灵芝孢子粉抗氧化性的可视分析方法

摘要

本发明以水杨酸作为Fenton反应产生羟基自由基的显色剂，反应生成的二羟基苯甲酸在530nm处有最大吸收的原理，分别确定反应体系所需的最佳Fe

说明书

技术领域

本发明属于灵芝孢子粉抗氧化性分析技术领域，尤其涉及一种灵芝孢子粉抗 氧化性的可视分析方法。

背景技术

灵芝为担子菌纲多孔菌科，属真菌，作为中国传统的珍贵药材，有很高的药 用价值。灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的极其细小的颗粒。它是灵 芝的生殖细胞,具有灵芝的全部遗传活性物质，富含蛋白质和氨基酸类、糖肽类、 三萜类物质。科学研究表明，灵芝孢子粉具有保肝护肝、抗肿瘤、降血糖血脂、 免疫调节、抗氧化等多种药理作用。由于其丰富的化学成分和多种药理活性，灵 芝孢子粉逐渐受到人们的重视，有关灵芝孢子粉的研究也越来越多。有关灵芝孢 子粉的研究主要集中于两个方向，一个是关于灵芝孢子粉破壁的方法技术，另一 个方面是关于灵芝孢子粉的各种药理作用。

目前，灵芝子实体提取物的抗氧化活性已有部分研究，其中具备抗氧化能力 的物质基本确定为水提多糖和醇提物等。从灵芝孢子粉中提取的活性物质也分为 醇溶性和水溶性两种。醇溶性物质为灵芝孢子油，其中70％为脂肪酸，大部分 是不饱和脂肪酸,三萜类物质占20％左右。三萜类物质因化学结构多样而具有广 泛的生理活性。然而灵芝孢子粉的抗氧化性研究涉及体外抗氧化，特别是可视分 析灵芝孢子粉抗氧化性的部分鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是：针对现有技术的不足，提供一种操作简单、原料易得、价 格便宜、反应条件温和、无毒的灵芝孢子粉抗氧化性的可视分析方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种灵芝孢子粉抗氧化性的可视分析方 法，其包括以下步骤：

(1)向各组比色管中加入定量的水杨酸溶液和H₂O₂溶液，再分别加入不同 量的可溶性Fe²⁺溶液，加水定容各组比色管，振荡，在530nm处测定反应后混 合溶液的吸光度值，确定Fe²⁺的最佳用量；

(2)向各组比色管中加入与步骤(1)等量的水杨酸溶液和最佳用量的可溶 性Fe²⁺溶液，再分别加入不同量的H₂O₂溶液，加水定容各组比色管，振荡，在 530nm处测定反应后混合溶液的吸光度值，确定H₂O₂的最佳用量；

(3)向各组比色管中分别加入不同量的抗坏血酸溶液，再依次加入与步骤 (1)等量的水杨酸溶液以及最佳用量的可溶性Fe²⁺溶液和H₂O₂溶液，振荡， 在530nm处测定反应后混合溶液的吸光度值，得到不同浓度抗坏血酸对反应后 混合溶液颜色的标准对照图；计算不同量的抗坏血酸相对羟基自由基的清除率， 对结果进行线性拟合，得到抗坏血酸用量对羟基自由基清除率的标准曲线；

(4)向各组比色管中分别加入不同待测量的破壁灵芝孢子粉颗粒，再依次 加入与步骤(1)等量的水杨酸溶液以及最佳用量的可溶性Fe²⁺溶液和H₂O₂溶 液，振荡，观察反应得到的混合溶液颜色，并与步骤(3)得到的不同浓度抗坏 血酸对反应后混合溶液颜色的标准对照图进行比对，由此得出抗坏血酸用量参 数，将抗坏血酸用量参数带入步骤(3)得到的抗坏血酸用量对羟基自由基清除 率的标准曲线，从而可以得到分别对应不同待测量的破壁灵芝孢子粉颗粒对羟基 自由基的清除率。

本发明的有益效果是：本发明以水杨酸作为Fenton反应产生羟基自由基的 显色剂，反应生成的二羟基苯甲酸在530nm处有最大吸收的原理，分别确定反 应体系所需的最佳Fe²⁺和H2O2的用量，分别以抗坏血酸和破壁的灵芝孢子粉 作为羟基自由基的清除剂，从而得到破壁的灵芝孢子粉颗粒对羟基自由基的清除 率；此外，通过不同浓度抗坏血酸对反应后混合溶液颜色的标准对照图和抗坏血 酸用量对羟基自由基清除率的标准曲线，从而通过反应得到的混合溶液颜色比对 实现对灵芝孢子粉抗氧化性的可视分析，具有操作简单、原料易得、价格便宜、 反应条件温和、无毒等优点，对灵芝孢子粉抗氧化性能的探究为灵芝孢子粉的应 用提供了理论参考。

