ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用

摘要

本发明提供了一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用，本发明提供通过实验发现ACTL6A基因编码的相应蛋白，在细胞核内存在高表达时，患者术后癌症复发几率增高。通过已知各种给药方式，实现对ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达抑制，从而达到有效防止肝癌细胞在人体内的EMT作用，降低肝癌细胞在体内的转移机会，从而提高患者术后的生存时间和减少转移复发。

说明书

技术领域

本发明涉及肝癌治疗领域，特别地，涉及一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocelluar Carcinoma，HCC)是一种严重威胁人类生命健康的常见疾病，全世界每年约有超过700,000人死于HCC，而中国每年新发病例约占全球总数的一半。近年来随着诊断方法、手术技术和综合治疗手段的进步，为HCC的诊治提供了更多的选择，使HCC的疗效得到了一定的提高。然而HCC是一种具有高度恶性生物学行为的肿瘤，极易在早期发生侵袭、转移，大部分患者就诊时已到中晚期，失去了根治该疾病的机会，导致总生存率仍不乐观，术后5年生存率徘徊在30％左右。因此有效控制HCC的侵袭和转移是改善HCC患者治疗效果及获得长期生存的根本办法。

近年来许多研究发现上皮性肿瘤细胞在侵袭转移过程中往往呈现出上皮细胞表型丧失现象，从而使其获得间充质细胞表型的特点，这一现象称之为上皮-间质转变(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，EMT密切参与多种常见上皮性肿瘤的发生发展。如最近研究通过微流体捕获技术发现乳腺癌患者血液中的癌细胞向间充质细胞表型转变时，则提示复发、转移、治疗抵抗等现象发生。当癌细胞向上皮细胞表型转变(MET)时，患者治疗转归逐渐好转，这一研究为EMT在肿瘤侵袭转移中所起作用提供了重要证据。深入研究后发现，肿瘤侵袭转移级联反应的各步骤中均有EMT的参与，肿瘤细胞通过连续的EMT-MET过程进行侵袭转移并最终在远处脏器形成新的转移灶。因此寻找能调控EMT与HCC侵袭转移级联反应的基因，并根据其设计相应的靶向治疗药物，将为控制HCC的转移提供有效的生物学治疗手段。

发明内容

本发明提供一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用，以解决现有技术中对于肝癌患者术后肝癌细胞容易在人体内侵袭转移导致癌细胞扩散的技术问题。

根据本发明的一个方面，提供了一种ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌细胞侵袭转移的药物中的应用。

进一步地，应用包括在慢病毒载体中敲除带有ACTL6A基因质粒的给药方式。

进一步地，应用包括以电荷翻转载体为载体对肝癌肿瘤细胞核靶向给药的应用。

进一步地，ACTL6A基因序列为序列表中a)～c)中的一种基因：a)序列表中SEQ ID NO.1所示的基因序列；b)序列表中SEQ ID NO.2所示的基因序列；c)序列表中SEQ ID NO.3所示的基因序列。

进一步地，ACTL6A基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示的基因序列。

根据本发明的另一方面还提供了一种药物组合物，包含敲除了表达ACTL6A基因的慢病毒载体。

根据本发明的另一方面还提供了一种药物组合物，ACTL6A基因与递送载体相连接后用于药物组合物中。

进一步地，载体为电荷翻转型药物载体。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供通过实验发现ACTL6A基因编码的相应蛋白，在细胞核内存在高表达时，患者术后癌症复发几率增高。通过已知各种给药方式，实现对ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达抑制，从而达到有效防止肝癌细胞术后在人体内的EMT作用，降低肝癌细胞在体内的转移机会，从而提高患者术后的生存质量。

2.本发明提供的ACTL6A基因的应用包括对肝癌的治疗或肝癌术后预防癌细胞在人体内转移侵袭其他组织中的药物应用。

3.本发明通过研究首次证实名为ACTL6A的基因在肝癌组织的核蛋白中存在高表达，利用该基因的这一特性，可以用于制备检测潜在肝癌患者的试剂盒。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为ACTL6A基因在肝癌细胞和肝组织中的表达相关结果图；

图2为ACTL6A高表达与HCC患者不良预后明显相关结果图；

图3为细胞慢病毒转染效率验证相关结果图；

图4为ACTL6A过表达/敲除效能验证相关结果图；

图5为ACTL6A可在体外促进肝癌细胞的运动、侵袭和转移能力的相关结果图；

图6为ACTL6A可在体内促进肝细胞癌生长及侵袭转移的相关结果图；

图7为慢病毒转染敲除ACTL6A的质粒可抑制肝癌皮下瘤生长的相关结果图；以及

图8为敲除ACTL6A可抑制肝癌原位瘤生长及侵袭转移的相关结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本文中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100m1中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。

本发明一方面提供了一种ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌细胞侵袭转移的药物中的应用。

Actin-like 6A(ACTL6A)是一种编码肌动蛋白相关蛋白(actin-related proteins，ARPs)的基因，基因定位于染色体3q26.33。在哺乳动物中，ACTL6A主要具有调节转录、胞核转移、染色质重构等重要功能。最新研究发现ACTL6A具有许多独特的特点，其高表达能诱导上皮性细胞发生EMT并促进迁移、增殖，因此可能参与肿瘤的发生发展。我们前期研究亦证实ACTL6A可能在HCC复发转移中发挥重要作用，针对ACTL6A设计抑制药物将能很好的抑制肝癌的侵袭和转移。

肝癌细胞系(PLC/PRF5，SMMC7721，HepG2，Hep3B，Huh7，MHCC97-L，MHCC97-H，HCCLM3)上述是肝癌研究常用的肝癌细胞系名称，其中PLC/PRF5，HepG2，Hep3B来源于美国模式培养物保藏所，SMMC7721，Huh7，MHCC97-L，MHCC97-H，HCCLM3来源于复旦大学肝癌研究所。

