用于实时荧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物组及监测方法

摘要

本发明涉及用于荧光定量PCR监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物，所述引物序列为MT-Q-S:TCCAGGTGGTGCGGAGGAGACT和MT-Q-A:CCCACGACCTTTTTCGGATTGC。该技术具有以下优点：1、实现真正预警预报；2、特异性强；3、灵敏度高；4、操作简单、迅速，具有很强的推广性；5、费用较低。

说明书

技术领域的

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种用于实时荧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细 胞爆发性生长的引物组及监测方法。

背景技术

赤潮作为一种生态现象，由于对环境、水产养殖业、渔业、旅游业和人类健康的严重影响而受到 广泛重视，赤潮已成为全球环境问题热点之一。近十几年来，由于海洋污染日益加剧，我国赤潮灾害 也有加重的趋势，由分散的少数海域，发展到成片海域，一些重要的养殖基地受害尤重。

2000年我国海域共记录到赤潮28起，比1999年增加了13起，累计面积1万多平方公里。其中， 东海发现11起，累计面积达7800多平方公里；渤海发现7起，累计面积近2000平方公里，黄海发 现4起，累计面积800多平方公里；南海发现6起，但累计面积不到50平方公里。

2003年，全海域共发生100平方公里以上的赤潮27次。其中，500平方公里以上的赤潮8次， 东海赤潮发生次数和累计面积分别约占全海域的72％和89％。

2006年，全海域赤潮发生次数较上年增加，全年共发现赤潮93次，较2005年增加约13％；赤 潮累计发生面积约19840平方公里，较2005年减少约27％。其中，在赤潮监控区内发现赤潮46次， 累计面积约11590平方公里，分别约占全海域赤潮累计发生次数和面积的49％和58％。全海域共发 生100平方公里以上的赤潮31次，累计面积18540平方公里，分别占赤潮发生次数和累计面积的33％ 和93％；其中，面积超过1000平方公里的赤潮为7次，较上年减少2次，累计面积减少51％。赤潮 高发区集中在东海海域，赤潮发生次数和累计发生面积分别占全海域的68％和76％。

为将赤潮危害降至最低，赤潮的监测预报必不可少，除了海洋物理学耗资巨大的卫星遥感与飞行 监测，生物学的监测方法主要有依赖形态学检测的光学显微镜观察和图像识别系统、免疫学及核酸、 lectin探针检测技术等。这些方法主要是通过赤潮藻细胞数目的增减判断赤潮爆发的可能性，而一旦 细胞达到一定的数目，赤潮已经发生，即实际上达不到预报的目的，真正的预报应可以“推测”赤潮未 来发生的可能性。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于实时荧光定量PCR方法监测链状亚 历山大藻细胞爆发性生长的引物组及监测方法。

本发明的技术方案是：

一种用于实时荧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的引物，所述引物的序列如 MT-Q-S和MT-Q-A所示。

一种使用实时荧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的方法，使用荧光定量PCR 分析mt基因差异表达，以cob和18SRNA为内参基因，以双内参基因的Ct值来校准目的基因mt相 对表达量，采用2^-△△CT法进行数据的分析，ΔΔCT＝(CT_mt-CT_内参基因)实验-(CT_mt-CT_内参基因)对照；当2 ^-△△CT≧2时，链状亚历山大藻细胞将进入爆发性生长状态；当2^-△△CT﹤2时，链状亚历山大藻细胞 未进入爆发性生长状态。

所述内参基因为：cob和18SRNA。

所述内参基因的引物为：

cob-S：TTTTCTTCAAACTCATTTCGGGAT；

cob-A：TGGGCACAGCTTTTAACATAGCATA；

18S rRNA-S：GGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGA；

18S rRNA-A：CAAATCACTCCACCAACTAAGAACGG。

一种使用实时荧光定量PCR方法监测链状亚历山大藻细胞爆发性生长的方法，具体步骤如下：

(1)采用滤膜过滤法从目标海域收集链状亚历山大藻10³～10⁶个，将收集的藻细胞置于3L三角 瓶的2L海水中，遮光布黑暗48小时进行同步化处理，每隔2小时晃动一次，然后进行实验室培养， 培养温度为20±1℃，光照强度3000lx，光暗周期12h光照/12h黑暗，培养基为检测海域过滤消毒 海水，培养至第二天为生长周期的延迟期，作为对照组；实验组为继续在海域中生长的藻细胞；采用 滤膜过滤法分别从对照组和实验组收集藻细胞，分别作为对照组和实验组，进行实验测定。

