辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，公开了辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用。在本发明提供的应用中，辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和/或表达NADH选择性氧化酶的基因。导入了辅因子再生模块的重组微生物中次级代谢产物7-脱氢胆甾醇的产量显著提高，说明辅因子再生模块能够增强次级代谢产物在微生物中的合成，为解决合成生物学技术中次级代谢产物产量低下的难题提供了一种新方法。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用。

背景技术

传统意义上，次级代谢产物是指生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。随着合成生物学技术的发展，为了获得特定的天然化合物，科学家通过基因重组技术将天然化合物合成途径中的相关酶基因导入酵母、大肠杆菌或植物等一些常用的模式底盘细胞中，在底盘细胞中重新构建可以生产天然化合物的途径，进而表达天然化合物。在合成生物技术中，天然化合物以次级代谢产物的形式在底盘细胞中进行表达，这扩大了次级代谢产物的含义。

因为次级代谢产物对生物的正常机能是非必需的，甚至是有害的，所以一般情况下次级代谢产物的产量很低。提高次级代谢产物的表达量和积累量成为了制约合成生物学发展的关键技术之一，也是利用生物合成技术生产天然化合物迫切需要解决的问题。目前，提高次级代谢产物表达的方法有很多，例如高产生物体系的选育，培养技术的优化，前体物的添加，诱导剂的使用，抑制剂的使用等。在研发过程中，尽管科学家采用各种方法以求尽可能提高次生代谢产物的表达，但是很多次生代谢产物的产量仍然较低，限制了工业化生产的应用，例如，利用合成生物学生产天然化合物7-脱氢胆甾醇。所以，还需要深入探索、继续研究，以寻求提高次级代谢产物的方法。

目前，还没有关于辅因子再生模块在增强次级代谢产物合成中的应用的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用。本发明发现导入辅因子再生模块的重组微生物中次级代谢产物7-脱氢胆甾醇的产量得到显著提高，说明辅因子再生模块能够增强次级代谢产物在微生物中的合成，为解决合成生物学技术中次级代谢产物产量低下的难题提供了一种新方法。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用，该辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和/或表达NADH选择性氧化酶的基因。

在本发明中表达NADH氧化酶的基因是指该基因的表达产物具有NADH氧化酶的活性，能够催化将分子氧还原为水的反应，同时将NADH氧化为NAD⁺。

在本发明中表达NADH选择性氧化酶的基因是指该基因的表达产物具有NADH选择性氧化酶的活性，能够催化分子氧的还原反应。

在本发明中，表达NADH氧化酶的基因、表达NADH选择性氧化酶的基因中一个或两个为外源基因。在本发明的一些实施例中，表达NADH氧化酶的基因、表达NADH选择性氧化酶的基因均为外源基因。

在本发明中，本发明提供的应用中，所针对的次级代谢产物为内源基因表达产物或外源基因表达产物。在本发明的一些实施例中，所针对的次级代谢产物为外源基因表达产物。

优选地，本发明提供的应用中，所用的NADH选择性氧化酶具体为aox1选择性氧化酶。

在本发明的另外一些实施例中，辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和表达NADH选择性氧化酶的基因。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中，表达NADH氧化酶的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，标记为nox。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中，表达NADH选择性氧化酶的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，标记为aox1。

优选地，本发明提供的应用中，表达NADH氧化酶的基因以基因表达盒的形式存在于所述辅因子再生模块中。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用中，表达NADH氧化酶的基因以基因表达盒的形式存在于所述辅因子再生模块中时，表达NADH氧化酶的基因表达盒包括启动子、表达NADH氧化酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达NADH氧化酶的基因表达盒中的启动子为TPI1。在本发明的另外一些实施例中，表达NADH氧化酶的基因表达盒中的终止子为TEF1。