ACTL6A基因的功能通过以下实验进行了验证：

1.肝癌标本及临床资料收集

随机搜集2006年1月至2009年12月间在湘雅医院手术切除，术后病理证实为肝细胞癌，病例资料和随访资料及标本完整的病例100例。其中取小肝癌、孤立性大肝癌和结节性肝癌冰冻标本各10例。肝癌组织切除后，立即切取黄豆粒大小的肝癌组织(T)和距离肿瘤边缘1cm的邻近非肿瘤肝组织(ANLT)，将组织置于无菌离心管中，并立即于液氮中冻存，然后转移至-80℃超低温冰箱(型号Thermo Forma 905)。另切除带有癌旁肝组织的肝癌标本，将之放入5％的福尔马林溶液中固定，再将肝癌组织标本依次置于50％乙醇溶液、75％乙醇溶液、95％乙醇溶液和无水乙醇中各5分钟，进行梯度脱水后置于二甲苯中使肝癌标本透明，将透明后的肝癌组织标本放入融化的石蜡中浸透。在包埋器中倒入融化的石蜡，在石蜡凝固之前迅速将组织标本放入其中。石蜡凝固后将其切割成1cm³的方块。用切片机切取4um的连续切片，用于免疫组织化学实验。

详细收集上述100例患者的各项临床病理资料、手术资料及术后随访资料，如患者性别、年龄、合并疾病、肝炎病史、有无肝硬化、肝功能Child-Pugh分级、凝血功能、血清甲胎蛋白、肿瘤位置、手术方式、手术时间、止血方式、术中出血及输血量、术后并发症、围手术期死亡、切除标本大小、肿块数目、有无包膜、血管浸润、病理类型、细胞分化程度及肿瘤临床分期等。术后通过门诊复查、电话或面对面沟通的方式定期(前2年每3-6个月随访1次，2年后每年随访1次)进行临床随访，建立完善的随访数据库。肝癌病人术后是否发生复发转移则依据肝脏超声检查、CT、MRI、血清甲胎蛋白含量以及再次手术等方法确定。若病人在此时间内发生死亡或者复发转移则作为随访的终止点；若患者未因肝癌死亡或者未出现复发转移或因其他原因死亡者则作为删失数据。患者的生存时间为患者手术之日到患者死亡的时间。患者的无瘤生存时间为患者手术之日起到出现复发转移的时间。

2.荧光实时定量PCR与半定量RT-PCR

细胞和新鲜冰冻组织RNA提取、测定及cDNA合成详见Celano P等Celano P,Vertino PM,Casero RA Jr.Isolation of polyadenylated RNA from cultured cells and intact tissues.Biotechniques.1993Jul；15(1):26-8和Yang,L.Y.等Yang L Y,Tao Y M,Ou D P,et al.Increased expression of Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein 2correlated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma.Clin Cancer Res,2006,12:5673-5679.中公开的方法进行。

实时定量PCR引物由上海生工生物技术公司设计并合成，引物的特异性和匹配性经NCBI的Primer-BLAST验证。ACTL6A的正向引物序列为：5’-GGTCGTTCTACTGGGCTGATT-3’，ACTL6A的反向引物序列为：5’-AGCAAGAGGGGATTTCACAAT-3’，产物的大小为108bp。同时应用人GAPDH(甘油醛-3磷酸脱氢酶)基因来校正上样量差异，基因的正向引物序列为：5’-agaaggctggggctcatttg-3’，反向引物序列为：5’-aggggccatccacagtcttc-3’，产物的大小是258bp。将装有引物粉末的离心管在离心机上瞬时离心，加入无RNA酶水，引物溶液的终浓度为30μM，于-20℃冰箱中储存。详细的实时定量PCR操作步骤及信使RNA表达量测定见Wu,F.等Wu F,Yang L Y,Li Y F,et al.Novel role for epidermal growth factor-like domain 7in metastasis of human hepatocellular carcinoma.Hepatology,2009,50:1839-1850。

反转录聚合酶连反应的引物由上海生工生物技术公司设计，正向引物的序列为：5’-CCAGGTCTCTATGGCAGTGTAA-3’，反向引物序列为：5’-CGTAAGGTGACAAAAGGAAGGTA-3’，产物的大小为309bp，以上述人的GAPDH基因作为内参。将装有引物粉末的离心管在离心机上瞬时离心，防止粉末飞扬，加入无RNA酶水，引物溶液的终浓度为10μM。详细RT-PCR操作步骤及条带亮度值检测计算见Yang,L.Y.等(Yang L Y,Tao Y M,Ou D P,et al.Increased expression of Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein 2correlated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma.Clin Cancer Res,2006,12:5673-5679。

3.Western-blot

根据Yang,L.Y.等(Yang L Y,Tao Y M,Ou D P,et al.Increased expression of Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein 2correlated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma.Clin Cancer Res,2006,12:5673-5679.的描述提取细胞及新鲜冰冻组织的总蛋白及进行蛋白浓度测定，并将目标蛋白稀释至浓度接近。

