一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法，运用普通PCR直接同时扩增抵抗素全长和剪接体基因，用胶回收方法直接回收剪接体条带，然后进行载体的快速克隆测序；使用慢病毒载体高效转染试剂转染所有慢病毒载体质粒，并使用灭活血清包装慢病毒颗粒，并获得高滴度的重组慢病毒原液。本发明可免去PCR+1方法筛选大量的工作和高额的费用，消除获得剪接体基因的概率限制，并高效、快速、廉价地直接获得剪接体基因；可高效转染慢病毒载体质粒，并获得高滴度的重组慢病毒滴度。

说明书

技术领域

本发明属于克隆技术领域，尤其涉及一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢 病毒载体的构建方法。

背景技术

抵抗素是新发现的一种脂肪组织特异性分泌的脂肪细胞因子，具有抵抗胰 岛素的作用，认为是肥胖与Ⅱ型糖尿病之间未曾被发现的联系纽带，甚至认为 肥胖能引起胰岛素抵抗就是因为脂肪细胞分泌了抵抗素的缘故。抵抗素的发现 是糖尿病研究中的一大进展，已成为连接肥胖与Ⅱ型糖尿病相关性的研究热点。 但是近几年的研究结果对抵抗素参与机体胰岛素抵抗的生物学功能的阐述发生 了分歧，在对人类Ⅱ型糖尿病群体的统计分析中甚至出现了没有相关性的结果， 大部分科学研究者推测这很可能是实验动物的物种不同造成的原因，同时近期 在人类中发现了有抵抗素剪接体的存在，目前我们的研究团队也发现非人灵长 类恒河猴也有抵抗素剪接体的存在，而且恒河猴抵抗素剪接体的剪接位点和片 段大小与人类的完全一致，或许这是在部分人类Ⅱ型糖尿病群体中抵抗素生物 学功能研究结果出现不同结果的原因所在。因为非人灵长类恒河猴在遗传和生 理生化上都与人类存在较高的相似性，因此克隆恒河猴抵抗素剪接体基因是研 究人类抵抗素剪接体基因比较医学功能的理想选择。另外，慢病毒载体能有效 介导外源基因在细胞或机体组织内稳定表达，可长期持续性表达目的蛋白，是 目前将外源基因导入细胞内稳定表达的较好的工具。所以，构建恒河猴抵抗素 剪接体的重组慢病毒载体，对人类抵抗素剪接体的生物学功能的研究，具有重 要的比较医学意义。

剪接体的克隆方法，通常情况用PCR+1的方法对目的基因的等位基因进行 随机克隆筛选，通过对大量单克隆菌的测序和筛选，分析等位基因，筛选出剪 接体。一般情况，对慢病毒载体的构建过程中包装慢病毒颗粒采用脂质体转染 试剂进行质粒转染，并用含丙酮酸钠的病毒包装培养基进行包装颗粒。

用一般的方法进行慢病毒包装，存在质粒转染效率低、慢病毒滴度不高等 不足，尤其是滴度不高一直是困扰慢病毒载体运用的一大问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构 建方法，旨在解决用PCR+1方法筛选工作量大、费用高昂，传统的方法进行慢 病毒包装，存在质粒转染效率低、慢病毒滴度不高的问题。

本发明是这样实现的，一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构 建方法包括：

步骤一、运用普通PCR直接同时扩增抵抗素全长和剪接体基因，用胶回收 方法直接回收剪接体条带，然后进行载体的快速克隆测序；

步骤二、使用慢病毒载体高效转染试剂转染所有慢病毒载体质粒，并使用 灭活血清包装慢病毒颗粒，并获得高滴度的重组慢病毒原液；

进一步，携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法具体包括：

步骤一、设计恒河猴抵抗素ORF扩增引物，分别携带PLV-EF1a-EGFP[2A] Puro质粒的酶切位点EcoRⅠ和BamH Ⅰ，上游引物5’ -GGAATTCCACCATGAAAGCCCTCTGTCTCCTCCT-3’(EcoR Ⅰ),下游引物5’ -CGGGATCCCGTCAGGGCTGCAGACGACAGCAGC-3’(BamH Ⅰ)；

步骤二、恒河猴抵抗素剪接体的PCR扩增，包括RNA提取、cDNA合成、恒 河猴抵抗素剪接体的PCR扩增；

步骤三、恒河猴抵抗素剪接体慢病毒载体的构建，将纯化后测序正确的 246bp大小的PCR产物和PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro质粒分别进行酶切，用2％ 的琼脂糖凝胶电泳，分别回收酶切产物，将酶切产物16℃过夜连接，将连接产 物培养过夜，次日挑取培养板上的单克隆菌至5mL AMP⁺LB培养液试管中，37 ℃摇菌过夜；

步骤四、提取重组质粒；

步骤五、将酶切鉴定和测序正确的恒河猴抵抗素剪接体 PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro重组质粒、PH1和PH2包装质粒在Stbl 3感受态细胞 中转化扩增，提取质粒，并用微量分光光度计测定各质粒浓度；

