一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)侵染小麦组织的染色方法

摘要

本发明提供了一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia？controversa？Kühn)侵染小麦组织的染色方法，属于真菌染色技术领域。所述染色方法包括如下步骤：(1)固定：取不同生长时期的小麦组织样品，在无水乙醇固定液浸泡不少于24h；(2)染色：将样品先置于含10μg/ml？Propidium？Idodide和0.02％Tween20的A染色液中浸泡15min,然后置于20μg/ml？WGA-AF488的B染色液中20min，最后用1×PBS？pH7.4冲洗；(3)将处理后样品置于载玻片上加盖玻片倒置后在激光共聚焦显微镜下观察是否有菌丝侵染。同时，本发明还提供了基于所述染色方法的用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织的试剂盒。采用所述染色方法和试剂盒对小麦组织进行染色，实现在任意生长阶段的各种小麦组织中获得较好的黑穂菌染色效果并确认该组织对应的小麦植株是否被黑穂菌侵染，具有操作简单、便捷、有效、限制少、效果好等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及真菌染色技术，特别是一种采用WheatGermAgglutinin,Alexa488 Conjugate(WGA-AF488)染剂标记小麦黑穗菌(TilletiacontroversaKühn)从而确定小麦组织是 否被侵染的方法。

背景技术

小麦矮腥黑穗病菌(TilletiacontroversaKühn,TCK)属真菌界黑粉菌科腥黑粉菌属，是 引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产造成严重的危害，也是我 国外来生物入侵研究的主要物种之一。

基于形态学观察和鉴定目的的常见的真菌染色方法包括：高碘酸无色品红法(PAS法)、 HE染色、六胺银法(GMS法)、黏液胭脂红法(Mucincarmine法)、阿尔辛蓝法(AB法)、无 色品红醛品红法(Gridley法)等，但这些方法都不能获得较好的TCK染色效果。

现有技术中存在一种根据黑穂病菌的自发荧光显微学特性甄别小麦矮腥黑穗病菌和小麦 网腥黑穗病菌(T.carvesTul.,TCT)的方法，即，在Strockwell等人的方法上做了相应的改进， 能够在观察数量足够多的情况下很好地鉴别TCK和TCT。

同样属于黑粉菌科的茭白黑粉菌，现有技术中有一种快速观察其菌丝的方法，即 Latude-Dada(1996)方法的改进，包括：首先在脱色液(0.15％三氯乙酸溶解在3∶1(w/v) 的乙醇和氯仿混合液中)中脱色，蒸馏水漂洗3次后，用0.025％苯胺蓝乳酚油染色液进行染色， 然后置于激光共聚焦显微镜下观察即可。

然而，目前该领域尚未存在一种能够实现在任意生长阶段的各种小麦组织中获得较好的 黑穂菌染色效果并确认该小麦组织是否被侵染的方法。

发明内容

基于本领域如上所述的空白和需求，本发明提供了一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia controversaKühn)侵染小麦组织的染色方法。技术方案如下：

一种用于确定小麦黑穗菌(TilletiacontroversaKühn)侵染小麦组织的染色方法，包括如下 步骤：

(1)固定：取不同生长时期的小麦组织样品，在无水乙醇固定液浸泡不少于24h；

(2)染色：将样品先置于含10μg/mlPropidiumIdodide和0.02％Tween20的A染色液中 浸泡15min,然后置于20μg/mlWGA-AF488的B染色液中20min，最后用1×PBSpH7.4 冲洗；

(3)将处理后样品置于载玻片上加盖玻片倒置后在激光共聚焦显微镜下观察是否有菌丝 侵染。

所述小麦组织样品指叶片、茎秆、花药或子房。

所述小麦组织样品指叶片，需剪段成5mm左右的方块且去掉四周边缘。

所述小麦组织样品指孕穗期样品，需分离子房和花药。

所述的染色方法在用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织方面的应用。

一种用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织的试剂盒，特征在于，包括：A染色液和B染色 液，A染色液是含10μg/mlPropidiumIdodide的0.02％Tween20溶液，B染色液是20μg/ml WGA-AF488。