根据Western-blot通用实验方法和自身实验要求进行了如下操作：配制12％的聚丙烯酰胺分离胶，配方为：6.6ml的双蒸水，8.0ml的30％Acr-Bis，5.0ml的1.5M Tris(pH8.8)，200μl的10％SDS，200μl的10％过硫酸铵和8μl的TEMED，将配好的分离胶倒入夹好的两块玻璃板中并水封，待分离胶凝固后将上层水封倒掉，配制5％的浓缩胶，配方为：3.4ml的双蒸水，830μl的30％Acr-Bis，630μl的1.5M Tris(pH8.8)，50μl的10％SDS，50μl的10％过硫酸铵和5μl的TEMED，将配制好成层胶缓慢倒入玻璃板中，倒满后将梳子插入其中。将所提取的总蛋白和5×Lodding Buffer按4:1的比例混合，在沸水中煮大约10分钟，然后将蛋白取出放在常温中冷却，蛋白冷却到大约60℃时，以12000rpm的速度离心10分钟。将已经凝固好的丙烯酰胺凝胶放到电泳槽中，把齿梳拔掉后相应孔中添加8μl的蛋白Marker(Thermo，Waltham，CA)或蛋白样品，将mini Protean Tetra Systerm小型垂直电泳系统(BIO-RAD，Hercules，CA)的电压设置为80V，当看到蓝色指示线到达折线以下的时候把电压调到120V，当蓝色指示线到达绿线以下的时候停止电泳，把玻璃板拿出来后用自来水冲洗一下，把两块玻璃板分离开来，取出凝胶放到盛有转膜缓冲液的搪瓷盘中，在转膜夹板的无色透明一边放上一层海绵，然后依次放3层滤纸，甲醇浸透的PVDF膜(Roche，Frankfurt，Germany)，凝胶，再放3层滤纸和1层海绵，然后将合起的夹板放入转膜电泳槽中，并将电泳槽中倒满转膜缓冲液，注意转膜夹板无色透明一边朝向正极，黑色一边朝向负极，将转膜电泳槽放入冰盒中并连接电泳仪(六一，北京，中国)，在200mA恒流的条件下转膜2小时。2小时过后，拆开夹板拿出PVDF膜，用磷酸盐缓冲液冲洗掉转膜缓冲液，7％的封闭液中浸泡40分钟，封闭完成后用PBS-T溶液(1L PBS溶液中加入1ml的Tween-20)洗净封闭液，用一抗稀释液(LEAGENE，北京，中国)按需要的比例与一抗混合，把PVDF膜放入其中，然后放到冷柜中14小时。第二天将PVDF膜从一抗溶液中取出，PBS-T溶液洗三次每次3分钟，然后将PVDF膜放入适当稀释的二抗溶液中，室温下放置30-60分钟，然后用PBS-T溶液洗三次每次10分钟洗净残余二抗。将PVDF膜放入盛有Western BrightTM ECL-spary Western bloting detection system显影剂(ADBANSTA，Menlo Park，CA)无色透明盘中，将透明盘放入BID-RAD chemiDOCTM MP凝胶成像系统中(BIO-RAD，Hercules，CA)，在Image LabTM软件中选择蛋白质印迹并自动成像，成像后将所成的相片导出，利用Image J软件计算出各条带的灰度值，进行统计学分析。

本实验所用的一抗为兔抗人ACTL6A蛋白(47kDa)单克隆抗体(Abcam，Massachusetts，USA)，鼠抗人β-Actin蛋白(42kDa)单克隆抗体(Sigma，Missouri，USA)，本实验所用的二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白抗体(中杉金桥，北京，中国)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠免疫球蛋白抗体(中杉金桥，北京，中国)。

4.免疫组织化学染色

免疫组织化学法详见Yong,K.J.等(Yong K J,Gao C,Lim J S,et al.Oncofetal gene SALL4 in aggressive hepatocellular carcinoma.N Engl J Med,2013,368:2266-2276.)的描述。ACTL6A染色主要定位于细胞核，其阳性染色定义为细胞核内的棕黄色颗粒样染色，免疫组织化学各标本染色程度的评级依据Yong,K.J.等描述。按着色细胞数目多少的评分标准为：没有细胞染色记为0分，小于1/3的细胞染色记为1分，小于2/3的细胞染色记为2分，大部分细胞染色记为3分。着色强度的评分标准为：0分为阳性染色细胞数目少于5％，1分为阳性染色细胞数目为5-30％，2分为阳性染色细胞数目为31-50％，3分为阳性染色细胞数目为51-80％，4分为阳性染色细胞数目大于80％。将0-1分作为ACTL6A低表达组，2-4分作为ACTL6A高表达组进行统计分析。

5.细胞培养及构建ACTL6A过表达和敲除质粒的慢病毒转染肝癌细胞株

实验选取ACTL6A内源性低表达的PLC/PRF5细胞和ACTL6A内源性高表达的Hep3B细胞进行研究。细胞复苏、传代和冻存按细胞培养说明常规进行。ACTL6A内源性低表达的PLC/PRF5细胞拟进行ACTL6A全长质粒慢病毒转染构建PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞和相应的PLC/PRF5对照组细胞；ACTL6A内源性高表达的Hep3B细胞拟进行ACTL6A的shRNA敲除质粒慢病毒转染构建Hep3B敲除ACTL6A细胞和相应的Hep3B对照组细胞。质粒的慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司(上海，中国)构建，具体转染操作步骤根据吉凯公司的protocol进行。

慢病毒过表达质粒载体：GV287，元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位点：AgeI AgeI，过表达引物序列5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAGCGGCGGCGTGTACG-3’。

慢病毒shRNA敲除质粒载体：GV248，元件顺序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin(hU6启动子-多克隆位点-泛素-绿荧光蛋白-内部核糖体进入位点-嘌呤霉素)，采用上述方法共构建ACTL6AshRNA序列3条：

ACTL6A-RNAi(26882-1)：5’-TCCAAGTATGCGGTTGAAA-3’为所附序列表中SEQ ID NO.1所示的基因序列；

ACTL6A-RNAi(26883-1)：5’-GTACTTCAAGTGTCAGATT-3’，为b)序列表中SEQ ID NO.2所示的基因序列；

ACTL6A-RNAi(26884-1)：5’-GGGATAGTTTCCAAGCTAT-3’为序列表中SEQ ID NO.3所示的基因序列。通过后续实验发现，上述三条序列的ACTL6A基因对于肝癌均具有较优的治疗效果和术后预防复发或转移效果。

慢病毒质粒转染效率经镜下荧光观察，过表达/敲除效能分别提取RNA和蛋白经实时定量PCR和Western-blot检测验证，PCR引物见前文所述。细胞转染成功后进行常规培养、保种并进行后续的体内外功能学实验。

