一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌转移诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒，利用外周血循环中有功能的肝癌细胞能够主动分泌AFP及EpCAM的特征，通过抗体捕获，然后根据产生的红绿荧光斑点数用荧光显微镜判读结果，可用于检测受检者外周血中是否存在游离、有功能的肝癌细胞，用于肝癌转移复发的提前预警。

说明书

技术领域

本发明属于医学免疫学及肿瘤诊断技术领域，涉及一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌肿瘤细胞捕获及诊断试剂盒。

背景技术

原发性肝癌主要是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位，发病率仍持续升高。目前已成为我国第二位癌症死亡原因。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5％左右。手术切除仍是最主要的治疗方法，转移复发己成为阻碍肝癌患者长期生存的关键。因此，临床上迫切需要探索肝癌转移复发的相关预测指标来优化治疗方案。对病人预后的准确评估可对高危转移复发病人增强辅助治疗或采用侵袭性较小的治疗方案，对低危转移复发病人避免过度治疗，从而使实现治疗个体化，提高病人的生活质量。

传统意义上的预后预测指标为肿瘤的临床病理分期和肿瘤细胞分化分级，该分期和分级能大致反映不同病人术后生存率的差别。但这些临床病理特征并不能准确预测转移复发和病人预后。恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞(CTC，circulating tumor cell)，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。因此早期发现血液中的肝癌CTC，可提供更多信息，有望准确预测肝癌的转移复发，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。

外周血样本由于其获取技术简单、创伤小、便于在同一患者多次重复进行，易于被患者接受，对于预测转移复发的可能性更为重要。尤其是针对易于血道转移的肿瘤，利用外周血标本检测其中是否存在具有转移倾向的肿瘤细胞，临床意义更大。目前，已经开发的外周血中癌细胞特异性标记物，如AFP，MAGE、CK19基因，以及外周血游离DNA检测等已被初步用于转移复发的预测。然而，上述标志物既可能来源于原发灶肿瘤细胞，也可能来源于循环中的肿瘤细胞，因此，该标志物表达水平的高低并不能准确反映直接影响肿瘤转移的循环肿瘤细胞的情况。因此，寻找能够直接捕获到外周血循环肿瘤细胞的方法己成为近年来研究的热点。

目前现存的几种循环肿瘤细胞捕获技术主要包括：(1)基于流式荧光技术、免疫磁珠分离技术针对CTC细胞膜上特异性蛋白开发的Cell Search试剂盒；(2)利用肿瘤细胞体积较其他血细胞大的特性开发的ISET法(Isolation by size ofepithelial tumor cells)；(3)其他，如逆转录聚合酶联反应、免疫细胞化学法等。但是这些CTCs检测技术均存在其局限性与不足，从而局限了其应用。(1)Cell Search试剂盒的缺点是：操作复杂，费用高，计数效果低，能否从血液中检测到肿瘤细胞很大程度上依赖于可分析的细胞数量。(2)ISET法的缺点是：不适用于体积较小的细胞，体积小的CTCs有漏检可能，造成假阴性。同时也不适用于具有异质性的肿瘤细胞检测。(3)逆转录聚合酶联反应技术的缺点是：假阳性率较高，由于基因的非法转录和活性假基因，正常粒细胞可表达部分细胞角蛋白如CKZO、CK19；细胞形态学被破坏，无法进一步判断和进行肿瘤细胞基因和转录组变化；需要更严格的标本保存条件和实验条件。(4)免疫细胞化学法的缺点是：易造成靶细胞的丢失，检测灵敏性差。更重要的是，上述方法都是基于肿瘤细胞的表型特征，而不是基于其功能特征，因此不能保证检测到的循环肿瘤细胞的功能状态(无法辨别“活细胞”和“死细胞”)。考虑到有功能的循环肿瘤细胞才是造成肿瘤远处转移的罪魁祸首，因此，开发一种新的用于功能性的循环肿瘤细胞检测技术迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于为克服已有技术的不足，提供灵敏度高、特异性强的免疫学原理作为检测反应，组成ELISPOT肝癌诊断试剂盒，用于检测外周血中具有AFP及EpCAM分泌功能的循环肝癌细胞，提高肝癌检测的灵敏度和特异性，辅助肝癌转移的诊断和鉴别诊断。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒，包括96孔滤膜板、捕获抗体、荧光标记的检测抗体、二抗、荧光防淬灭剂、CD45+磁珠及分选器、牛血清白蛋白(BSA)。