所述试剂盒还包括用于细胞学实验的常规试剂：1×PBSpH7.4、无水乙醇、蒸馏水。

一种用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织的试剂盒的生产方法，其特征在于，组装试剂盒 的试剂中包括A染色液和B染色液，A染色液是含10μg/mlPropidiumIdodide的0.02％ Tween20溶液，B染色液是20μg/mlWGA-AF488。

组装试剂盒的试剂中还包括1×PBSpH7.4、无水乙醇、蒸馏水。

本发明请求保护一种用于确定小麦黑穗菌(TilletiacontroversaKühn)侵染小麦组织的染色 方法，包括如下步骤：(1)固定：取不同生长时期的小麦组织样品，在无水乙醇固定液中充 分浸泡；(2)染色：将样品先置于含10μg/mlPropidiumIdodide和0.02％Tween20的溶液中 浸泡15min,然后置于20μg/mlWGA-AF488的染色液中20min，最后用1×PBSpH7.4冲 洗；(3)将处理后样品置于载玻片上加盖玻片倒置后在激光共聚焦显微镜下观察是否有菌丝 侵染。该方法的技术原理如下：麦胚凝集素(WGA)是一种在细胞生物学中的应用最为广泛 的外源凝集素。Alexa488共轭WGA具有明亮的绿色荧光(激发/发射波长为495/519 nm)，它具有与真菌胞壁的几丁质相结合的特性，因此利用该染色剂能很好地实现对黑穂菌 的标记功能。

该方法首次使用WGA-AF488染剂标记小麦矮腥黑穗菌丝，PropidiumIdodide染剂用来 浸染小麦组织，在激光共聚焦显微镜下观察到小麦各个生长时期的不同组织中的TCK侵染情 况，用于确定所测小麦组织对应的小麦植株是否感染了TCK。上述步骤十分简单、便捷，无 需特殊的实验条件和处理手段，在一般的实验环境中均能操作实现，且便于推广。

进一步地，所述小麦组织样品指叶片、茎秆、花药或子房；采用本发明的染色方法，可 以使用小麦各个部位的组织作为样品进行染色，突破了不同生长时期对于小麦组织取样的局 限性，能够通过简单便捷的方式在小麦生长的任一阶段取样染色并获知确认所测小麦是否感 染TCK。

进一步地，所述小麦组织样品指叶片，需剪段成5mm左右的方块且去掉四周边缘，有利 于染色剂从四周进入细胞内。

进一步地，所述小麦组织样品指孕穗期样品，需分离子房和花药；该步骤可以实现在小 麦孕穗期取样以确定该孕穗期小麦植株是否被黑穂菌侵染。

本发明通过实验数据表明，通过本发明提供的染色方法，能够对小麦各生长时期的感染 组织进行成功染色，并获得清晰的染色效果。

根据市场需求，本发明还请求保护基于所述染色方法的用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组 织的试剂盒。组装所述试剂盒的试剂包括规格如下的染色剂：A染色液：含10μg/mlPropidium Idodide的0.02％Tween20溶液，B染色液：20μg/mlWGA-AF488；所述试剂进一步地还包 括用于细胞学实验的常规试剂，如1×PBSpH7.4、无水乙醇、蒸馏水等。采用所述试剂盒按 照本发明染色方法的步骤对小麦组织样品进行染色，同样能在各时期不同的小麦组织中获得 清晰的染色效果，并确认所测组织对应的小麦有没有感染黑穂菌。

本发明还请求保护上述试剂盒的生产方法，即任何规模的基于商业目的的组装或生产上 述用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织的试剂盒的行为均属于本发明的保护范围。