6.体外功能学实验

6.1细胞骨架免疫荧光染色

细胞骨架免疫荧光实验参照Abcam公司的protocol说明进行，简要步骤如下：(1)实验前将盖玻片放于75％的酒精中浸泡24小时，紫外线照射30分钟。(2)将盖玻片用无菌PBS溶液清洗干净，在六孔板每孔放入一个盖玻片并加入2ml不完全细胞培基。(3)吸取约1×10⁵个细胞加入到六孔板各孔中，在培养箱中放置24小时。(4)24小时后，吸掉培基后用PBS溶液清洗细胞两次，各孔分别加入1ml 4％多聚甲醛固定并静置15分钟。(5)冰PBS溶液洗涤3次，然后在每个孔中加入1ml 0.25％Triton X-100，10分钟后吸掉。(6)PBS溶液洗涤3次，滴加1滴的5μg/ml的罗丹明鬼笔环肽(Sigma，St Louis，MO)在玻片上，在避光的条件下染色30分钟。(7)DAPI染细胞核15秒，PBS溶液洗涤3次。(8)滴加防荧光淬灭液并盖上盖玻片，在荧光正置显微镜下察看标本并扫描图像。

6.2划痕愈合实验 

细胞划痕实验参照Xu,J.等(Xu J,Li X,Yang H,et al.SIN1promotes invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by facilitating epithelial-mesenchymal transition.Cancer,2013,119:2247-2257.的实验方法进行，并根据实验要求进行了相应的调整，简要步骤如下：(1)细胞进入对数生长期后，消化、稀释并计数，吸取约5×10⁵个细胞加入到无菌六孔培养板中(NEST，无锡，中国)，然后将其放置在细胞培养箱中，当达到90％的细胞覆盖率时开展划痕实验。(2)将培养皿中的培基完全吸掉后，用Tip头在培养皿中轻轻的快速划痕，注意不要划伤底部，然后用PBS缓冲液清洗细胞数次，最后加入2ml细胞完全培养基。(3)将培养板放于倒置显微镜下观察并拍照，24小时和48小时再次观察并拍照。根据两组细胞划痕的愈合率来进行统计分析。

6.3Transwell小室侵袭实验 

侵袭小室实验参照Xu,J.等(Xu J,Li X,Yang H,et al.SIN1promotes invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by facilitating epithelial-mesenchymal transition.Cancer,2013,119:2247-2257.)的实验方法进行，简要步骤如下：(1)将Matrigel胶(BD，Franklin Lakes，NJ)放于冰上缓慢融化，Matrigel胶和PBS溶液按1:4混合，将20μl稀释后的Matrigel胶加入到Transwell板(Corning，NY，USA)的上室中，轻轻摇匀后放到细胞培养箱中培养24小时。(2)在下室中加入600μl的完全培养基，并把Transwell小室放于其中，然后将培养板放于细胞培养箱中水化15分钟。(3)在Transwell小室中加入2×105个细胞并添加200μl不含胎牛血清的细胞培养基，在细胞培养箱中放置24小时。(4)24小时后用棉团把上室内部的细胞和培养基擦掉，然后放在冰甲醇中浸没10分钟。(5)将Tranwell小室倒扣在桌面上并在上面滴一滴结晶紫溶液，染色15分钟。(6)15分钟后用蒸馏水洗掉结晶紫溶液，干燥后放于倒置显微镜下观察。(7)在100倍显微镜下计数各组穿过的细胞数目，进行统计分析。7.裸鼠体内成瘤实验

7.1裸鼠肝癌细胞皮下成瘤实验

BALB/c免疫缺陷鼠购买自长沙景达实验动物公司，并在中南大学动物学部SPF级动物实验室中喂养。参照Yang,H.等(Yang H,Fang F,Chang R,Yang L.MicroRNA-140-5p suppresses tumor growth and metastasis by targeting transforming growth factor beta receptor 1and fibroblast  growth factor 9in hepatocellular carcinoma.Hepatology,2013,58:205-217.)等的试验方法进行如下操作：将状态良好的细胞用胰酶消化下来后用生理盐水制成悬浮液，并将细胞的浓度调整至5×10⁷/ml。裸鼠皮下瘤采取皮下注射肿瘤细胞方法成瘤，注射部位选取左腹股沟，注射量为0.1ml(约5×10⁶细胞)，接种时由裸鼠体侧腰部稍靠下的部位进针，要保证与接种点的距离小于针头的长度，向尾部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头到达接种位点时注射，可看到鼓起的小包，退出针头。从第二天开始通过每天测量皮下瘤的长径和短径来比较两组皮下瘤生长速度的差异；一个月后待皮下瘤长到一定体积，将裸鼠用颈椎脱位法处死，取出皮下瘤并拍照，用游标卡尺测量皮下瘤的长径和短径。皮下瘤体积的计算公式为：体积(mm³)＝(长径(mm)×短径(mm)²)/2。

7.2裸鼠肝癌细胞肝脏原位成瘤实验

原位成瘤实验方法参照Yang,H.等(Yang H,Fang F,Chang R,Yang L.MicroRNA-140-5p suppresses tumor growth and metastasis by targeting transforming growth factor beta receptor 1and fibroblast growth factor 9in hepatocellular carcinoma.Hepatology,2013,58:205-217.的方法。将7.1的皮下瘤分组取出后生理盐水浸泡，用手术刀片切割成约1mm³的小块。采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，每只裸鼠约注射60μl。麻醉后，用碘伏棉球擦拭消毒裸鼠胸腹部3次，切开剑突左侧皮肤，再横向剪开腹壁肌层及腹膜层，显露肝脏，眼科剪将左肝被膜剪开，将皮下瘤小块塞入肝被膜下，并用明胶海绵压迫止血，缝线关闭腹腔。种植2个月后，将裸鼠用颈椎脱位法处死，完整取出裸鼠的肝脏和肺脏，将裸鼠的肝脏分组观察并拍照，并观察有无肉眼可见转移灶。然后采用4％甲醛浸泡所取下来的肝脏和肺脏。将裸鼠肝脏和肺脏石蜡包埋后，用切片机切成厚度约4μm的切片，HE染色后显微镜下观察裸鼠肝脏和肺脏内的有无转移灶。

