧光蛋白表达转基因斑马鱼品系Tg (CMV-mCherry)。

图5是三种带荧光蛋白基因载体分别注射鱼卵后24h照片，此时到 了咽囊期的原基-5期，这个时期幼鱼色素开始沉着，中鳍折叠，心脏开 始搏动。其中图5a是注射蓝色荧光蛋白基因载体后的鱼卵、图5b是注 射绿色荧光蛋白基因载体后的鱼卵、图5c是注射红色荧光蛋白基因载体 后的鱼卵。图5显示3种质粒在鱼体中都开始表达，鱼卵中鱼体在相应 激发光下发出蓝、绿和红色的荧光。

实施例六：培育性腺组织特异调控表达转基因斑马鱼品系

利用显微注射仪并参照显微注射法，将实施例四构建的斑马鱼性腺 组织特异性调控表达载体pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre注射斑马鱼单 细胞受精卵。注射液体系为10ul，其中质粒30ng/ul，I-SceI缓冲液0.5x， I-SceI酶0.3U/ul，补水至10ul。取2ul注射液注入毛细针管中，将其装 入注射仪中，按顺序注射受精卵动物极。整个操作过程在45min内完成， 以确保在细胞第一次卵裂之前注射完成。注射后的受精卵培养于28℃。 培养至2月龄时剪取部分尾鳍提取基因组DNA，利用PCR方法扩增 pISceI-LoxP-kop.rtTA-TRE.Cre上rtTA部分片段，所用上、下游引物分别 为rtTA-F(如SEQIDNO.13所示)、rtTA-R(如SEQIDNO.14所示)。 成功得到扩增即为F0代性腺组织特异调控表达转基因鱼。

筛选稳定遗传的纯系转基因斑马鱼。首先剪取2月龄F0嵌合体个体 尾鳍提取基因组DNA，PCR方法检测目标基因，筛选PCR结果为阳性 F0斑马鱼与野生型斑马鱼进行杂交，得到杂合体F1代。PCR检测F1 代，筛选PCR结果为阳性的斑马鱼培育至性成熟，将此杂合体F1中的 单个个体和野生型进行测交，PCR筛选阳性斑马鱼，培育至性成熟，此 为杂合体F2。由于杂合体F2来源于同一个亲本(杂合体F1和野生型)， 因此转入的基因片段在基因组的位置是一致的。将杂合体F2的雌鱼和雄 鱼自交，其后代F3中，有1/4概率得到性腺组织特异调控表达转基因鱼 的纯合子F3。为验证纯合子F3，将其继续与野生型测交并PCR检测F4 鱼卵DNA，若F4鱼卵全部为PCR阳性，则可以确定亲本F3为纯系。

培育得到性腺组织特异调控表达转基因斑马鱼品系Tg (kop.rtTA-TRE.Cre)。

实施例七：培育生态安全型转基因荧光斑马鱼

将实施例五培育所得的三种纯系荧光鱼分别与实施例六培育所得性 腺组织特异性调控表达转基因鱼进行杂交，产生鱼卵用10ug/mL的Dox 浸泡处理24h。收集后于28℃恒定水温的环境中进行培育至性成熟。

随机挑取培育所得单只成鱼与野生型斑马鱼进行测交，产生鱼卵经 培育24h后于体视荧光显微镜下观察，鱼卵全部为没有荧光，说明Dox 处理成功，成鱼性腺中转基因成分已被完全除去，此即为生态安全型转 基因荧光观赏荧光斑马鱼。