(2)RNA提取；

(3)反转录合成的cDNA：

(4)qPCR：

利用对照组与实验组的反转录cDNA，进行qPCR反应；

qPCR反应体系如下：

荧光实时定量PCR的反应条件如下：

第一步，50℃，2min；

第二步，95℃，2min；

第三步，95℃，15sec；60℃，1min；40个循环；

第四步，做熔解曲线：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；60℃，15sec；

荧光信号的采集设置在第三步后；收集每个重复的mt基因Ct值，内参基因的Ct值，两个内参 基因Ct值取几何平均值；

(5)基因相对表达量分析

采用2^-ΔΔCT的相对定量方法对基因的相对表达量进行分析；ΔΔCT＝(CT_mt-CT_内参基因)实验-(CT_mt- CT_内参基因)对照；

2^-ΔΔCT≧2，链状亚历山大藻细胞将进入爆发性生长状态；

当2^-△△CT﹤2时，链状亚历山大藻细胞未进入爆发性生长状态。

本发明的优势在于：1、灵敏度高、特异性和可靠性强。在藻细胞生长的对数期即能够完成检测， 可在链状亚历山大藻细胞富集量最大之前采取措施，减少危害，实现对赤潮真正的预警预报。2、自 动化程度高，无污染。整个实验过程在实验室进行，没有外排污染物。3、具有实时和准确的特点。 能够从分子水平检测链状亚历山大藻细胞的生长阶段，以小见大，从最大程度上减少了赤潮预测的误 差性。4、费用较低。实验过程是基于ABI7500荧光定量PCR仪，没有露天大规模设施，降低了实验 经费。5、实验操作简单，具有可推广性。

具体实施方式

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件来进行操作。

mt基因在我们检测的所有爆发性生长条件下均表现表达量升高，表明其与细胞生长的相关性和 一致性。cob和18S rRNA是广泛用于荧光定量PCR的内参基因，并且同时使用两个内参基因在一定 程度上消除了由于内参基因不稳定所造成的误差。

使用Primer 5.0对引物进行设计，引物设计遵守以下原则：引物设计原则：产物长度75bp-200bp, 避免二级结构，GC含量45％-55％，引物长度20-25bp,Tm值在58-62℃。引物由北京六合华大基因科 技股份有限公司进行合成。

实施例1

(1)实验材料的培养与收集：

将生长在中氮中磷培养基中的链状亚历山大藻藻细胞在黑暗条件下进行同步化处理48小时，然 后将藻细胞接种到2L新的特定的四种浓度的f/2培养基中(表1)进行培养，初始浓度为2000cells/mL。 光照强度3000lx，培养温度20±1℃，光暗周期为12h光照/12h黑暗。采用滤膜过滤法分别从对照 组和实验组收集藻细胞10³～10⁶个，分别作为对照组和实验组，进行实验测定。对照组为中氮中磷条 件下生长至第二天的藻细胞，实验组为中氮中磷，高氮高磷，高氮和高磷条件下生长至第12天藻细 胞。四种培养基浓度见表1，除所示成分浓度外，其它与f/2培养基浓度一致。

表1 四种培养基浓度

(2)RNA的提取

用Trizol(TaKaRa)手提法对对照组和实验组藻细胞的总RNA进行提取，操作依据说明书的指示 进行：

1)取出于-液氮保存的藻样，放入预冷的研钵中迅速用液氮研磨至粉状，然后放入提前加入1ml Trizol 的EP管中，震荡，于室温静置5min；

2)用预冷的离心机离心5min(4℃，12000g)；

3)小心吸取上清液，移至新的1.5mL的EP管中，立即后加入1/5体积(约200ul)的氯仿，涡旋振 荡15s，室温静置5min；

4)离心15min(同1))，液体氛围三层，将上层的水层转移到新的1.5mL的EP管中，加入月400ul 的异丙醇，混匀后于室温静置10min；

5)离心10min(同1)后出现沉淀，弃去上清，加入75％的无水乙醇(约1ml)，洗脱沉淀，室温静 置5min后，离心

6)重复5)，吸去上清，留沉淀，使其于超净台中干燥约10min；

7)利用20-30μl DEPC水溶解沉淀；

(3)反转录：

取2μL RNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，观察有无降解；另各取1μL RNA 溶液，以DEPC水做空白对照，使用NanoDrop 2000对RNA样品浓度和质量检测。反转录反应使用 Takara的RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒，按照以下程序进行：

基因组DNA的去除。

42℃保温2min，立即置于冰上。

反转录反应

配制反应液的过程在冰上进行。加入以下各种成分。

反应步骤：37℃，15min；85℃，5sec；立即置于冰上。

合成的cDNA置于-20℃保存。

(4)qPCR实验：

对照组与实验组的反转录cDNA，每个重复利用设计好的引物(如下表2)进行qPCR反应。

表2：目的基因和内参基因的引物序列

qPCR反应使用罗氏的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒，在ABI 7500荧光定量机器上 进行。qPCR反应体系如下：