上述各实验的实验结果及其分析如下：

1.ACTL6A信使RNA和蛋白在肝癌细胞和肝癌组织中呈显著高表达，且与侵袭转移潜能密切相关。

首先采用实时定量PCR方法检测ACTL6A在HCC细胞系中ACTL6A信使RNA的表达，结果发现ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系中表达较L02细胞中表达明显增高；且其在高侵袭转移能力的肝癌细胞系HCCLM3、MHCC97-H等中的表达水平也明显高于低侵袭转移能力的肝癌细胞系SMMC7721、PLC/PRF5等，RT-PCR检测也得到了一致的结果，由此可见ACTL6A与肝癌细胞系的侵袭转移能力关系密切。同时，我们采用Western-bolt方法检测ACTL6A蛋白在肝癌细胞系中的表达，与实时定量PCR结果完全一致，详见图1A1，A2，D1。图1中的A1:实时定量PCR(实时定量荧光PCR，简称实时定量PCR)显示ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系(PLC/PRF5，SMMC7721，HepG2，Hep3B，Huh7，MHCC97-L，MHCC97-H，HCCLM3)中较L02细胞相对高表达。参见图1中的A2，RT-PCR同样显示ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系中表达较L02中的表达增高，且在高转移潜能的细胞系Hep3B，MHCC97-H，HCCLM3中表达较低转移潜能细胞系PLC/PRF5，SMMC7721，HepG2 中的高；图1中的D1Western-blot(蛋白质印记法)显示ACTL6A基因的蛋白表达在各肝癌细胞系中的表达较L02细胞中的高。

接着我们检测ACTL6A在新鲜冰冻的肝癌组织(T)及配对的邻近非肿瘤正常肝组织(ANLT)中的表达，实时定量PCR检测发现ACTL6A信使RNA在肝癌组织中较邻近非肿瘤正常肝组织中表达明显增高，Western-bolt检测发现ACTL6A蛋白表达在肝癌组织中亦明显较邻近非肿瘤正常肝组织中表达增高，详见图1B1，B2，D2。图1中的B1：实时定量PCR显示ACTL6A信使RNA在30对肝癌组织(T)中的表达较配对的邻近非肿瘤肝组织(ANLT)中表达明显增高；图1中的B2：RT-PCR检测结果显示肝血管瘤肝组织(L495)与4对肝癌组织(T)和与T配对的邻近非肿瘤肝组织(ANLT)中ACTL6A信使RNA在肝癌组织中的表达较肝组织及配对的ANLT中的表达明显增高；图1中的D2显示肝癌组织中ACTL6A基因的蛋白表达较肝组织及与肝组织配对的ANLT中的表达明显增高。

同时，根据不同临床类型的肝癌进行ACTL6A的检测，发现结节性肝癌中ACTL6A信使RNA的表达水平明显高于孤立性大肝癌和小肝癌，详见图1C。图1中C：实时定量PCR显示ACTL6A信使RNA的表达在结节性肝癌中较该基因在孤立性大肝癌和小肝癌中的表达均明显增高。

2.ACTL6A高表达与不良临床病理特征及预后密切相关

进一步采用免疫组化法检测HCC组织中ACTL6A蛋白的表达，结果显示，ACTL6A蛋白在HCC组织中高表达，而癌旁肝组织中则未见明显表达，详见图2A1。参见图2A1可见免疫组化染色显示ACTL6A信使RNA在肝癌组织中表达明显高于相应癌旁肝组织。

进一步分层研究我们发现小肝癌组和孤立性大肝癌组ACTL6A的高表达率相近，但二者均显著低于结节性肝癌组，详见图2A2。图2A2：免疫组化染色显示ACTL6A在邻近非肿瘤肝组织、无转移肝癌组织和有转移肝癌组织中表达呈现逐渐增高趋势。

统计分析ACTL6A的高低表达与HCC患者临床病理特征的关系发现其与患者血清甲胎蛋白水平，肿瘤结节数目，肿瘤包膜，Edmondson-Steiner分级，静脉浸润，TNM分期和复发明显相关，详见表1。

表1.ACTL6A表达水平与肝癌临床病理特征的相关性

注：不包括肝功能分级为Child-Pugh C级的患者。P＜0.05结果有显著性差异。ACTL6A低表达定义为:免疫组化评分为0-1；ACTL6A高表达定义为:免疫组化评分为2～4。

生存分析发现ACTL6A高表达HCC患者的总生存时间及无瘤生存时间均明显短于ACTL6A低表达者(详见图2B1，B2)，且根据不同临床类型的肝癌分层分析发现ACTL6A高表达小肝癌、孤立性大肝癌和结节性肝癌患者的总生存时间及无瘤生存时间均分别明显短于ACTL6A低表达者(详见图2C1，C2，D1，D2，E1，E2)。图2B1：Kaplan-meier法绘制的K-m曲线生存分析显示ACTL6A高表达肝癌患者的总生存时间明显短于低表达的患者，图2B2显示ACTL6A高表达肝癌患者的无瘤生存时间也明显短于低表达患者。参见图2中的C1和C2：根据肝癌临床类型分层分析显示ACTL6A高表达的小肝癌患者总生存时间(C1)和无瘤生存时间(C2)明显短于低表达患者。图2中D1和D2图：ACTL6A高表达的孤立性大肝癌患者总生存时间(D1)和无瘤生存时间(D2)明显短于低表达患者；图2中E1和E2：ACTL6A高表达的结节性肝癌患者总生存时间(E1)和无瘤生存时间(E2)亦明显短于低表达患者。