优选地，本发明提供的应用中，表达NADH选择性氧化酶的基因以基因表达盒的形式存在于所述辅因子再生模块中。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用中，表达NADH选择性氧化酶的基因以基因表达盒的形式存在于所述辅因子再生模块中时，表达NADH选择性氧化酶的基因表达盒包括启动子，表达NADH选择性氧化酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达NADH选择性氧化酶的基因表达盒中的启动子为GPM1。在本发明的另外一些实施例中，表达NADH选择性氧化酶的终止子为TPI1。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中，辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因表达盒和表达aox1选择性氧化酶的基因表达盒；这两个基因表达盒直接相连构成了辅因子再生模块。在本发明的另外一些实施例中，该辅因子再生模块的核苷酸序列信息从5’端到3’端依次为：第一启动子、表达NADH氧化酶的基因、第一终止子、第二启动子、表达aox1选择性氧化酶的基因和第二终止子。

在本发明中的一些实施例中，本发明提供的应用中，所用的辅因子再生模块具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

在本发明中，当所述辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和表达NADH选择性氧化酶的基因时，表达NADH氧化酶的基因和表达NADH选择性氧化酶的基因的排列顺序不固定，不受本发明的限制。

7-脱氢胆甾醇是合成维生素D₃的重要前体，合成7-脱氢胆甾醇是生产维生素D₃的关键步骤。研究报道，利用合成生物学技术是合成7-脱氢胆甾醇最为理想的方式之一。发明人在利用重组微生物制备次级代谢产物7-脱氢胆甾醇时，意外发现发酵液中产生了大量的甘油和乙醇，发明人认为大量的甘油和乙醇的产生势必消耗了大量的碳源，进而影响了次级代谢产物的生成。究其原因，发明人大胆猜想可能是由于细胞内氧化还原不平衡导致了糖酵解过程中NADH超过细胞对它的氧化能力，产生了还原态副产物甘油和乙醇。所以，发明人尝试将辅因子再生模块导入到重组微生物中，实验结果证实，导入了辅因子再生模块的重组微生物在培养过程中甘油和乙醇的产量显著降低了，次级代谢产物7-脱氢胆甾醇的产量得到了大幅提高，差异显著(P＜0.05)，说明辅因子再生模块能够增强次级代谢产物在微生物中的合成，为解决合成生物学技术中次级代谢产物产量低下的难题提供了一种新方法。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用中，所针对的次级代谢产物为7-脱氢胆甾醇。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中，所针对的微生物为真核菌株。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中，所针对的真核菌株具体为酵母菌。在本发明的另外一些实施例中，该酵母菌为酿酒酵母。在本发明的另外一些实施例中，酿酒酵母具体为酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5。

本发明还提供了一种利用辅因子再生模块增强次级代谢产物在微生物中合成的方法，其包括：

获得辅因子再生模块，将所得辅因子再生模块导入所述微生物中，获得含所得辅因子再生模块的重组微生物；

所述辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和/或表达NADH选择性氧化酶的基因。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的利用辅因子再生模块增强次级代谢产物在微生物中合成的方法中，所用的辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和表达NADH选择性氧化酶的基因；

其中，表达NADH氧化酶的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，标记为nox；表达NADH选择性氧化酶的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，标记为aox1。

在本发明的一些实施例中，在本发明提供的利用辅因子再生模块增强次级代谢产物在微生物中合成的方法中，辅因子再生模块导入微生物的方式为整合在游离型的载体上导入微生物中。在本发明的另外一些实施例中，辅因子再生模块导入微生物中所用的游离型的载体具体为pRS416质粒。

在本发明提供的利用辅因子再生模块增强次级代谢产物在微生物中合成的方法中，辅因子再生模块导入微生物中的方式可以为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外；也可以以整合在微生物基因组上的形式导入微生物中，导入方式、导入所采用的技术手段不受本发明的限制。