所述的捕获抗体为兔抗人AFP和EpCAM捕获抗体。

所述的荧光标记的检测抗体为FITC标记的AFP捕获抗体检测抗体和Biotin标记的EpCAM捕获抗体检测抗体。

所述的二抗为抗-FITC-490及SA-550抗体。

本发明所述的肝癌诊断试剂盒具体操作步骤如下：

1)捕获抗体预包被

96孔板中加入1∶60稀释的AFP及EpCAM抗体100μl/孔，加盖37℃孵育1-2h或4℃过夜，弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液洗板，每孔加200μl含牛血清白蛋白的PBS，加盖，37℃孵育1-2h，弃上清液，将板直接用于检测；

2)采集血液样本，并分离得到含循环肿瘤细胞的细胞群；

3)检测

包被的96孔板中，待检测孔加100μl细胞悬液，阴性对照孔加100μl 1640培养液，阳性对照孔加100μl含1×10⁴/ml的肝癌细胞株HepG2；

4)将96孔板放入湿润的培养箱在37℃、5％CO₂培养18-24h，弃上清液，用含0.1％Tween的PBS洗板；

5)每个孔中加入100μl用1％BSA的PBS稀释的荧光素标记AFP及EpCAM检测抗体，置37℃孵育1-2小时；

6)孵育后用PBS洗板后甩干，加入100μl用PBS 1∶1000倍稀释的二抗，置37℃孵育2小时；

7)每孔加入50μl荧光防淬灭剂，放置于室温闭光显色；

8)弃去荧光淬灭剂，将96孔滤膜板自然晾干；

9)使用荧光显微镜计数每个反应空孔中荧光斑点，判断结果。

本发明结果的判断方法为如果能检测到AFP和EpCAM双阳性的细胞即判定为阳性；如果检测不到AFP和EpCAM双阳性的细胞则判定为阴性。

本发明的有益效果为：克服了已有技术的不足，提供了灵敏度高、特异性强的免疫学原理作为检测反应，组成ELISPOT肝癌诊断试剂盒，用于检测外周血中表达AFP及EpCAM的循环肝癌细胞，提高肝癌检测的灵敏度和特异性，辅助肝癌的诊断和鉴别诊断。

附图说明

图1是种入不同浓度HepG2细胞后荧光显微镜观测图像；

图2是荧光显微镜下肝癌伴肺转移患者标本的细胞观测图像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

大部分肝癌细胞株HepG2都能够分泌AFP和EpCAM，因此是作为阳性对照的最佳选择。我们将体外培养的肝癌细胞株HepG2稀释不同浓度(每孔4×10⁵，2×10⁵及1×10⁵个细胞)，应用本发明固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒首先对试剂盒进行方法学的测试：

(一)捕获抗体预包被：

(1)96孔板中预铺1∶60稀释的AFP及EpCAM抗体(捕获抗体)100μl/孔，加盖37℃孵育1-2h或4℃过夜；

(2)弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，3min/次；

(3)每孔加200μl含牛血清白蛋白的PBS，加盖，37℃孵育1-2h；

(4)弃上清液，将板直接用于检测；或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用；

(二)循环肿瘤细胞检测：

(1)在包被的96孔板中加入：

a.待检测孔：100μl不同细胞密度HepG2细胞悬液(每孔4×10⁵，2×10⁵及1×10⁵个细胞)；

b.阴性对照孔：100μl 1640培养液；

(2)将96孔板放入湿润的培养箱在37℃、5％CO₂培养24小时；

(3)将96孔板取出，弃培养上清液，用含0.1％Tween的PBS洗板4次，3min/次；

(4)每个孔中加入100μl用1％BSA的PBS稀释的荧光素标记AFP及EpCAM检测抗体，置37℃孵育1-2小时；

(5)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100μl用PBS 1∶1000倍稀释的抗-FITC-490及SA-550抗体(二抗)，置37℃孵育2小时；

(6)每孔加入50μl荧光防淬灭剂，放置于室温闭光显色；

(7)弃去荧光淬灭剂，将96孔滤膜板自然晾干。

(四)结果观察：

使用荧光显微镜计数每个反应空孔中红绿荧光斑点，每一个绿色荧光点代表一个分泌AFP的细胞；每一个红色荧光点代表一个分泌EpCAM的细胞。其中，荧光显微镜对于红绿荧光激发光波长分别为：绿色荧光FITC(激发光波长490nm/发射光波长510nm)，红色荧光Cy3(激发光波长550nm/发射光波长570nm)。