单多因素Cox比例风险回归模型分析发现ACTL6A的高表达是HCC总生存时间和无瘤生存时间的独立危险预后因素，详见表2，表3。

表2.肝癌总生存率的单因素及多因素cox回归分析

P＜0.05结果有显著性差异。HR,风险比；CI,可信区间。

表3.肝癌无瘤生存率的单因素及多因素cox回归分析

P＜0.05结果有显著性差异。

综合免疫组化与临床病理特征及预后的研究，提示ACTL6A高表达是肝细胞癌不良临床类型及不良预后的重要标志，其可能促进肝癌袭转移及复发。

3.体外实验中ACTL6A过表达可促进肝癌细胞侵袭转移，敲除ACTL6A可抑制肝癌细胞侵袭转移

为研究ACTL6A如何调控肝癌侵袭转移，首先根据ACTL6A表达水平不同，选择ACTL6A低表达的PLC/PRF5细胞系进行ACTL6A质粒过表达慢病毒转染，构建ACTL6A过表达的PLC/PRF5细胞株；选择ACTL6A高表达的Hep3B细胞系进行ACTL6A短发夹RNA敲除质粒慢病毒转染，构建ACTL6A低表达的Hep3B细胞株；同时分别构建相应的空质粒病毒转染株做为对照组，详见图3。图3中可见荧光显微镜拍照可见ACTL6A过表达和ACTL6A敲除的3个序列(ACTL6A-敲除-1、ACTL6A-敲除-2和ACTL6A-敲除-3)相比肝癌细胞转染效率均高于70％。

转染效率经实时定量PCR和Western-blot验证发现PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞较PLC/PRF5对照组细胞的ACTL6A信使RNA和ACTL6A蛋白表达增高2倍以上；而敲除序列经实时定量PCR和Western-blot验证发现shACTL6A-3的效率最高，因此选择该序列进行下一步实验，详见图4。参见图4中的A图为实时定量PCR证实PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞的ACTL6A信使RNA表达量较对照组PLC/PRF5对照组细胞超出2倍以上。参见图4中的B图实时定量PCR验证各敲除序列的Hep3B敲除ACTL6A细胞与对照组Hep3B对照组细胞中ACTL6A信使RNA表达量的差异，其中Hep3B敲除ACTL6A-3细胞敲除效率最高。参见图4中的C图通过Western-blot验证ACTL6A蛋白在各不同转染处理的细胞中表达情况，结果与实时定量PCR一致，后续体内外功能学实验选取PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞和Hep3B敲除ACTL6A-3细胞及相应对照组进行研究。

构建的细胞株分别进行细胞骨架免疫荧光实验、划痕愈合实验和transwell侵袭小室实验以检测ACTL6A过表达/敲除对细胞运动、迁移和侵袭能力的影响。

采用了罗丹明鬼笔环肽标记肝癌细胞的肌动蛋白以此观察细胞骨架形态，对比PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞和PLC/PRF5对照组细胞骨架形态的差异。在400倍荧光正置显微镜下看以清楚地观察到相较于PLC/PRF5对照组细胞，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞骨架亮度更强，细胞的形态舒展呈狭长型，并伸出更多的伪足，说明细胞运动性增强。而对比Hep3B敲除ACTL6A细胞和Hep3B对照组细胞，发现Hep3B敲除ACTL6A细胞形态较Hep3B对照组细胞呈卵圆形，伪足等明显减少，说明细胞运动性可能降低，详见图5A1，A2。参见图5中的A1和A2：细胞骨架免疫荧光实验显示过表达ACTL6A质粒的PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞形态较对照组PLC/PRF5对照组明显变得舒展、细长，并有小伪足(A1)；敲除ACTL6A的Hep3B敲除ACTL6A细胞形态较对照组Hep3B对照组细胞明显呈鹅卵石样改变，细胞纤维丝减少、密度降低，突触减少(A2)。

细胞划痕愈合实验则显示PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于PLC/PRF5对照组细胞的愈合能力明显增强，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显增加，提示转染后细胞运动、迁移能力明显增加，详见图5B1，B2。参见图5中的图B1和图B2：划痕愈合实验显示过表达ACTL6A质粒的PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞迁移能力较PLC/PRF5对照组细胞明显增强。而Hep3B敲除ACTL6A细胞的愈合能力较Hep3B对照组细胞明显减弱，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显减少，提示提示敲除ACTL6A后细胞运动、迁移能力明显减弱，详见图5C1，C2。参见图5中的图C1和图C2：敲除ACTL6A的Hep3B敲除ACTL6A细胞迁移能力较Hep3B对照组细胞明显减弱。

细胞划痕愈合实验则显示PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于PLC/PRF5对照组细胞的愈合能力明显增强，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显增加，提示转染后细胞运动、迁移能力明显增加，详见图5B1，B2。参见图5中的图B1和图B2：划痕愈合实验显示过表达ACTL6A质粒的PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞迁移能力较PLC/PRF5对照组细胞明显增强。而Hep3B敲除ACTL6A细胞的愈合能力较Hep3B对照组细胞明显减弱，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显减少，提示提示敲除ACTL6A后细胞运动、迁移能力明显减弱，详见图5C1，C2。参见图5中的图C1和图C2：敲除ACTL6A的Hep3B敲除ACTL6A细胞迁移能力较Hep3B对照组细胞明显减弱。

Transwell侵袭小室实验表明PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于PLC/PRF5对照组细胞的侵袭能力明显增加，结果如图5D1-D2所示。参见图5中的D1和D2：Transwell侵袭小室实验显示过表达ACTL6A质粒的PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞侵袭能力较PLC/PRF5对照组细胞明显增强；敲除ACTL6A的Hep3B敲除ACTL6A细胞侵袭能力较Hep3B对照组细胞明显减弱。说明24小时PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞穿过小室的数目要明显多于PLC/PRF5对照组细胞，提示转染ACTL6A后细胞的侵袭能力明显增强。而Hep3B敲除ACTL6A细胞的侵袭能力较Hep3B对照组细胞明显减弱，如图5D1-D2所示，24小时Hep3B敲除ACTL6A细胞穿过小室的数目要明显少于Hep3B对照组细胞，提示敲除ACTL6A后细胞的侵袭能力明显减弱。