荧光实时定量PCR的反应条件如下：

第一步，50℃，2min；

第二步，95℃，2min；

第三步，95℃，15sec；60℃，1min；40个循环；

第四步，做熔解曲线：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；60℃，15sec。

荧光信号的采集设置在第三步后。收集每个重复的Ct值。

(5)藻细胞生长速度与基因相对表达量之间的关系

mt基因的相对表达量分析采用2^-ΔΔCT的相对定量方法。对照组ΔΔCT的计算方法为：ΔΔCT＝(CTmt -CT_内参基因)对照组-(CTmt-CT_内参基因)对照组，所以对照组的ΔΔCT＝0，即2^-ΔΔCT＝1。实验组ΔΔCT的计 算方法为：ΔΔCT＝(CTmt-CT_内参基因)实验组-(CTmt-CT_内参基因)对照组；当实验组的2^-ΔΔCT>2时，表明 mt基因表达极显著增加。mt基因相对表达量计算过程及结果如下表3所示。

表3 mt基因和双内参基因的相对表达量

经计算，实验组的2^-ΔΔCT为分别为14.4，32.89，32，24.25，均大于2，说明mt基因表达量极显 著性增加。在检测之后第4天藻细胞数量急剧增长，进入平台期。

实施例2

(1)实验材料的培养与收集：

2013.09.15从青岛胶州湾海域收集链状亚历山大藻，进行对照组、实验组和模拟组处理。将收集 的10³～10⁶个藻细胞置于3L三角瓶2L海水中，用遮光布黑暗48小时进行同步化处理，每隔2小时晃 动一次，然后进行实验室培养，光照强度3000lx,，温度20±1℃，光暗周期为12h光照/12h黑暗， 培养基为胶州湾海域过滤消毒海水，培养至第二天为生长周期的延迟期，作为对照组；模拟组：将收 集于胶州湾海域的10³～10⁶链状亚历山大藻细胞接种于高磷(氮浓度为768μM/L，磷浓度为144μM/L) f/2培养基中，光照强度3000lx,，温度20℃，光暗周期为12h光照/12h黑暗，进行培养，至第7天 进入对数期，作为模拟组；实验组：为继续在海域中生长的藻细胞，取样日期与模拟组一致。

采用滤膜过滤法分别从对照组、模拟组和检测海域收集藻细胞10³～10⁶个，分别作为对照组和实 验组，进行实验测定。

(2)RNA的提取

用Trizol(TaKaRa)手提法对对照组和实验组藻细胞的总RNA进行提取，操作依据说明书的指示 进行：

1)取出于-液氮保存的藻样，放入预冷的研钵中迅速用液氮研磨至粉状，然后放入提前加入1ml Trizol 的EP管中，震荡，于室温静置5min；

2)用预冷的离心机离心5min(4℃，12000g)；

3)小心吸取上清液，移至新的1.5mL的EP管中，立即后加入1/5体积(约200ul)的氯仿，涡旋振 荡15s，室温静置5min；

4)离心15min(同1))，液体氛围三层，将上层的水层转移到新的1.5mL的EP管中，加入月400ul 的异丙醇，混匀后于室温静置10min；

5)离心10min(同1)后出现沉淀，弃去上清，加入75％的无水乙醇(约1ml)，洗脱沉淀，室温静 置5min后，离心

6)重复5)，吸去上清，留沉淀，使其于超净台中干燥约10min；

7)利用20-30μl DEPC水溶解沉淀；

(3)反转录：

取2μL RNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，观察有无降解；另各取1μL RNA 溶液，以DEPC水做空白对照，使用NanoDrop 2000对RNA样品浓度和质量检测。反转录反应使用 Takara的RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒，按照以下程序进行：

基因组DNA的去除。

42℃保温2min，立即置于冰上。

反转录反应

配制反应液的过程在冰上进行。加入以下各种成分。

反应步骤：37℃，15min；85℃，5sec；立即置于冰上。

合成的cDNA置于-20℃保存。

(4)qPCR实验：

对照组与实验组的反转录cDNA，每个重复利用设计好的引物(如表2)进行qPCR反应。 qPCR反应使用罗氏的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒，在ABI 7500荧光定量机器上 进行。qPCR反应体系如下：