本发明还提供了一种利用辅因子再生模块增强次级代谢产物7-脱氢胆甾醇在微生物中合成的方法，其包括如下步骤：

步骤1：获得辅因子再生模块、表达固醇C-24还原酶的基因；

步骤2：取所得辅因子再生模块、所得表达固醇C-24还原酶的基因，导入微生物中，得含辅因子再生模板、表达固醇C-24还原酶的基因的重组微生物；

所述辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和/或表达NADH选择性氧化酶的基因。

在本发明中表达固醇C-24还原酶的基因是指该基因的表达产物具有固醇C-24还原酶的活性，能够催化固醇C-24位双键的还原。

本发明还提供了一种高产7-脱氢胆甾醇的重组微生物，其中导入了辅因子再生模块、表达达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因；

该辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和/或表达NADH选择性氧化酶的基因。

在本发明中表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是指该基因的表达产物具有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，能够催化其催化甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径中的中间产物HMG-CoA(hydroxyl-methyl-glutaryl-CoA)生成甲羟戊酸(mevalonate)。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，标记为thmg1。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因以基因表达盒的形式导入所述微生物中。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒包括启动子、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒中的启动子为FBA1。在本发明的另外一些实施例中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒中的终止子为HXT7。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达固醇C-24还原酶的基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，标记为dhcr24。在本发明的另外一些实施例中，表达固醇C-24还原酶的基因以基因表达盒的形式导入所述微生物中。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达固醇C-24还原酶的基因表达盒包括启动子、表达固醇C-24还原酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达固醇C-24还原酶的基因表达盒中的启动子为ENO2。在本发明的另外一些实施例中，表达C-24还原酶的基因表达盒中的终止子为ADH1。

在本发明中，辅因子再生模块的导入方式可以为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外；也可以以整合在微生物基因组上的形式导入微生物中，其导入方式、导入所采用的技术手段不受本发明的限制。

在本发明中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因的导入方式可以为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外；也可以以整合在微生物基因组上的形式导入微生物中，其导入方式、导入所采用的技术手段不受本发明的限制。

在本发明中，表达固醇C-24还原酶的基因的导入方式可以为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外；也可以以整合在微生物基因组上的形式导入微生物中，其导入方式、导入所采用的技术手段不受本发明的限制。

在本发明中，辅因子再生模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因导入微生物中的方式可以相同也可以不同。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒和表达固醇C-24还原酶的基因表达盒以基因功能模块的形式整合在游离型的载体上，之后再导入微生物中。在本发明的另外一些实施例中，含表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒和表达固醇C-24还原酶的基因表达盒的基因功能模块具有如SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列。在本发明的另外一些实施例中，表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因表达盒和表达固醇C-24还原酶的基因表达盒以基因功能模块的形式整合在游离型的载体pRS425质粒上。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，还导入了乙酰辅酶A增强模块；

所述乙酰辅酶A增强模块包括表达乙醇脱氢酶的基因、表达乙醛脱氢酶的基因、表达乙酰辅酶A合酶的基因和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因。

在本发明中乙酰辅酶A增强模块是指该模块的表达产物能够促进细胞质内乙酰辅酶A的合成。乙酰辅酶A是碳代谢和能量代谢的重要中间产物。在微生物中，乙酰辅酶A是甲羟戊酸途径的前体，为次级代谢产物的合成提供了基本骨架。提高细胞质内乙酰辅酶A的供给有利于次级代谢物的生物合成。