步骤六、转染前2d将293T细胞接种到10cm圆碟中，用高糖DMEM完 全培养基培养，待细胞单层长至70％即可开始转染慢病毒系统质粒。

进一步，转染慢病毒系统质粒的具体方法为：

先将5μg的恒河猴抵抗素剪接体PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro重组质粒加入 500μL Opti-MEM中，再加入3.75μg的HP1质粒和1.25μg的PH2质粒， 轻轻混匀，静置5min；在另一只管中将20μL的EndoFectin Lenti慢病毒高 效转染试剂加入480μL Opti-MEM中混匀；再将稀释转染试剂的后一只管中的 混合液缓慢加入前一管中轻轻混匀，并在室温静置孵育20min。然后把293T 包装细胞的培养基小心更换为10mL慢病毒包装培养液，再将1mL转染混合液均 匀加入293T细胞培养液中，37℃培养8h后更换为10mL新鲜的慢病毒包装培 养液，在转染48h后在荧光显微镜下观察eGFP载体报告基因的转染效率，并 收获重组病毒原液。

本发明可免去PCR+1方法筛选大量的工作和高额的费用，消除获得剪接体 基因的概率限制，并高效、快速、廉价地直接获得剪接体基因；可高效转染慢 病毒载体质粒，并获得高滴度的重组慢病毒滴度。

附图说明

图1是本发明实施例提供的恒河猴抵抗素剪接体PCR扩增电泳图；

图2是本发明实施例提供的恒河猴抵抗素ORF和剪接体序列比对结果；

图3是本发明实施例提供的恒河猴抵抗素剪接体重组慢病载体质粒的双酶 切鉴定结果；

图4是本发明实施例提供的感染恒河猴抵抗素剪接体重组慢病毒的KMB17 细胞cDNA的RT-PCR检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

1、试验材料和试剂

质粒、菌株及细胞：

PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro/PH1/PH2慢病毒系统购于英茂盛业公司，感受 态DH5α(中国医学科学院医学生物学研究所保存)，感受态Stbl3购于 GeneCopoeia公司，293T细胞和KMB17细胞(中国医学科学院医学生物学研 究所保存)。

主要试剂：

TRIzol Reagent购于美国invitroger公司，PCR master mix、内切酶EcoR I 和BamH I、T4连接酶均购于TAKARA公司，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于 Omega公司，DMEM和FBS购于康宁公司，Opt i-MEM购于GIBCO公司，Polybrene购 于Sigma公司，转染试剂EndoFectin-Lenti和cDNA逆转录试剂盒购于 GeneCopoeia公司。

2、引物设计与合成

根据NCBI JF740676.1报道序列设计恒河猴抵抗素ORF扩增引物，分别携 带PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro质粒的酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ，上游引物5’ -GGAATTCCACCATGAAAGCCCTCTGTCTCCTCCT-3’(EcoR Ⅰ),下游引物5’ -CGGGATCCCGTCAGGGCTGCAGACGACAGCAGC-3’(BamH Ⅰ)。并送由上海生工合成引 物。

3、恒河猴抵抗素剪接体的PCR扩增

3.1RNA提取

在正常饲养恒河猴群中随机采集4只恒河猴的后肢静脉抗凝血，分别取 200μL放入1.5mL的无RNA酶离心管，加入800μL的TRIzol Reagent溶液，漩涡振 荡充分混匀；再加入200μL的三氯甲烷，漩涡振荡15s，室温放置2-15min， 12000rpm 4℃15min；将上清移到另一个新的无RNA酶的1.5mL离心管中，加等 体积的异丙醇，混匀后室温静置10-15min，12000rpm 4℃15min，弃上清；然 后加入1mL75％乙醇，漩涡振荡，8000rpm 4℃5min；弃上清，空气晾干5min， 加入35-50μL RNase-free ddH₂O，55-60℃水浴溶解10min

3.2cDNA合成

根据cDNA合成试剂盒说明书，在PCR管中加入RNA 4μL、Oligo(dT)18 primer  1μL、Random primer 1μL、ddH₂O 6μL，65℃热水浴5min，立即放回冰上。然后 依次加入5×Reaction Buffer 4μL、Ribolock RNase Inhibition 1μL、10mM dNTP  Mix 2μL、Revert Aid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL、ddH₂O 5μL，进行 第二步逆转录反应，条件为25℃5min、42℃60min、70℃5min。

3.3恒河猴抵抗素剪接体的PCR扩增

PCR扩增反应体系：2×PCR Master Mix 12.5μL、恒河猴全血cDNA 2μL、 上游引物1μL、下游引物1μL、ddH₂O 8.5μL，总体积为25μL。反应条件：94 ℃3min、93℃30s、56.4℃50s、72℃50s、35个循环，72℃7min。

用2％的琼脂糖凝胶电泳，可获得324bp和246bp大小的两个扩增条带(见图 1)，用胶回收试剂盒分别对324bp和246bp的条带进行纯化，并取样送由上海生 工测序，测序结果表明324bp扩增产物为恒河猴抵抗素ORF全长序列，246bp扩增 产物为恒河猴被剪接78bp的抵抗素剪接体，比对结果见图2。

