基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器及其制备方法和应用，所述生物传感器包括DNA折纸和纳米金，所述DNA折纸包含被检测物的适配体核苷酸序列，所述纳米金为经过与适配体核苷酸序列互补的DNA片段修饰过的纳米金。该方法有如下优点：DNA折纸具有精确的空间可寻址性，加入纳米金后避免了繁琐的标记步骤；适配体可通过化学方法批量合成，大大降低了成本；克服了小分子物质自身免疫性差的缺点；具有较低的检测限，LOD达到纳克级；借助原子力显微镜和电泳进行表征，利用纳米金在原子力显微镜高度图中高亮的特点进行定量和定性分析，与传统研究手段相比，具有简便、可靠、较低的实验条件要求等优势。

说明书

技术领域

本发明属于检测分析领域，具体涉及一种基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金 的生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

2006年Rothemund报道了一种极具创新的自下而上的自组装方法：将一条长的脚手架链 与200多条订书钉链通过碱基互补组装成二维图形，称为DNA折纸术。其反应过程简单、 响应快速且具有较高产率等突出优点，将DNA纳米技术的发展又推向新的高峰，现已广泛 应用于生物传感、物质检测、单分子水平分析、疾病诊断及治疗等领域。

适配体是通过SELEX技术筛选获得的一类20～60nt的单链寡核苷酸序列，能与目标物质 特异性结合，其可以是RNA或单链DNA，具有特异性强、化学稳定性好、合成成本低、可 短期常温运输和保存等优点。近年来，多种适配体传感器已被应用到物质检测及分析领域， Yan Hao(S.Rinker，Y.G.Ke，Y.Liu，R.Chhabra，H.Yan，Nat Nanotechnol，2008，3(7)， 418-422)将两种凝血酶适配体与矩形DNA折纸杂交后用于研究其对凝血酶(一种生物大分 子)的捕获效率。该研究中使用的生物大分子尺度为数个纳米，可在原子力显微镜下直接观 察，而小分子的尺度在原子力显微镜下无法观察，因此尚无可用于小分子检测的DNA折纸 纳米结构或相关体系。

真菌毒素是由曲霉，青霉和镰刀菌属等真菌产生的次级代谢产物。受全球气候变暖、干 旱等因素的影响，食用和饲用农产品受真菌毒素污染日趋严重，而人类和动物的食品安全直 接威胁人类的健康。黄曲霉毒素B1(AFB 1)是黄曲霉的次级真菌代谢物，是霉菌毒素家族 中毒性最强的成员。幸运的是现已有很多研究能有效的防止食品和饲料污染。Kim和同事(T. Li,J.Y.Byun,B.B.Kim,Y.B.Shin,M.G.Kim,Biosensors and Bioelectronics,2013,42, 403-408)报道了利用抗体的固有荧光的猝灭来检测霉菌毒素在无标记均相FRET免疫测定的 方法。Li和同事(Y.Wang,N.Liu,B.Ning,M.Liu,Z.Lv,Z.Sun,Y.Peng,C.Chen,J.Li,Z.Gao, Biosensors and Bioelectronics,2012,34(1),44-50)开发了一种免疫芯片迅速同时检测六种不同 的真菌毒素。但由于黄曲霉毒素B1是小分子，所以真菌毒素在DNA折纸上的检测还未见报 道。

纳米金是指粒径为1-100nm的金的微小粒子，也称为胶体金。金纳米粒子具有量子尺寸 效应和表面效应，具有优越的物理化学性质，能通静电吸引、化学键等作用与生物分子形成 复合物，使其近年来在纳米生物学领域取得突出进展。丁宝全(B.Q.Ding,Z.T.Deng,H.Yan, S.Cabrini,R.N.Zuckermann,J.Bokor,J.AM.CHEM.SOC,2010,132,3248)、贺林(X.Feng,C. Zhou,D.Niu,J.Zhao,J.Yang,L.He,C.Li,Current Organic Chemistry,2014,18(15), 2043-2046)等将纳米金与DNA折纸结合起来用来研究纳米金在折纸上的空间效应尺寸效应 及单核苷酸多态性的检测。但迄今为止并没有将纳米金用于小分子检测的研究和专利报道。