在本发明中表达乙醇脱氢酶的基因是指该基因的表达产物具有乙醇脱氢酶的活性，能够催化乙醇转化为乙醛。

在本发明中表达乙醛脱氢酶的基因是指该基因的表达产物具有乙醛脱氢酶的活性，能够催化乙醛转化为乙酸。

在本发明中表达乙酰辅酶A合酶的基因是指该基因的表达产物具有乙酰辅酶A合酶的活性，能够催化乙酸转化为乙酰辅酶A。

在本发明中表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因是指该基因的表达产物具有ATP-柠檬酸裂解酶的活性，能够催化柠檬酸分解为乙酰辅酶A。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醇脱氢酶基因具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，标记为adh2。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醛脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，标记为ald6。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙酰辅酶A合酶的基因具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，标记为acs。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，标记为acl。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醇脱氢酶的基因以基因表达盒的形式导入所述微生物中。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒包括启动子、表达乙醇脱氢酶的基因和终止子。在本发明的一些实施例中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒中的启动子为PGI1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒中的终止子为GPM1。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙醛脱氢酶的基因以基因表达盒的形式导入所述微生物中。在本发明的一些实施例中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒包括启动子、表达表达乙醛脱氢酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒中的启动子为PGK1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙醛脱氢酶的基因表达盒中的终止子为GPD。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达乙酰辅酶A合酶的基因以基因表达盒的形式导入所述微生物中。在本发明的另外一些实施例中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒包括启动子、表达乙酰辅酶A合酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒中的启动子为PDC1。在本发明的另外一些实施例中，表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒中的终止子为FBA1。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因以基因表达盒的形式导入所述微生物中。在本发明的另外一些实施例中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒包括启动子、表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因和终止子。在本发明的另外一些实施例中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒中的启动子为TPI1。在本发明的另外一些实施例中，表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒中的终止子为PGK1。

在本发明中，表达乙醇脱氢酶的基因表达盒、表达乙醛脱氢酶的基因表达盒、表达乙酰辅酶A合酶的基因表达盒和表达ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达盒在乙酰辅酶A增强模块中的排列顺序不固定，不受本发明提供的顺序的限制。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，乙酰辅酶A增强模块具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。

在本发明中，本发明提供的重组微生物中，乙酰辅酶A增强模块的导入方式可以为整合在游离型的载体上导入微生物中，稳定地存在于微生物基因组之外；也可以以整合在微生物基因组上的形式导入微生物中，其导入方式、导入所采用的技术手段不受本发明的限制。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，乙酰辅酶A增强模块的导入方式为整合在游离型的载体上导入微生物中。在本发明的另外一些实施例中，乙酰辅酶A增强模块的导入方式为整合在pRS413质粒上。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用的微生物为真核菌株。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用的真核菌株为酵母菌。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中，所用的酵母菌具体为酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物具体为保藏编号为CGMCC No.10502的菌株。

本发明还提供了一种利用本发明提供的重组微生物生产7-脱氢胆甾醇的方法，该重组微生物为在微生物中导入了辅因子再生模块、表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因和表达固醇C-24还原酶的基因；所述辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和/或表达NADH选择性氧化酶的基因；

该方法包括：

接种所述重组微生物，经发酵后，分离、收集7-脱氢胆甾醇。

本发明提供了一种辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用。本发明提供的应用中，辅因子再生模块包括表达NADH氧化酶的基因和/或表达NADH选择性氧化酶的基因。实验结果证实，将辅因子再生模块导入微生物中后，显著提高了次级代谢产物7-脱氢胆甾醇的产量，差异显著(P＜0.05)，说明辅因子再生模块能够增强次级代谢产物在微生物中的合成，为解决合成生物学技术中次级代谢产物产量低下的难题提供了一种新方法。本发明提供的产7-脱氢胆甾醇的重组微生物的7-脱氢胆甾醇的产量高，更适合7-脱氢胆甾醇的合成，为7-脱氢胆甾醇的工业化大生产提供了新的方法。

附图说明

图1示实施例1中各个质粒的构建图谱；

其中，图1-A示pSW01质粒的构建图谱；图1-B示pSW02质粒的构建图谱；图1-C示pSW03质粒的构建图谱；

图2示实施例1中构建的三个重组质粒pSW01、pSW02和pSW03的酶切验证结果；

其中，图2-A示pSW01的验证结果，左边图示为插入的片段的大小，右边图示酶切结果；图2-B的验证结果，左边图示为插入的片段的大小，右边图示酶切结果；图2-C示pSW03的验证结果，左边图示为插入的片段的大小，右边图示酶切结果质粒的构建图谱；