附图说明

图1为本发明实施例1的反应后混合溶液的吸光度值对FeSO₄用量曲线。

图2为本发明实施例1的反应后混合溶液的吸光度值对H₂O₂用量曲线。

图3为本发明的抗坏血酸用量对羟基自由基清除率的标准曲线。

图4为本发明的不同浓度抗坏血酸对反应后混合溶液颜色的标准对照图。

图5为实施例1中得到的反应后混合溶液颜色图。

图6为实施例2中得到的反应后混合溶液颜色图。

图7为实施例3中得到的反应后混合溶液颜色图。

图8为实施例4中得到的反应后混合溶液颜色图。

具体实施方式

由图1所示，本发明的发明提供了一种灵芝孢子粉抗氧化性的可视分析方法， 其包括以下步骤：

(1)向各组比色管中加入定量的水杨酸溶液和H₂O₂溶液，再分别加入不同 量的可溶性Fe²⁺溶液，加水定容各组比色管，振荡，在530nm处测定反应后混 合溶液的吸光度值，确定Fe²⁺的最佳用量；

(2)向各组比色管中加入与步骤(1)等量的水杨酸溶液和最佳用量的可溶 性Fe²⁺溶液，再分别加入不同量的H₂O₂溶液，加水定容各组比色管，振荡，在 530nm处测定反应后混合溶液的吸光度值，确定H₂O₂的最佳用量；

(3)向各组比色管中分别加入不同量的抗坏血酸溶液，再依次加入与步骤 (1)等量的水杨酸溶液以及最佳用量的可溶性Fe²⁺溶液和H₂O₂溶液，振荡， 在530nm处测定反应后混合溶液的吸光度值，得到不同浓度抗坏血酸对反应后 混合溶液颜色的标准对照图；计算不同量的抗坏血酸相对羟基自由基的清除率， 对结果进行线性拟合，得到抗坏血酸用量对羟基自由基清除率的标准曲线；

(4)向各组比色管中分别加入不同待测量的破壁灵芝孢子粉颗粒，再依次 加入与步骤(1)等量的水杨酸溶液以及最佳用量的可溶性Fe²⁺溶液和H₂O₂溶 液，振荡，观察反应得到的混合溶液颜色，并与步骤(3)得到的不同浓度抗坏 血酸对反应后混合溶液颜色的标准对照图进行比对，由此得出抗坏血酸用量参 数，将抗坏血酸用量参数带入步骤(3)得到的抗坏血酸用量对羟基自由基清除 率的标准曲线，从而可以得到分别对应不同待测量的破壁灵芝孢子粉颗粒对羟基 自由基的清除率。

优选的，所述H₂O₂和Fe²⁺的最佳用量摩尔比为(10-60):(1-10)。进一步 优选的，所述水杨酸溶液浓度为0.01-1.0mol/L。进一步优选的，所述Fe²⁺溶液 浓度为0.001-0.1mol/L。进一步优选的，所述H₂O₂溶液的浓度为0.5-50mol/L。

优选的，所述Fe²⁺溶液采用FeSO₄溶液或FeCl₂溶液。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施 例。

实施例1：

(1)向10mL比色管中加入2.00mL 0.01mol/L的水杨酸溶液，不同量的 0.018mol/L的FeSO₄溶液，0.50mL的质量浓度为30％的H₂O₂溶液，用水定 容至10mL，充分振荡混合，在530nm处测定反应后混合溶液的吸光度值，得 到如图1所示的反应后混合溶液的吸光度值对FeSO₄用量曲线，由图1可知， 随着FeSO4溶液用量的增加，反应后混合溶液的吸光度增大，当用量达到0.50 mL时，反应后混合溶液的吸光度值变化不大，因此确定FeSO₄溶液的最佳用量 为0.50mL；

(2)向10mL比色管中加入2.00mL 0.01mol/L的水杨酸溶液，0.50mL 的0.018mol/L的FeSO4溶液，不同量的H2O2(30％)溶液，用水定容至10mL， 充分振荡混合，在530nm处测定反应后混合溶液的吸光度值，得到如图2所示 的反应后混合溶液的吸光度值对H₂O₂用量曲线，由图2可知，随着H₂O₂溶液 用量的增加，反应后混合溶液的吸光度增大，当用量达到0.50mL时，反应后 混合溶液的吸光度值变化不大，因此确定了H₂O₂溶液的最佳用量为0.50mL；