种入不同浓度HepG2细胞(每孔4×10⁵，2×10⁵及1×10⁵个细胞)后，使用荧光显微镜下检测AFP(绿色)及EpCAM阳性(红色)细胞数目。结果如图1所示，加入不同浓度的HepG2细胞后，本试剂盒所检测到的阳性细胞数也呈现出明显的数量梯度。上述结果说明，本试剂盒能够较好地反映样本中的肝癌细胞数量。

实施例2

进一步利用肝癌转移的患者(阳性组)及健康成人(阴性组)的外周血标本，对本试剂盒进行方法学的测试。入选的患者信息：王某，男，54岁，诊断为“原发性肝细胞肝癌伴肺转移”，于2014年4月22日在西安交通大学第一附属医院肝胆外科住院治疗。阴性组为在我院门诊行健康体检的志愿者，作为正常对照。

应用本发明固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒进行诊断：

(一)含循环肿瘤细胞的细胞群初分离：

(1)取4-5ml血液加入含肝素钠或拧檬酸钠的采血管，按抗凝剂：血液样本体积比1∶9使用3.8％枸橼酸钠溶液抗凝；

(2)将含抗凝血的采血管颠倒混匀5次以上避免血液分层，按1∶1-1∶3的比例将抗凝血加入含淋巴细胞分层液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000-3000rpm离心20-30min；

(3)可见外周血单个核细胞(PBMC)存在于云雾状层中，用无菌滴管吸取至新的干净离心管中；

(4)本实验通过CD45负分选的方法，在样本准备阶段过滤掉白细胞以排除白细胞对后续实验的影响(注：CD45在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原)。向上述外周单个核细胞混合液中加入Beads Buffer中重悬，加入human CD45 MicroBeads reagent，轻柔混匀室温孵化45min，使用magnetic separation columns去除CD45+细胞，收集流出的CD45-细胞；

(5)加入400μl预热至37℃的含10×小牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，取10μl细胞悬液加入40pl台酚蓝，取10μl台酚蓝混合细胞液加入血球计数板，在显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量，用预热至37℃的含10×小牛血清的1640培养液稀释细胞悬液至(1-2)×10⁵细胞/ml；

(二)捕获抗体预包被：

(1)96孔板中加入1∶60稀释的AFP及EpCAM抗体(捕获抗体)100μl/孔，加盖37℃孵育1-2h或4℃过夜；

(2)弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，3min/次；

(3)每孔加200μl含牛血清白蛋白的PBS，加盖，37℃孵育1-2h；

(4)弃上清液，将板直接用于检测；或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用；

(三)循环肿瘤细胞检测：

(1)在包被的96孔板中加入：

a.待检测孔：100μl细胞悬液；

b.阴性对照孔：100μl 1640培养液；

c.阳性对照孔：100μl含1×10⁵/ml的肝癌细胞株HepG2；

(2)将96孔板放入湿润的培养箱在37℃、5％CO₂培养18-24小时；

(3)将96孔板取出，弃培养上清液，用含0.1％Tween的PBS洗板4次，3min/次；

(4)每个孔中加入100μl用1％BSA的PBS稀释的荧光素标记AFP及EpCAM检测抗体，置37℃孵育1-2小时；

(5)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100μl用PBS 1∶1000倍稀释的抗-FITC-490及SA-550抗体(二抗)，置37℃孵育2小时；

(6)每孔加入50μl荧光防淬灭剂，放置于室温闭光显色；

(7)弃去荧光淬灭剂，将96孔滤膜板自然晾干。

(四)结果观察：

使用荧光显微镜计数每个反应空孔中红绿荧光斑点，每一个绿色荧光点代表一个分泌AFP的细胞；每一个红色荧光点代表一个分泌EpCAM的细胞。其中，荧光显微镜对于红绿荧光激发光波长分别为：绿色荧光FITC(激发光波长490nm/发射光波长510nm)，红色荧光Cy3(激发光波长550nm/发射光波长570nm)。

结果判定：如果能检测到AFP和EpCAM双阳性的细胞(红绿荧光重合)即判定为阳性；如果检测不到AFP和EpCAM双阳性的细胞则判定为阴性。

结果如图2所示，肝癌伴肺转移患者标本可见视野中有5个AFP与EpCAM双阳性细胞(如箭头所标)，判断为肝癌转移阳性；而健康志愿者标本则检测不到AFP与EpCAM双阳性细胞，判断为阴性。上述结果表明，本试剂盒能够较好地反映肝癌患者的转移情况。