综上所述，采用本发明的染色方法能够实现在任意生长阶段的各种小麦组织中获得较好 的黑穂菌染色效果并确认该组织对应的小麦植株是否被黑穂菌侵染，同时在对于研究小麦矮 腥黑穗病的侵染循环方面，由于在目前国内外开展的一些对小麦矮腥黑穗病侵染循环对的研 究中，尚未见采用此方法获得黑穂菌侵染循环染色结果的报道，因此本发明所述的方法更具 有实际应用意义。本发明的染色方法具有操作简单、便捷、有效、限制少、效果好等特点。

附图说明

图1为小麦三叶期被TCK侵染后叶片组织染色的激光共聚焦显微镜扫描结果：

A代表经WGA-AF488染色后的菌丝；B代表经PropidiumIdodide染色后叶片组织；C 代表两种染剂merge后图像，WGA-AF488(激发光488nm/发射光510～550nm)Propidium Idodide(激发光561nm，发射光570～730nm)。标尺＝50μm

图2为小麦分蘖期遭TCK侵染后茎秆组织染色的激光共聚焦显微镜扫描结果：D代表经 WGA-AF488染色后的菌丝；E代表经PropidiumIdodide染色后茎秆组织；F代表两种染剂 merge后图像，WGA-AF488(激发光488nm/发射光510～550nm)PropidiumIdodide(激发 光561nm，发射光570～730nm)。标尺＝50μm。

图3为小麦成熟期遭TCK侵染后叶片组织染色的激光共聚焦显微镜扫描结果：G：代表 经WGA-AF488染色后的菌丝；H：代表经PropidiumIdodide染色后叶片组织；I：代表两种 染剂merge后图像，WGA-AF488(激发光488nm/发射光510～550nm)PropidiumIdodide (激发光561nm，发射光570～730nm)。标尺＝20μm。

图4为小麦孕穗期遭TCK侵染后子房、花药组织染色的激光共聚焦显微镜扫描结果：J： 代表经WGA-AF488染色后的菌丝；K：代表经PropidiumIdodide染色后子房、花药组织；L： 代表两种染剂merge后图像，WGA-AF488(激发光488nm/发射光510～550nm)Propidium Idodide(激发光561nm，发射光570～730nm)。标尺＝200μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明所述的制品，但并不以此限制本发明的范围。 如无特殊说明，下述所采用的试剂与材料均可商购获得，所采用的方法均为常规操作。

主要试剂、耗材及仪器设备

用于标记TCK的染色剂：WheatGermAgglutinin,Alexa488Conjugate(WGA-AF 488)，购自lifetechnologies，货号：W11261；

用于标记小麦组织的PropidiumIdodide、无水乙醇、PBS均可通过商购获得。

实施例1、采用本发明所述染色方法对小麦三叶期感染TCK组织染色

实验材料：小麦三叶期叶片(剪成5mm的方块，去掉边缘)。

实验步骤：

(1)固定：取不同生长时期的小麦组织样品，在无水乙醇固定液中充分浸泡，不少于 24h；

(2)染色：将样品先置于含10μg/mlPropidiumIdodide和0.02％Tween20的A染色液 中浸泡15min,然后置于20μg/mlWGA-AF488的B染色液中20min，最后用1×PBSpH7.4 冲洗；

(3)将处理后样品置于载玻片上加盖玻片倒置后在激光共聚焦显微镜下观察是否有菌丝 侵染。

实验结果，见图1。

实施例2、采用本发明所述染色方法对小麦分蘖期感染TCK组织染色

实验材料：小麦分蘖期茎秆。

实验步骤同实施例1。

实验结果见图2。

实施例3、采用本发明所述染色方法对小麦成熟期感染TCK组织染色

实验材料：小麦成熟期叶片。

实验步骤同实施例1。

实验结果见图3。

实施例4、采用本发明所述染色方法对小麦孕穗期感染TCK组织染色

实验材料：小麦孕穗期子房/花药。

实验步骤同实施例1。

实验结果见图4。