荧光实时定量PCR的反应条件如下：

第一步，50℃，2min；

第二步，95℃，2min；

第三步，95℃，15sec；60℃，1min；40个循环；

第四步，做熔解曲线：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；60℃，15sec。

荧光信号的采集设置在第三步后。收集每个重复的Ct值。

(5)藻细胞生长速度与基因相对表达量之间的关系

mt基因的相对表达量分析采用2^-ΔΔCT的相对定量方法。对照组ΔΔCT的计算方法为：ΔΔCT＝(CTmt -CT_内参基因)对照组-(CTmt-CT_内参基因)对照组，所以对照组的ΔΔCT＝0，即2^-ΔΔCT＝1。实验组ΔΔCT的计 算方法为：ΔΔCT＝(CTmt-CT_内参基因)实验组-(CTmt-CT_内参基因)对照组；当实验组的2^-ΔΔCT>2时，表明 mt基因表达极显著增加。mt基因相对表达量计算过程及结果如下表4所示。

表4 mt基因和双内参基因的相对表达量

mt基因在模拟组2^-ΔΔCT为2.694，在模拟组接种后做出检测的第7天，藻细胞数量急剧增加，生 长进入平台期，而实验组2^-ΔΔCT为1.14，此海域在做出检测20天后，赤潮没有爆发。

实施例3

(1)实验材料的培养与收集：

2013.05.12从青岛胶州湾海域收集链状亚历山大藻，进行对照组和实验组处理。对照组：将收集 的10³～10⁶个藻细胞置于3L三角瓶2L海水中，用遮光布黑暗48小时进行同步化处理，每隔2小时晃 动一次，然后进行实验室培养，光照强度3000lx,，温度20±1℃，光暗周期为12h光照/12h黑暗， 培养基为胶州湾海域过滤消毒海水，培养至第二天为生长周期的延迟期，作为对照组；实验组：为继 续在海域中生长的藻细胞，取样日期比对照组取样时间点晚7天。

采用滤膜过滤法分别从对照组和检测海域收集藻细胞10³～10⁶个，分别作为对照组和实验组，进 行实验测定。

(2)RNA的提取

用Trizol(TaKaRa)手提法对对照组和实验组藻细胞的总RNA进行提取，操作依据说明书的指示 进行：

8)取出于-液氮保存的藻样，放入预冷的研钵中迅速用液氮研磨至粉状，然后放入提前加入1ml Trizol 的EP管中，震荡，于室温静置5min；

9)用预冷的离心机离心5min(4℃，12000g)；

10)小心吸取上清液，移至新的1.5mL的EP管中，立即后加入1/5体积(约200ul)的氯仿，涡旋振 荡15s，室温静置5min；

11)离心15min(同1))，液体氛围三层，将上层的水层转移到新的1.5mL的EP管中，加入月400ul 的异丙醇，混匀后于室温静置10min；

12)离心10min(同1)后出现沉淀，弃去上清，加入75％的无水乙醇(约1ml)，洗脱沉淀，室温静 置5min后，离心

13)重复5)，吸去上清，留沉淀，使其于超净台中干燥约10min；

14)利用20-30μl DEPC水溶解沉淀；

(3)反转录：

取2μL RNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，观察有无降解；另各取1μL RNA 溶液，以DEPC水做空白对照，使用NanoDrop 2000对RNA样品浓度和质量检测。反转录反应使用 Takara的RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒，按照以下程序进行：

基因组DNA的去除。

42℃保温2min，立即置于冰上。

反转录反应

配制反应液的过程在冰上进行。按以下表格体积加入各种成分。

反应步骤：37℃，15min；85℃，5sec；立即置于冰上。

合成的cDNA置于-20℃保存。

(4)qPCR实验：

对照组与实验组的反转录cDNA，每个重复利用设计好的引物(如表2)进行qPCR反应。 qPCR反应使用罗氏的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒，在ABI 7500荧光定量机器上 进行。qPCR反应体系如下：

荧光实时定量PCR的反应条件如下：

第一步，50℃，2min；

第二步，95℃，2min；

第三步，95℃，15sec；60℃，1min；40个循环；

第四步，做熔解曲线：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；60℃，15sec。

荧光信号的采集设置在第三步后。收集每个重复的Ct值。

(5)藻细胞生长速度与基因相对表达量之间的关系

mt基因的相对表达量分析采用2^-ΔΔCT的相对定量方法。对照组ΔΔCT的计算方法为：ΔΔCT＝(CT_mt-CT_内参基因)对照组-(CT_mt-CT_内参基因)对照组，所以对照组的ΔΔCT＝0，即2^-ΔΔCT＝1。实验组ΔΔCT的计 算方法为：ΔΔCT＝(CT_mt-CT_内参基因)实验组-(CT_mt-CT_内参基因)对照组；当实验组的2^-ΔΔCT>2时，表明 mt基因表达极显著增加。mt基因相对表达量计算过程及结果如下表5所示。

表5 mt基因和双内参基因的相对表达量

mt基因在实验组2^-ΔΔCT为1.19，在该检测取样点之后20天，赤潮没有爆发。