一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用

摘要

本发明涉及猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用，生物技术领域。本发明属于公开的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201542，本发明还公开了利用所述Marc-145细胞悬浮适应株培养蓝耳病病毒的方法。本发明提供的Marc-145细胞悬浮适应株实现了Marc-145细胞在培养基中的全悬浮培养，因而采用本发明的Marc-145细胞悬浮适应株生产蓝耳病病毒，在工业生产中易于用生物反应器逐级放大，实现蓝耳病疫苗大批量生产，相较于现有的转瓶、载体悬浮培养技术，本发明简化了生产工艺，缩短生产周期，降低生产成本，进一步提高了蓝耳病疫苗的质量和产量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用，属于生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种利用生物反应器全悬浮Marc-145细胞生产蓝耳病病毒的方法。

背景技术

Marc-145细胞即猴胚胎肾上皮细胞，来源于猴肾细胞，是母细胞（MA104细胞）的克隆株，贴壁依赖性生长，可连续传代培养，无致瘤性，该细胞株经过数次悬浮驯化得到悬浮适应株，可不依赖于载体悬浮生长。该细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）特别敏感，目前广泛用于蓝耳病疫苗的生产。

因原始Marc-145细胞贴壁依赖性生长，所以目前蓝耳病疫苗的生产主要采用传统转瓶工艺，疫苗抗原制备的每个生产批次都需要几百甚至上千个转瓶，而每个转瓶是单独的培养操作单元，在一个生产周期中每个转瓶要经过细胞接种、病毒接种、病毒收获三次开口机会，这不仅劳动强度大污染机率高，而且因为每瓶细胞的质量、病毒含量不尽相同，使得疫苗质量不稳定，批间差异大；另外，采用细胞转瓶培养工艺，不仅生产效率低，还易污染，病毒滴度不稳定，这种传统工艺已无法满足规模化工业化生产需求，逐渐被自动化生产替代。

因Marc-145细胞贴壁依赖性生长，目前蓝耳疫苗的自动化生产研究主要是载体依赖性细胞悬浮培养，专利公开号为CN102002482B“猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法”与专利公开号为CN102552896B“一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法”的专利均公开了纸片载体细胞培养生产蓝耳病病毒的方法；专利CN102038942B“应用生物反应器工业化生产蓝耳病疫苗的方法”公开了利用微载体细胞悬浮培养方法生产蓝耳病病毒的方法；微载体、纸片载体培养虽然自动化程度高，但细胞培养本质上还是贴壁培养，载体成本相对高，大多数是一次性使用，而且细胞生长受载体等众多因素限制不能最大化生长，细胞密度提高幅度有限，尤其是在工业生产放大方面载体悬浮培养一般培养体积都在300升以下，这种先天缺陷限制了该技术的大规模化应用。

发明内容

本发明为解决上述现有培养工艺的缺陷，提供一种生产成本低、可以规模化放大培养的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用。

本发明采用以下技术方案解决现有技术中存在的问题：

一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，命名为Marc-145S，已于2015年4月22日在保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201542。

猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在培养蓝耳病病毒中的应用。

猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在生产蓝耳病疫苗中的应用。

一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病毒的方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株传代培养，然后接种到生物反应器中悬浮培养，得到Marc-145细胞悬浮培养液；

（2）当Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度达到2-5×10⁶个/ml时，接种蓝耳病病毒；

（3）继续培养蓝耳病病毒，当活细胞密度低于0.5×10⁶个/ml时收获病毒液。

步骤（1）中获得Marc-145细胞悬浮培养液包括以下步骤：

①取液氮冻存的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，快速融化后加入盛有营养液的摇瓶中，传代放大培养；

②将步骤①中放大培养的Marc-145细胞悬浮适应株稀释至0.5×10⁶个/ml的密度，接种入生物反应器，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力。

步骤（2）中接种蓝耳病毒：Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度大于3.0×10⁶个/ml， 细胞活力大于90%时，利用旋转过滤器截留细胞，更换20-50%的营养液，最终为含0.5～2.0%新生牛血清的营养液，将蓝耳病病毒接种入生物反应器中，接种剂量为培养基终体积的1.0～5.0%。

所述的蓝耳病病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度≥10^7.0TCID₅₀/ml。

 所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。

与现有技术相比，本发明公开的Marc-145悬浮适应株生产蓝耳病疫苗方法自动化程度高，不需要载体介入，无需细胞胰酶消化传代，容易规模化放大，本发明简化蓝耳病疫苗的生产工艺,降低其生产成本,提高了疫苗的质量，解决批间差异问题，拥有无可比拟的工业化优势。