受限于小分子物质本身的特性，目前检测手段有限，本发明拟将DNA折纸、纳米金、 适配体结合起来开发一种新型的生物传感器，用于检测模型小分子物质——黄曲霉毒素B1， 为小分子物质的检测手段拓展思路，开辟新的路径。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的 生物传感器，该生物传感器可用于检测小分子物质，增加了小分子物质的检测手段；本发明 还提供了上述生物传感器的制备方法及应用。

为达上述目的，本发明采取如下技术方案：

1、基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器，所述生物传感器包括 DNA折纸，以及与DNA折纸相比，加入量为过量的纳米金；所述DNA折纸包含被检测物 的适配体核苷酸序列，所述纳米金为经被检测物适配体核苷酸序列互补DNA片段修饰后的 纳米金。

优选的，所述被检测物为小分子物质。

优选的，所述小分子物质为伏马毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A或玉米赤霉 烯酮。

优选的，所述小分子物质为黄曲霉毒素B1，所述DNA折纸包含如SEQ ID No.1所示核 苷酸序列，所述纳米金为经SEQ ID No.2所示核苷酸序列修饰后的纳米金。

2、基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器的制备方法，包括如下步 骤：首先制备包含被检测物适配体核苷酸序列的DNA折纸，然后用DNA片段对纳米金进行 修饰即可获得所述生物传感器；所述DNA片段为被检测物适配体的互补核苷酸序列。

优选的，所述纳米金用DNA片段进行修饰前先用二水合双(对磺酰苯基)苯基膦化二钾盐 进行处理。

3、基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器在检测小分子物质中的应 用。

优选的，首先将DNA折纸与被检测物在25℃条件下孵育30min，然后按纳米金与DNA 折纸摩尔比为5:1的比例加入纳米金，最后在43℃～20℃条件下梯度退火。

本发明研究发现，DNA修饰后纳米金与带有黄曲霉毒素适配体核苷酸序列的DNA折纸 结合后会呈现三种不同的构象，如图3所示，DNA修饰后纳米金可分别出现在三角形的顶点 (图中b图)，边的中点(图中c图)以及三角形正中间的凹陷处(图中d图)，图中a图则 是没有结合的原子力显微镜表征结果。为了验证上述三种结合合理与否，研究人员对两者的 结合位置进行了理论计算，计算示意图如图4所示，其中A为结合位点，20.4nm为黄曲霉毒 素适配体的DNA链长度，15.48nm为未经修饰的纳米金的粒径。由数据计算分析可知，纳米 金在以A点为圆心的灰色圆中任一点均有出现的可能性，这也证实了图3呈现的三种不同构 象均合理。

本发明所述生物传感器的工作原理(如图5所示)如下：带有黄曲霉毒素B1适配体的 DNA折纸，这条单链适配体可视为探针，在没有目标物质——黄曲霉毒素存在的情况下，加 入与黄曲霉毒素B1适配体序列互补的DNA修饰的纳米金，两条互补的DNA单链会结合为 双链，纳米金即连接在DNA折纸上(a)；当黄曲霉毒素存在的情况下，探针会捕获目标物质， 剩余的探针再与经黄曲霉毒素B1适配体互补核苷酸序列修饰的纳米金结合，当探针全部结 合完毕后，剩余的未结合的纳米金呈游离状态(b)，通过原子力显微镜进行表征，即可得出 目标物质---黄曲霉毒素的浓度。

本发明的有益效果在于：本发明将DNA折纸、纳米金、适配体相结合，开发了一种新 型的生物传感器，当待检测体系中不含有AFB1时，连有AFB1适配体的DNA折纸会全部用 于捕捉修饰有AFB1适配体互补DNA的纳米金；而当含有AFB1时，连有AFB1适配体的 DNA折纸会先捕捉AFB1，剩余的部分再与修饰有AFB1适配体互补DNA序列的纳米金结 合；然后将结果用原子力显微镜和电泳进行表征，通过纳米金在原子力显微镜高度图中高亮 的特点进行定量和定性分析。

该方法有如下优点：(1)DNA折纸本身具有精确的空间可寻址性，加入纳米金这一成员 后，避免了繁琐的标记步骤；(2)适配体与抗体相比，可以通过化学方法批量合成，大大降 低了成本；(3)克服了小分子物质自身免疫性差的缺点；(4)该方法具有较低的检测限，LOD 达到了纳克级；(5)借助原子力显微镜和电泳进行表征，利用纳米金在原子力显微镜高度图 中高亮的特点进行定量和定性分析，与传统研究手段相比，具有简便、可靠、较低的实验条 件要求等优势。