图3示实施例2中由测定7-脱氢胆甾醇标准品所得的标准曲线；

图4示实施例2中各个菌株的生长曲线；

其中，◆为曲线1，代表ΔERG5的生长曲线；为曲线2，代表SyBE_Sc01100002的生长曲线；为曲线3，代表SyBE_Sc01100011的生长曲线；为曲线4，代表SyBE_Sc01100020的生长曲线；

图5示实施例2中各个菌株的发酵产物的GC-MS检测结果：

其中，5-A为SyBE_Sc01100002的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.83min的峰为7-脱氢胆甾醇；

5-B为SyBE_Sc01100002的7-脱氢胆甾醇的质谱谱图；

5-C为SyBE_Sc01100011的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.81min的峰为7-脱氢胆甾醇；

5-D为SyBE_Sc01100011的7-脱氢胆甾醇的质谱谱图；

5-E为SyBE_Sc01100020的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.82min的峰为7-脱氢胆甾醇；

5-F为SyBE_Sc01100020的7-脱氢胆甾醇的质谱谱图；

图6示实施例3中重组菌株的发酵产物的质谱谱图；

图7示实施例3中重组菌株的发酵产物的GC谱图；

图8示实施例3中重组菌株各个检测指标的检测结果；其中曲线1为重组菌株生长曲线；曲线2为发酵过程中发酵液中葡萄糖的含量；曲线3为L-脱氢胆甾醇的产量。

生物保藏说明

重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc01100011：分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2015年02月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.10501。

重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc01100020：分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2015年02月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.10502。

具体实施方式

本发明公开了辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用。本领域技术人员可以参考本文内容，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的辅因子再生模块在增强次级代谢产物在微生物中合成的应用中的试剂和原料均可由市场购得。

为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1生产7-脱氢胆甾醇的重组酿酒酵母菌株的构建与7-脱氢胆甾醇产量的对比

材料来源：

pRS425质粒：购买于Addgene(American)；

pRS413质粒：购买于Addgene(American)；

pRS416质粒：购买于Addgene(American)；

酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0erg5Δ::KanMX)：购买于Thermo Fisher Scientific。

启动子、终止子和内源、外源基因的获得

所有启动子(FBA1p,ENO2p,PGI1p,PGK1p,PDC1p,TPI1p,GPM1p)、终止子(HXT7t,ADH1t,GPM1t,GPDt,FBA1t,PGK1t,TEF1t,TPI1t)和内源基因(乙醇脱氢酶基因adh2,乙醛脱氢酶基因ald6,截短HMG-CoA还原酶基因thmg1)：设计合适的带有启动子、终止子或基因同源序列的引物，以酿酒酵母BY4742基因组为模板，通过PCR反应扩增得到。

外源基因为人工合成：Salmonella enterica源的乙酰辅酶A合酶突变体基因acs^L641P和鼠源的ATP-柠檬酸裂解酶基因acl经过密码子优化并适当规避常用的限制性酶切位点后通过人工合成得到，在本实施例中将acs^L641P基因标记为acs。外源基因人源C-24还原酶基因dhcr24、Streptococcus pneumoniae源的NADH氧化酶基因nox和Histoplasmacapsulatum源的选择性氧化酶基因aox1的核苷酸序列信息如表1所示。

表1各个基因所对应的核苷酸序列信息

基因名称核苷酸序列信息NADH氧化酶基因nox具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列选择性氧化酶基因aox1具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列截短HMG-CoA还原酶基因thmg1具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列人源C-24还原酶基因dhcr24具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列乙醇脱氢酶基因adh2具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列乙醛脱氢酶基因ald6具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列乙酰辅酶A合酶基因acs^L641P具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列ATP-柠檬酸裂解酶基因acl具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列