综合细胞骨架免疫荧光、划痕愈合和Transwell侵袭小室实验结果，说明ACTL6A过表达能明显促进肝癌细胞的运动、迁移和侵袭能力，而敲除ACTL6A能减弱肝癌细胞的运动、迁移和侵袭能力。

4.裸鼠体内实验ACTL6A过表达可促进肝癌细胞生长和转移

将PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞和PLC/PRF5对照组细胞分别注射到裸鼠左腹股沟皮下，每组各6只，一个月后将裸鼠处死，取出皮下瘤拍照并测量皮下瘤体积，结果列于图6中的A1～A3中。参见图6中的A1图～A3图：裸鼠皮下成瘤实验显示PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组PLC/PRF5对照组细胞皮下瘤体积大(A1图，A2图)；皮下瘤生长曲线亦提示PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞皮下瘤形成速度快于PLC/PRF5对照组细胞(A3图)。 如图6A1～A2显示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞组所行成的皮下瘤体积明显大于PLC/PRF5对照组细胞所形成的皮下瘤体积。如图6A3所示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞组皮下瘤的生长曲线也明显快于LC/PRF5^Control细胞组。

进一步的肝脏原位种植成瘤实验中将各组皮下瘤切成约1mm³的小块后种植于裸鼠肝被膜下，1个月后分别比较各组原位肝肿瘤体积的差异，结果列于图6中的B1～B3中。参见图6中的B1～B3图：裸鼠肝脏原位成瘤实验显示PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞肝脏原位成瘤体积明显较对照组PLC/PRF5对照组细胞原位瘤体积大，且差异有统计学意义；肝脏原位瘤免疫组织化学提示PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞原位瘤内ACTL6A呈细胞核内高表达，而对照组PLC/PRF5对照组内低表达(B3)。如图6B1-B3，结果显示PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞组所行成的肝脏肿瘤体积明显大于PLC/PRF5对照组细胞所形成的肝脏肿瘤。皮下成瘤及原位成瘤的实验结果充分证明，在肝癌细胞中过表达ACTL6A在体内同样可以明显提高肝癌的生长能力。在获取肝脏原位肿瘤标本的同时，我们也检测了肿瘤的肝内转移和肺转移情况，结果列于图6中的C1和C2以及D1和D2中。参见图6中的C1和C2：肝脏原位成瘤照片显示ACTL6A高表达的PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞构建的原位瘤较PLC/PRF5对照组细胞易发生肝内转移；参见图6中的D1和D2：肺切片HE染色显示ACTL6A高表达的PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞较PLC/PRF5对照组细胞构建的肝癌原位瘤容易发生肺转移。如图6C1-C2，D1-D2所示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞的肝内转移和肺转移明显高于PLC/PRF5对照组细胞组，提示过表达ACTL6A能在体内促进肝癌的侵袭和转移，这一研究结果进一步提示ACTL6A可能成为治疗肝癌侵袭转移的重要生物靶点。

由以上实验结果及其分析可知ACTL6A在肝癌细胞系和肝癌组织中的高表达情况及与侵袭转移潜能相关；临床病理特征及生存分析发现ACTL6A高表达患者具有不良临床病理因素及不良生存时间和预后；细胞功能学实验亦提示了ACTL6A高表达可促进肝癌细胞运动、迁移、侵袭和转移潜能，抑制ACTL6A可抑制肝癌细胞运动、侵袭和转移潜能。体内实验亦证实过表达ACTL6A能促进肝癌生长。因此，ACTL6A可作为肝癌生物靶向治疗的一个重要靶点。我们设计不同靶向给药系统进行实验，以了解靶向抑制ACTL6A治疗肝癌的潜能。可将该基因通过基因给药的方式，调节该基因控制的蛋白在细胞核内的表达量，从而控制患者的预后情况，防止肝癌细胞发生EMT-MET过程导致转移。显然此处的给药方式可以为各种可以控制细胞核中相关蛋白表达量的给药方式。举例来说可以为靶向敲除ACTL6A质粒可以经慢病毒载体包装后进行静脉注射给药，或经电荷翻转型药物载体将药物输送到细胞核中。优选采用上述两种方法给药。采用上述两种方法给药可以提高受体对药物的敏感性，保证疗效。尤其优选为经电荷翻转型药物载体将药物输送到细胞核中。由于该给药方法为将该基因直接携带至细胞核中ACTL6A基因处给药，药效持久可以避免耐药性的发生。

本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该药物组合物主要作用为通过向癌细胞核给药，从而抑制由ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式并不限于以下两种，也可以为其他能实现输送作用的给药方式。优选该药物组合物中包含敲除了表达ACTL6A基因的慢病毒载体。

具体给药方式说明如下：

1.慢病毒shRNA敲除ACTL6A质粒载体尾静脉注射给药。

载体：GV248，元件顺序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，敲除序列5’-GGGATAGTTTCCAAGCTAT-3’。shACTL6A质粒经慢病毒转染后进入宿主细胞，在宿主细胞内经转录翻译，抑制ACTL6A蛋白的表达，从而在体内发挥作用。该方法在最近如Ambrogio,C.等(Lentiviral-based approach for the validation of cancer therapeutic targets in vivo.Biotechniques,2014,57(4):179,181-187)的研究中被采用静脉注射法进行体内实验，获得了良好的体内治疗效果。慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒，经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达，从而达到良好的基因治疗效果。因慢病毒作用时间长且滴度稳定，裸鼠成瘤一般在1-2个月以内，因此可在成瘤周期的第一周内仅注射一次即可。