通过统计学分析发现随着毒素浓度的增加，探针捕获到的纳米金越少，且呈现梯度变化。 本发明收率高、方法可靠、可达到单分子检测分析水平。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1纳米金修饰前后的紫外可见分光光度计、粒径、zeta电位表征结果。

图2基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器对黄曲霉毒素B1检测 的可行性实验的原子力显微镜图。

图3修饰后纳米金与带有黄曲霉毒素适配体的DNA折纸结合后呈现的三种不同构象， 可见，修饰后纳米金分别出现在三角形的顶点(图中b图)，三角形边的中点(图中c图)和 三角形正中间的凹陷处(图中d图)，图中a图作为对照，为没有结合的表征结果。

图4修饰后纳米金与带有黄曲霉毒素适配体的DNA折纸结合位置的理论计算示意图， 图中标注尺寸均以纳米计。

图5生物传感器工作示意图。

图6基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器对AFB1的检测结果， 图中a)、b)、c)和d)图分别为黄曲霉毒素适配体的DNA折纸与黄曲霉毒素摩尔比为1：0、 1：1、1：10和1：100的原子力显微镜图。

图7含有梯度黄曲霉毒素浓度的DNA折纸的琼脂糖凝胶电泳分析结果。

具体实施方式

下面以黄曲霉毒素B1的检测为例，对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当指出 的是，本发明并不仅限于检测AFB1，亦可经简单的适配体替换而用于其它小分子物质的检 测，比如伏马毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等。

实施例1正三角形DNA折纸的制备

按照Rothemund设计的序列(P.W.Rothemund,Nature,2006,440,297.0)，将M13mp18噬 菌体(购于NEB公司，货号：#N4040S)、200多条未修改的订书钉链(P.W.Rothemund,Nature, 2006,440,297.0)、末端修饰有黄曲霉毒素适配体的订书钉链(SEQ ID No.1)按照1：10：10 的摩尔比进行混合，然后加入1×TAE～Mg²⁺缓冲液(Mg²⁺浓度12.5mM)后，将混合溶液置于 PCR仪中以1℃/100s的速率从95℃～20℃退火，反应后使用100kDa超滤管(Amicon Ultra公司) 除去多余的订书钉链后投入下一步使用。

其中，末端修饰有黄曲霉毒素适配体的订书钉链序列如下：

5’-gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccact ttttgtgaga aaatgtgtag gtaaagatac aacttt-3’， (SEQ ID No.1)。

实施例2 SH-DNA修饰的纳米金颗粒的制备

用BSPP(bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine dihydrate dipotassium salt，购于 Sigma-Aldrich公司)修饰纳米金，使用丁宝全报道的方法(B.Q.Ding,Z.T.Deng,H.Yan,S. Cabrini,R.N.Zuckermann,J.Bokor,J.AM.CHEM.SOC,2010,132,3248)：15mg BSPP加入50mL 浓度为1.67nM的纳米金溶液中，于室温下避光震荡12h后，加入固体氯化钠至溶液颜色变为 浅紫色，10000rpm离心15min，弃去上清液后，将沉淀重悬于1mL 2.5mM的BSPP溶液中后， 再加入1mL甲醇，并再次离心，收集沉淀，BSPP重悬。纳米金修饰前后的紫外可见分光光 度计、粒径、zeta电位表征结果见图1，可见，每步修饰后，紫外吸收峰有了较明显的偏移， 粒径逐渐变大，zeta电位越来越负，证明纳米金修饰成功。

向与黄曲霉毒素适配体互补的100μM SH-DNA(SEQ ID No.2)中加入100倍摩尔浓度的 等体积三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，反应1小时后加入BSPP修饰的纳米金，按摩尔比例为200： 1的比例将SH-DNA与纳米金混合，将混合液稀释至1mL，随后滴入1mL 0.5×TBE～50mM  NaCl缓冲液，室温孵育超过40小时后离心重悬，即得到修饰有DNA的纳米金颗粒。