单基因表达盒的构建与多基因模块的组装

将启动子FBA1p，基因thmg1和终止子HXT7t通过OE-PCR方法拼接起来，得基因片段FBA1p-thmg1-HXT7t；将启动子ENO2p，基因dhcr24和终止子ADH1t通过OE-PCR方法拼接起来，得基因片段ENO2p-dhcr24-ADH1t。用限制性内切酶EcoRI和BamHI将酿酒酵母多拷贝质粒pRS425线性化。通过PCR为基因片段FBA1p-thmg1-HXT7t添加同源区，上游有40bp与pRS425同源，下游有40bp与ENO2p同源。通过PCR为基因片段ENO2p-dhcr24-ADH1t添加同源区，上游有40bp与HXT7t同源，下游有40bp与pRS425同源。用醋酸锂法将添加同源区后的两个基因片段与线性化的质粒pRS425进行酵母转化，利用酵母自身的同源重组原理将上述片段通过片段间的同源序列连接起来，转化后酵母采用SD-drop固体培养基(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L，固体补加2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯后转移至液体培养基中培养24h，提取酵母质粒作为模板，进行PCR和酶切验证。初步筛选正确的重组酵母质粒回转大肠杆菌，提质粒，进行测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。

按照相同的方法分别构建了三个质粒，各个质粒的构建图谱如图1所示。将所得重组质粒分别标记为pSW01、pSW02和pSW03；各个重组质粒酶切验证结果见图2。各个重组质粒所带有的核苷酸序列信息如下所示：

pSW01:FBA1p-thmg1-HXT7t-ENO2p-dhcr24-ADH1t-pRS425

pSW02:PGI1p-adh2-GPM1t-PGK1p-ald6-GPDt-PDC1p-acs-FBA1t-TPI1p-acl-PGK1t-pRS413

pSW03:TPI1p-nox-TEF1t-GPM1p-aox1-TPI1t-pRS416

各个重组质粒中所整合的基因模块的核苷酸序列信息见表2。

表2各个基因模块所对应的核苷酸序列信息

含有不同质粒的重组酵母菌株的获得

用醋酸锂法将不同的质粒分别导入酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0erg5Δ::KanMX)中，得到如下菌株：

将质粒pSW01导入酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5中得重组子，命名为SyBE_Sc01100002。将质粒pSW01和质粒pSW02导入酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5中得重组子，命名为SyBE_Sc01100011。将质粒pSW01、质粒pSW02和质粒pSW03导入酿酒酵母BY4742单基因缺失株ΔERG5中得重组子，命名为SyBE_Sc01100020。采用提取酵母质粒，对质粒上所含全部基因进行PCR的方法验证重组菌株的正确性，检测结果正确。

本实施例成功获得了如下菌株：

SyBE_Sc01100002：含有pSW01质粒的ΔERG5；

SyBE_Sc01100011：含有pSW01和pSW02质粒的ΔERG5；

SyBE_Sc01100020：含有pSW01，pSW02和pSW03质粒的ΔERG5。

实施例2各个重组菌株产7-脱氢胆甾醇性能的研究

在摇瓶上比较实施例制备获得的重组菌株SyBE_Sc01100002，SyBE_Sc01100011和SyBE_Sc01100020的发酵性能

1、试验材料：

实施例1制备获得的菌株SyBE_Sc01100002，SyBE_Sc01100011和SyBE_Sc01100020。

2、试验方法：

种子培养基：培养SyBE_Sc01100020的种子培养基配方为合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L(具体配方参考[美]D.C.安伯格等酵母遗传学方法试验指南)，色氨酸20mg/L。培养SyBE_Sc01100011的种子培养基配方在培养SyBE_Sc01100020的种子培养基配方的基础上再添加20mg/L尿嘧啶。培养SyBE_Sc01100002的种子培养基配方在培养SyBE_Sc01100020的种子培养基配方的基础上再添加20mg/L组氨酸和20mg/L尿嘧啶。115℃灭菌15min。