4、恒河猴抵抗素剪接体慢病毒载体的构建

4.1酶切、连接和转化

4.1.1将纯化后测序正确的246bp大小的PCR产物和PLV-EF1a-EGFP[2A] Puro质粒分别进行酶切，PCR产物酶切体系和条件为：PCR产物12μL、10×K  Buffer 2μL、EcoR Ⅰ 1μL、BamH Ⅰ 1μL、ddH₂O 4μL，总体积为201μL，37℃酶 切2h；质粒酶切体系和条件：PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro质粒5μL、10×K Buffer  2μL、EcoR Ⅰ 1μL、BamH Ⅰ 1μL、ddH₂O 11μL，总体积为201μL，37℃酶切2h； 然后用2％的琼脂糖凝胶电泳，分别回收酶切产物。

4.1.2将以上的酶切产物16℃过夜连接，体系为：PCR酶切产物15μL、质 粒酶切产物1μL、10×T4DNA Ligase Buffer 2.51μL、T4 DNA Ligase 1μL、 ddH₂O 5.5μL，总体积25μL。

4.1.3将以上的连接产物12μL加入DH5α感受态细胞，冰浴45min、42℃ 90s、冰浴3min、加入LB培养液800μL混匀，37℃培养1h；取200μL混合液到AMP⁺培养板涂板，37℃培养过夜；次日挑取培养板上的单克隆菌至5mL AMP⁺LB培养 液试管中，37℃摇菌过夜。

4.2重组质粒的提取

根据小量质粒提取试剂盒说明书抽提质粒，先将5mL菌液分批移至1.5mL 离心管中10000g离心1min，弃上清用250μL的Selution I重悬沉定，加入250μL 的Selution II颠倒混匀至透明液体，再加入300μL的Selution III颠倒混匀至 出现白色絮状物，13000g离心10min，取上清至制备管中的柱子中，10000g离心 1min，加入500μL HB Buffer 10000g离心1min，然后加入Wash buffer700μL  10000g离心1min，重复洗涤一次，再用13000g离心2min，最后加入40μL Elution  buffer室温放置1min，13000g离心1min，可重复溶解一次，既获得重组质粒。 然后进行EcoR I和BamH双酶切鉴定(见图3)，再将酶切正确的质粒送往上海生 工测序鉴定。

4.3重组慢病毒颗粒的包装和鉴定

4.3.1将酶切鉴定和测序正确的恒河猴抵抗素剪接体 PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro重组质粒、PH1和PH2包装质粒用以上4.1.3的方法在 Stbl3感受态细胞中转化扩增，用以上4.2方法分别提取质粒，并用微量分光光 度计测定各质粒浓度。

4.3.2转染前2d将293T细胞接种到10cm圆碟中，用高糖DMEM完全 培养基(10％FBS、1％双抗)在37℃5％CO2中培养，待细胞单层长至70％即可开 始转染慢病毒系统质粒。先将5μg的恒河猴抵抗素剪接体 PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro重组质粒加入500μL Opti-MEM中，再加入3.75μg 的HP1质粒和1.25μg的PH2质粒，轻轻混匀，静置5min；在另一只管中将20μL 的EndoFectin Lenti慢病毒高效转染试剂加入480μL Opti-MEM中混匀；再将 稀释转染试剂的后一只管中的混合液缓慢加入前一管中轻轻混匀，并在室温静 置孵育20min。然后把293T包装细胞的培养基小心更换为10mL慢病毒包装培养 液(高糖DMEM 94％、5％灭活FBS、1％双抗)，再将1mL转染混合液均匀加入293T细 胞培养液中，37℃培养8h后更换为10mL新鲜的慢病毒包装培养液，在转染48h 后在荧光显微镜下观察eGFP载体报告基因的转染效率，并收获重组病毒原液。

4.3.3恒河猴抵抗素剪接体重组慢病毒鉴定

将KMB17细胞传至6孔板，次日把培养液换为含5μg/mL Polybrene的 5％灭活FBS、1％双抗的高糖DMEM，加入每孔100μL的慢病毒原液感染细胞，8h 后更换为5％灭活FBS、1％双抗的高糖DMEM培养至72h，即可在荧光显微镜下观察 KMB17细胞中载体报告基因eGFP的表达情况，可观察到较强的绿色荧光说明重组 慢病毒已经有效感染靶细胞，并介导报告基因和目的基因在靶细胞中表达。分 别提取细胞的总RNA并逆转录为cDNA用RT-PCR进行扩增，通过电泳得到了246bp 大小的恒河猴抵抗素剪接体目的条带(见图4)，说明在KMB17细胞中有抵抗素 剪接体基因mRNA的表达。证明已经成功构建了恒河猴抵抗素剪接体的慢病毒表 达载体，并可有效介导恒河猴抵抗素剪接体在靶细胞中高效表达。

本发明可免去PCR+1方法筛选大量的工作和高额的费用，消除获得剪接体 基因的概率限制，并高效、快速、廉价地直接获得剪接体基因；可高效转染慢 病毒载体质粒，并获得高滴度的重组慢病毒滴度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。