其中，与黄曲霉毒素适配体互补的SH-DNA序列如下：

5’-agagacaaca cgtgcccaac aaaaaa-(CH₂)₃-SH-3’，(SEQ ID No.2)。

实施例3基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器对黄曲霉毒素B1 检测的可行性实验

首先将连有黄曲霉毒素适配体的DNA折纸与黄曲霉毒素进行特异性反应：将带有黄曲 霉毒素适配体的DNA折纸按照摩尔比1：100的比例与过量的黄曲霉毒素混合后，室温反应 30min，取新解离的云母片，滴入10μL反应后的上述混合物，干燥后采用ScanAsyst模式用 原子力显微镜(Bruker DIMENSION icon)进行表征，表征结果如图2中b1图所示。

然后将连有黄曲霉毒素适配体的DNA折纸与修饰有互补DNA的纳米金以1：5的摩尔 比配比后进行杂交，放入PCR仪中43℃-20℃梯度退火，取新解离的云母片，滴入10μL反应 后的上述混合物，干燥后，采用ScanAsyst模式用原子力显微镜(Bruker DIMENSION icon) 进行表征，表征结果见图2中c1图。

另外，图2中a1图为带有黄曲霉毒素适配体的DNA折纸的原子力显微镜图，a2、b2、 c2图分别为a1、b1、c1图中标注位点的尺寸测量结果。通过对比可知，小分子的AFB1被适 配体特异性结合后，并不能通过原子力显微镜直观的观察到，且通过特定位点(图4中黑点) 的高度测量亦没有明显变化，而连有纳米金的DNA折纸明显可见，因此这种方法可用于进 行黄曲霉毒素的检测。

实施例4基于适配体修饰的DNA折纸纳米结构-纳米金的生物传感器对AFB1的检测

将连有黄曲霉毒素适配体的DNA折纸与黄曲霉毒素分别按摩尔比为1：0、1：1、1：10 和1：100的比例混合后室温下孵育30分钟，然后按连有黄曲霉毒素适配体的DNA折纸与 修饰有互补DNA的纳米金摩尔比为1：5的比例将两者配比后进行杂交，放入PCR仪中43℃ -20℃梯度退火，采用ScanAsyst模式用原子力显微镜(Bruker DIMENSION icon)进行表征， 表征结果见图6，a)、b)、c)、d)分别为生物传感器与黄曲霉毒素摩尔比为1：0、1：1、1： 10和1：100的工作图。由图6可见随着黄曲霉毒素浓度的升高，不与DNA修饰后纳米金结 合的DNA折纸的数量越来越多，说明通过检测DNA修饰后纳米金的浓度可以间接的反映出 AFB1的浓度。而表1所示的统计学分析结果则佐证了直观观察的原子力显微镜图像即图6 的结果，理论上证明了随着黄曲霉毒素浓度的升高，不与纳米金结合的DNA折纸的数量越 来越多(经t检验，a与b，a与c，a与d具有显著性差异)。

表1不同浓度黄曲霉毒素检测结果统计学分析

实施例5含有梯度黄曲霉毒素浓度的DNA折纸的琼脂糖凝胶电泳分析

配置1.5％的琼脂糖凝胶溶液，加热溶液使之沸腾3次后，流水冷却至50℃以下，加入5μL  Nucleic Acid Stain核酸染料，混匀，倒入制胶板，插好梳子，使之凝固，分别向各个泳道加 样如下：

1号泳道：DNA折纸；

2号泳道：DNA折纸+80.0ng/mL黄曲霉毒素+DNA修饰后纳米金；

3号泳道：DNA折纸+8.0ng/mL黄曲霉毒素+DNA修饰后纳米金；

4号泳道：DNA折纸+0.8ng/mL黄曲霉毒素+DNA修饰后纳米金；

5号泳道：DNA折纸+DNA修饰后纳米金。

采用80V恒压下工作3小时，将电泳完毕后的凝胶放入凝胶成像系统(型号Chemi XR5) 中，400ms曝光，拍照，结果见图7。由图7可知，由于结合了DNA修饰后纳米金的DNA 折纸分子量更大，跑的更慢，则其较单个的DNA折纸分子(见1号泳道)位于胶的更上方 (此处上方是指距离上样位置越近，下同)。由此，随着黄曲霉毒素浓度的降低，与黄曲霉毒 素结合的适配体就越少，与DNA修饰后纳米金结合的DNA折纸就越多，位于上方的条带越 来越亮，由于DNA折纸总量不变，则未结合纳米金的DNA折纸就越少，位于下方的条带越 来越暗(见2-5号泳道)。本实施例结果再一次证实了本发明所述生物传感器检测小分子物质 的可靠性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。