给药方法：裸鼠尾静脉注射方法：1.使用尾静脉注射架将裸鼠固定好，将尾巴拉直，绷紧；2.用酒精棉球擦拭尾巴，使血管扩张，有利于注射，注射状态为尾巴发白，紧靠白色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉；3.用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾巴固定；4.注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，一般选择距裸鼠尾尖1/4或1/3处进针，使用1ml胰岛素注射器注射，进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，从中指及无名指与拇指接触处稍上方进针；5.针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，推注时无阻力则成功。

由上可见，采用上述敲除质粒方法给药时ACTL6A基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示的基因序列疗效最优。其他a)序列表中SEQ ID NO.1所示的基因序列；b)序列表中SEQ ID NO.2所示的基因序列；虽然也对肝癌有疗效，但效果相较该基因序列稍微差一些。

本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该药物组合物主要作用为通过向癌细胞核给药，从而抑制由ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式并不限于以下两种，也可以为其他能实现输送作用的给药方式。优选该药物组合物中所述shACTL6A与递送载体相连接后用于所述药物组合物中。

2.经电荷翻转型药物载体给药

阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)和聚L赖氨酸(polylysine,PLL)以及聚酰胺胺(PAMAM)树枝状大分子等被广泛地用来作为基因载体。实验表明它们能够进入细胞核内，也能够将生物活性物质输送到细胞核中。然而，这些带正电荷的聚合物会被网状内皮系统(reticuloendothelialsystem,RES)识别而很快被清除出血液循环系统，因此，理想的方法是对这些阳离子聚合物进行可逆修饰，使其在血液中带负电荷，以抑制它们与正常细胞和组织的作用，而到达肿瘤组织或癌细胞内后去掉这些修饰而再生原来的阳离子聚合物，重新获得细胞核定位的能力。实体瘤组织间液和细胞的溶酶体呈酸性，因此可以应用肿瘤组织和细胞中的酸性环境作为信号来触发阳离子保护基团的离去。根据癌组织内容易产生代谢性酸中毒导 致肿瘤细胞内PH低于7.4，因此有关利用pH响应的载体输送抗癌药物已有大量的报道。这些高分子载体能够在细胞间质和溶酶体的酸性pH刺激下将药物释放在细胞间隙或溶酶体中，但是无法将药物输送至细胞核中。羧基酰胺基团具有在酸性条件下自催化水解的性质。因此申有青(电荷翻转型药物载体用于肿瘤细胞核靶向药物输送的研究。高分子通报,2010,(12):22-29。)等设计了对胺基进行可逆保护，用1，2环己二酸酐与聚己内酯-聚乙烯亚胺的嵌段共聚物(PCLbPEI)的PEI段反应，将PEI的胺基酰胺化为羧基酰胺，得到带负电荷的酰胺化PEI(PEI/amide)。根据这一理论将靶向敲除shACTL6A治疗进一步引入到PEI/amide上。在正常生理条件下,双亲性的PCLPEI/amide-shACTL6A自组装成为带负电的纳米颗粒；在pH小于6时，羧基酰胺基团自催化水解，重新生成胺基，使得载体带正电荷。而在肿瘤组织、内涵体或溶酶体中显正电性，使纳米颗粒在细胞内能够成功地实现电荷翻转。根据这一研究得到了得到不同结构的羧基酰胺化的PLL，使原来阳离子聚合物PLL呈负电性，避免了伯胺基团带来的系统生物毒性。

因此，DNA毒化物类抗癌药物可经静脉注射或口服吸收入血被直接输送到它们在细胞核中的靶点周围，避开了癌细胞在细胞膜和细胞浆中多种药耐药机制，大大提高了药物的利用度及疗效。因此，可以利用电荷翻转载体进行肿瘤细胞核靶向shACTL6A给药。以ACTL6A-RNAi(26884-1)为靶序列，按照短发夹RNA设计原理，构建得到的ACTL6A短发夹RNA质粒。

实施例

实施例1

将以慢病毒为载体，敲除质粒中的ACTL6A后进行动物体给药过程及结果如下：

将Hep3B敲除ACTL6A细胞和Hep3B对照组细胞分别约5×10⁶个/只注射到裸鼠左腹股沟皮下组织后，所得结果列于图7A中。参见图7中的A图：裸鼠皮下成瘤实验显示敲除ACTL6A的Hep3B敲除ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组Hep3B对照组细胞皮下成瘤体积小。而如图7A显示，Hep3B敲除ACTL6A细胞组所行成的皮下瘤体积明显小于Hep3B对照组细胞所形成的皮下瘤体积，进行体积的测量后成组比较亦得出类似结果，所得结果列于图7B中。参见图7中的B图：统计分析两组皮下瘤大小可见Hep3B敲除ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组Hep3B对照组细胞皮下成瘤体积小有统计学差异。

实施例2

将经电荷翻转型药物载体PCL PEI/amide作为载体携带shACTL6A后进行动物体给药后，实验过程及所得结果如下：

肝脏原位种植成瘤实验所得结果如图8中的A图和B图所示，参见图8中的A图：肝脏原位成瘤图片显示Hep3B敲除ACTL6A细胞肝脏原位成瘤体积明显较对照组Hep3B对照组细胞原位瘤体积小。参见图8中的B：两组体积差异有统计学意义。如图8A，B显示，Hep3B敲除ACTL6A细胞组所行成的肝脏肿瘤体积明显小于Hep3B对照组细胞所形成的肝脏肿瘤。检测肝脏原位成瘤的肝内转移灶及肺转移灶情况发现，Hep3B敲除ACTL6A细胞组的肝转移 及肺转移率明显低于相应的Hep3B对照组细胞组，结果参见图8中的C和D。参见图8中的C：敲除ACTL6A的Hep3B对照组细胞构建的原位瘤较Hep3B敲除ACTL6A细胞易发生肝内转移。参见图8中的D：敲除ACTL6A的Hep3B对照组细胞构建的原位瘤较Hep3B敲除ACTL6A细胞易发生肺转移。

由实施例1～2可知，通过上述两种给药方式给药后，小鼠体内的癌细胞转移受到有效抑制，抑制肝癌原位瘤生长和转移。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。