附图说明

猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，命名为Marc-145S，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年4月22日，保藏编号为CCTCC NO：C201542。

图1为Marc-145细胞悬浮生长曲线图。

图2 为Marc-145细胞接种蓝耳病毒前显微图片(100倍放大)。

图3 为Marc-145细胞接种蓝耳病毒后显微图片(100倍放大)。

具体实施方式

以下是本发明具体的实施方案，以进一步阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实验涉及的主要生物材料和设备

猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月22日，保藏编号为CCTCC NO：C201542。

细胞生长培养基：GRH公司M3专用培养基，添加3%新生牛血清，细胞生长培养基即是Marc-145细胞悬浮株摇瓶培养与生物反应器全悬浮培养所用的营养液；

病毒培养维持培养基：GRH公司M3专用培养基，添加１%新生牛血清，病毒培养维持培养基即是全悬浮培养的Marc-145细胞培养蓝耳病毒所用的营养液；

蓝耳病病毒：蓝耳病病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度大于等于10^7.0TCID₅₀/ml，本实验中选用TJM-92株，为市售商品活疫苗分离；

生物反应器：美国NBS 14升生物反应器。

实施例1   猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株扩增培养

将保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201542的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株传代培养，然后接种到生物反应器中悬浮培养，得到Marc-145细胞悬浮培养液，具体步骤如下：

①取液氮冻存的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，快速融化后加入盛有营养液的摇瓶中，于36～37℃培养60～72h，按照1:3~1:5的比例传代放大培养；

②将步骤①中放大培养的Marc-145细胞悬浮适应株稀释至0.5×10⁶个/ml的密度，接种入生物反应器，培养温度为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40%～70%，细胞生长曲线如图1所示；

③生物反应器中细胞密度的测定：用生物反应器连续培养三个批次Marc-145细胞，在培养的第72小时采样，细胞离心后用胰酶消化，用台盼兰染色法检测细胞密度，实验结果如表1所示。

表1

    实施例2   不同接种剂量培养蓝耳病病毒的滴度比较

用5个500ml摇瓶培养Marc-145悬浮细胞，接种细胞均为0.58×10⁶个/ml，在相同培养条件下培养72小时，细胞密度均扩增到大于3×10⁶个/ml时，按照培养基终体积的1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%接种蓝耳病毒TJM-92株，活细胞密度低于0.5×10⁶个/ml时收获病毒。按照常规方法测定病毒滴度（TCID₅₀/ml），结果见表2。

表2

实施例3   不同培养方式培养蓝耳病病毒滴度的比较

选用生长良好的贴壁Marc-145细胞2个转瓶，选用2个500ml摇瓶培养Marc-145悬浮细胞，待转瓶细胞长满单层，摇瓶细胞密度大于3×10⁶个/ml后，按照培养基终体积的3.0%接种蓝耳病毒TJM-92株，待转瓶细胞CPE达70%时，摇瓶细胞密度小于0.5×10⁶个/ml时分别收获病毒液，冻融2次后，测定病毒滴度（TCID₅₀/ml），结果见表3所示。

表3

实施例4   全悬浮Marc-145细胞培养蓝耳病病毒

当生物反应器中悬浮培养的Marc-145细胞密度扩增到2-5×10⁶个/ml时，接种蓝耳病病毒，具体步骤为：Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度大于3.0×10⁶个/ml， 细胞活力大于90%时，利用旋转过滤器截留细胞，更换反应器中20-50%的营养液，最终为含0.5～2.0%新生牛血清的营养液，将蓝耳病毒接种入生物反应器中，接种剂量为培养基终体积的1.0～5.0%，所述蓝耳病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度≥10^7.0TCID₅₀/ml。在35℃～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40%～70%培养蓝耳病病毒36～72h，活细胞密度低于0.5×10⁶个/ml时收获病毒。Marc-145细胞接种蓝耳病毒前后的显微图片如图2、图3所示，从图中可以看出接毒后的细胞密度降低幅度大，细胞病变明显；3个批次的培养滴度见表4。

表4

实施例5   蓝耳病疫苗的制备

按照实施例4连续制备3批次蓝耳病病毒液，收获病毒液作为制苗用抗原液，测定病毒含量（TCID₅₀/ml），同时抽样参照《高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-F92株）》质量标准进行半成品检验，合格后按一定比例稀释并加入20%耐热冻干保护剂，混匀后定量分装，于冻干机内进行冷冻真空干燥。疫苗成品参照我国现行《高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-F92株）》质量标准进行检验，各项指标均合格。