(3)以抗坏血酸作为羟基自由基的清除剂，向比色管中分别加入0.1mL， 0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL，0.9mL，1.0mL 的1mg/mL的抗坏血酸溶液，加入2.00mL 0.01mol/L的水杨酸溶液，0.50mL 的FeSO₄溶液，0.50mL的H₂O₂溶液，启动反应，充分振荡混合，在530nm 处测定反应后混合溶液的吸光度值，得到如图4所示的不同浓度抗坏血酸对反应 后混合溶液颜色的标准对照图；计算不同量的抗坏血酸相对羟基自由基的清除 率，对结果进行线性拟合，得到如图3所示的抗坏血酸用量对羟基自由基清除率 的标准曲线；

(4)以破壁的灵芝孢子粉作为羟基自由基的清除剂，向比色管中加入0.03、 0.05、0.12g的破壁灵芝孢子粉颗粒，加入2.00mL 0.01mol/L的水杨酸溶液， 0.50mL的FeSO₄溶液，0.50mL的H₂O₂溶液，启动反应，充分振荡混合，得 到反应后混合溶液颜色如图5所示，将其与图4对照后，得出抗坏血酸用量参 数，将抗坏血酸用量参数带入如图1所示的抗坏血酸用量对羟基自由基清除率的 标准曲线，最终得到结果：0.03、0.05、0.12g的破壁灵芝孢子粉颗粒在此情况 下对羟基自由基的清除率分别为63％、76％、85％。

实施例2：

本实施例与实施例一相同，不同之处在于步骤(4)：

(4)以破壁的灵芝孢子粉作为羟基自由基的清除剂，向比色管中加入0.02、 0.04、0.10g的破壁灵芝孢子粉颗粒，加入2.00mL 0.01mol/L的水杨酸溶液， 0.50mL的FeSO₄溶液，0.50mL的H₂O₂溶液，启动反应，充分振荡混合，得 到反应后混合溶液颜色如图6所示，将其与图4对照后，得出抗坏血酸用量参 数，将抗坏血酸用量参数带入如图3所示的抗坏血酸用量对羟基自由基清除率的 标准曲线，最终得到结果：0.02、0.04、0.10g的破壁灵芝孢子粉颗粒在此情况 下对羟基自由基的清除率分别为63％、76％、85％。

实施例3：

本实施例与实施例一相同，不同之处在于步骤(4)：

(4)准确称取灵芝破壁孢子粉3.0g，以料液比1:15加入蒸馏水45.0g，在 37℃下超声提取35min，超声结束后将提取液进行离心，取上层清液进行浓缩， 浓缩至10mL。以破壁的灵芝孢子粉作为羟基自由基的清除剂，向比色管中加入 0.3、0.5、0.9mL的破壁灵芝孢子粉颗粒，加入2.00mL 0.01mol/L的水杨酸 溶液，0.50mL的FeSO₄溶液，0.50mL的H₂O₂溶液，启动反应，充分振荡混 合，得到反应后混合溶液颜色如图7所示，将其与图4对照后，得出抗坏血酸 用量参数，将抗坏血酸用量参数带入如图3所示的抗坏血酸用量对羟基自由基清 除率的标准曲线，最终得到结果：0.3、0.5、0.9mL的破壁灵芝孢子粉颗粒在此 情况下对羟基自由基的清除率分别为15％、28％、47％。

实施例4：

本实施例与实施例一相同，不同之处在于步骤(4)：

(4)准确称取灵芝破壁孢子粉3.0g，以料液比1:15加入蒸馏水45.0g，在 37℃下超声提取35min，超声结束后将提取液进行离心，取上层清液进行浓缩， 浓缩至10mL。以破壁的灵芝孢子粉作为羟基自由基的清除剂，向比色管中加入 0.4、0.7、0.9mL的破壁灵芝孢子粉颗粒，加入2.00mL 0.01mol/L的水杨酸 溶液，0.50mL的FeSO₄溶液，0.50mL的H₂O₂溶液，启动反应，充分振荡混 合，得到反应后混合溶液颜色如图8所示，将其与图4对照后，得出抗坏血酸 用量参数，将抗坏血酸用量参数带入如图3所示的抗坏血酸用量对羟基自由基清 除率的标准曲线，最终得到结果：0.4、0.7、0.9mL的破壁灵芝孢子粉颗粒在此 情况下对羟基自由基的清除率分别为38％、47％、57％。