实施例3

分别对50例CTC阳性的肝癌患者(病例组)和50例CTC阴性的肝癌患者(疾病对照组)运用本发明试剂盒(ELISPOT组)进行鉴别诊断，从而初步判断本发明在肝癌诊断中的特异性和敏感性，从而判断其临床意义。其中，所有病例入选前使用目前常用的基于免疫磁珠分离技术的Cell Search试剂盒进行CTC检测，其结果作为本试剂盒的参照标准。

实验方法：

(一)含循环肿瘤细胞的细胞群初分离：

(1)取4-5ml血液加入含肝素钠或拧檬酸钠的采血管，按抗凝剂：血液样本体积比1∶9使用3.8％枸橼酸钠溶液抗凝；

(2)将含抗凝血的采血管颠倒混匀5次以上避免血液分层，按1∶1-1∶3的比例将抗凝血加入含淋巴细胞分层液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000-3000rpm离心20-30min；

(3)可见外周血单个核细胞(PBMC)存在于云雾状层中，用无菌滴管吸取至新的干净离心管中；

(4)本实验通过CD45负分选的方法，在样本准备阶段过滤掉白细胞以排除白细胞对后续实验的影响(注：CD45在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原)。向上述外周单个核细胞混合液中加入Beads Buffer中重悬，加入human CD45 MicroBeads reagent，轻柔混匀室温孵化45min，使用magnetic separation columns去除CD45+细胞，收集流出的CD45-细胞；

(5)加入400μl预热至37℃的含10×小牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，取10μl细胞悬液加入40pl台酚蓝，取10μl台酚蓝混合细胞液加入血球计数板，在显微镜下计数，计数每m1悬液细胞数量，用预热至37℃的含10×小牛血清的1640培养液稀释细胞悬液至(1-2)×10⁵细胞/ml；

(二)捕获抗体预包被：

(1)96孔板中加入1∶60稀释的AFP及EpCAM抗体(捕获抗体)100μl/孔，加盖37℃孵育1-2h或4℃过夜；

(2)弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，3min/次；

(3)每孔加200μl含牛血清白蛋白的PBS，加盖，37℃孵育1-2h；

(4)弃上清液，将板直接用于检测；或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用；

(三)循环肿瘤细胞检测：

(1)在包被的96孔板中加入：

a.待检测孔：100μl细胞悬液；

b.阴性对照孔：100μl1640培养液；

c.阳性对照孔：100μl含1×104/ml的肝癌细胞株HepG2；

(2)将96孔板放入湿润的培养箱在37℃、5％CO₂培养18-24小时；

(3)将96孔板取出，弃培养上清液，用含0.1％Tween的PBS洗板4次，3min/次；

(4)每个孔中加入100μl用1％BSA的PBS稀释的荧光素标记AFP及EpCAM检测抗体，置37℃孵育1-2小时；

(5)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100μl用PBS 1：1000倍稀释的抗-FITC-490及SA-550抗体(二抗)，置37℃孵育2小时；

(6)每孔加入50μl荧光防淬灭剂，放置于室温闭光显色；

(7)弃去荧光淬灭剂，将96孔滤膜板自然晾干。

(四)结果观察：

使用荧光显微镜计数每个反应空孔中红绿荧光斑点，每一个绿色荧光点代表一个分泌AFP的细胞；每一个红色荧光点代表一个分泌EpCAM的细胞。其中，荧光显微镜对于红绿荧光激发光波长分别为：绿色荧光FITC(激发光波长490nm/发射光波长510nm)，红色荧光Cy3(激发光波长550nm/发射光波长570nm)。

结果判定：如果能检测到AFP和EpCAM双阳性的细胞(红绿荧光重合)即判定为阳性；如果检测不到AFP和EpCAM双阳性的细胞则判定为阴性。具体见表1。

表1 ELISPOT试剂盒用于肝癌伴转移患者的鉴别诊断

由表1可知，所有检测结果均可以判断其阴性或阳性结果。其中，本试剂盒能够从50例CTC阳性患者中检测出46例(46/50)；而对于50例CTC阴性患者则全部检测不到(0/50)。初步认为运用本发明对于肝癌诊断的特异性为100％，敏感性为92％。