发酵培养基A：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，121℃灭菌20min。

将上述重组菌株分别接种于4mL对应的种子培养基中，在30℃、220rpm培养24h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2转接于新鲜的50mL种子培养基中，于30℃、220rpm条件下培养12h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于50mL发酵培养基A中，于30℃、220rpm条件下培养36h，测定菌体生长曲线。用50mL离心管收集发酵液，5000rpm离心2min获得细胞，用蒸馏水清洗细胞后用液氮冷冻并研磨细胞。向研磨后的细胞中加入4mL 1.5M的KOH-甲醇溶液，80℃皂化90min。加入2mL正己烷，涡旋混合10min，5000rpm离心2min，将上清转移至10mL离心管中，冷冻干燥30min。加入400μL正己烷，过夜冻干。加入200μLN-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)，30℃衍生化1h。

3、分析方法：

以722型分光光度计在600nm处测定的菌体吸光值(OD₆₀₀)表征菌体浓度。对发酵液中的葡萄糖、甘油和乙醇用HPLC进行分析：柱子为Aminex HPX-87H离子交换柱，检测器为Waters 2414示差检测器，柱温65℃，流动相为5mM硫酸，流速为0.5mL/min。

对提取的产物进行气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF/MS)分析检测。

分析条件如下：仪器为Waters公司的GC-TOF/MS(Waters Corp.，USA)；硅胶毛细管柱为30m长×0.25mm内径×0.25μm膜厚DB-5MS，J&W Scientific，Folsom。电离方式为电子轰击电离EI⁺，电子束能量70eV，离子化电流40μA。质谱扫描范围在50～800m/z，离子源温度为250℃，进样口温度为260℃，氦气(99.9995％)用作载气，91KPa恒压模式下操作。柱温在70℃保持2min，以30℃/min的速度升至250℃，然后以10℃/min的速度升到280℃，在280℃维持15min；再以5℃/min的速度升到290℃，在290℃维持5min。

通过与7-脱氢胆甾醇标准品测定的标准曲线拟合出的公式计算产量，标准曲线见图3，拟合方程为y＝16.165x-105.34，R²＝0.9989。

4、试验结果：

各个菌株的生长曲线见图4，其中，◆为曲线1，代表ΔERG5的生长曲线；为曲线2，代表SyBE_Sc01100002的生长曲线；为曲线3，代表SyBE_Sc01100011的生长曲线；为曲线4，代表SyBE_Sc01100020的生长曲线。从生长曲线可知，菌株ΔERG5，SyBE_Sc01100002，SyBE_Sc01100011和SyBE_Sc01100020在发酵培养基A中生长趋势一致，生长状况无明显差别，36h发酵结束时菌体最终OD₆₀₀达到10左右。

各个菌株的发酵产物的GC-MS检测结果见图5；其中，图5-A为SyBE_Sc01100002的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.83min的峰为7-脱氢胆甾醇；该组分的质谱谱图为图5-B。图5-C为SyBE_Sc01100011的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.81min的峰为7-脱氢胆甾醇；该组分的质谱谱图为图5-D。图5-E为SyBE_Sc01100020的产物分析GC谱图，其中保留时间为20.82min的峰为7-脱氢胆甾醇；该组分的质谱谱图为图5-F。各个菌株的7-脱氢胆甾醇的产量见表3。

表3各个菌株的7-脱氢胆甾醇的产量

菌株名称7-脱氢胆甾醇的产量(mg/L)ΔERG5--SyBE_Sc011000022.61SyBE_Sc011000114.84SyBE_Sc011000208.44

分别在对数中期(8h)和平台初期(16h)测量重组菌株中乙酰辅酶A的含量(使用BioVision公司的PicoProbe Acetyl-CoA定量试剂盒测定)。重组菌株在不同时期的乙酰辅酶A的含量见表4。

表4不同时期的重组菌株的乙酰辅酶A的生成量

在24h测定所有菌株中NADH/NAD⁺的比值(使用ATT Bioquest公司的AmpliteNADH/NAD⁺比例荧光试剂盒测定)和发酵液中的甘油、乙醇含量。检测结果见表5。

表5发酵24h时所有菌株中各个指标的检测结果

由表3、表4和表5可知，相比SyBE_Sc01100002，SyBE_Sc01100011和SyBE_Sc01100020的7-脱氢胆甾醇的产量都有显著的提高，差异显著(P＜0.05)。对比SyBE_Sc01100002和SyBE_Sc01100011可知，在导入乙酰辅酶A增强模块之后，重组菌株SyBE_Sc01100011中乙酰辅酶A的合成量显著提高(P＜0.05)，7-脱氢胆甾醇的产量提高了85.4％，说明提高乙酰辅酶A的合成有利于7-脱氢胆甾醇前体的供应，促使碳代谢流向目标产物。相比SyBE_Sc01100002、SyBE_Sc01100011，SyBE_Sc01100020中胞内NADH/NAD⁺的比值分别下降了8.9％、79.5％；由氧化还原不平衡引起的副产物甘油积累量分别下降了64.6％、50.7％；乙醇的积累量分别下降了7.3％和7.9％，说明辅因子再生模块能够缓解敲除erg5基因引起的氧化还原不平衡，并最终使7-脱氢胆甾醇的产量得到显著提高，分别提高了223.3％和74.4％。

将重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc01100011和重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc01100020进行生物保藏，两个菌株的生物保藏信息如下：

重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc01100011：分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2015年02月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.10501。

重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc01100020：分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2015年02月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.10502。

实施例3发酵罐条件下SyBE_Sc01100020菌株的发酵性能研究

流加补料发酵罐条件下SyBE_Sc01100020菌株的发酵性能

1、试验材料：菌株SyBE_Sc01100020。

2、试验方法：

种子培养基：培养SyBE_Sc01100020的种子培养基配方为合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L(具体配方参考[美]D.C.安伯格等酵母遗传学方法试验指南)，色氨酸20mg/L。

发酵培养基B：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L；其中，葡萄糖与酵母粉和蛋白胨分开灭菌，葡萄糖115℃灭菌15min，酵母粉和蛋白胨121℃灭菌20min。

补料用葡萄糖溶液：500g/L，115℃灭菌15min。

将SyBE_Sc01100020菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养24h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2转接于新鲜的300mL种子培养基中，于30℃、220rpm条件下培养12h后全部接种于2.5L发酵培养基B(5L发酵罐)中。培养条件为300rpm，30℃，pH5.5，溶氧>30％，通气量1.5vvm，培养72h。做批式补葡萄糖培养，维持葡萄糖浓度低于2g/L。测定菌体生长曲线。在菌株生长进入稳定期后，分别于36h，48h，60h和72h取30mL发酵液，离心收集细胞，处理方式同实施例2。

3、分析方法：

同实施例2。

4、试验结果：

试验结果见图6、图7和图8；图6为发酵产物的质谱谱图，图7为发酵产物的GC谱图，说明所得发酵产物为7-脱氢胆甾醇。图8为各个检测指标的检测结果，从中可知发酵罐发酵时菌株SyBE_Sc01100020在批式补料发酵条件下显示出较好的生长趋势；在发酵24h左右后菌体生长到达稳定期，稳定期菌体OD₆₀₀达到28左右。结合葡萄糖浓度变化趋势和7-脱氢胆甾醇产量变化曲线来看，在24h之后，菌体生长几乎不发生变化，葡萄糖主要用于合成次级代谢产物7-脱氢胆甾醇；36h至72h，7-脱氢胆甾醇产量呈现上升后下降的趋势，最高产量为48h时的44.49mg/L，该产量为目前已知的最高产量。

上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。