一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方法

摘要

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方法。该单细胞培养方法，包括：步骤A：获得成纤维细胞悬液和饲养层细胞；步骤B：将饲养层细胞以微滴形式接种至培养皿，培养至饲养层细胞密度在微滴内100％汇合，获得饲养层细胞微滴；步骤C：将成纤维细胞悬液接种至具有饲养层细胞微滴的培养皿，经细胞培养，获得单细胞克隆。本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆细胞基因组完全一致，有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方法。

背景技术

中国是世界上养猪规模最大的国家，但猪生产水平远低于欧美养猪发达国家。短期内传统的育种手段很难在猪生产性能方面取得大的进展，但是转基因技术打破了远缘有性杂交的束缚，实现了不同物种生物体之间的基因交流，从而可以最大限度的利用和创造遗传变异，改良家畜的性状，创造新的家畜品种转基因动物为猪遗传育种提供了新的技术手段，可大大加速遗传改良的速度，尤其是转基因体细胞核移植技术的出现，为转基因技术在猪改良育种中的应用提供了技术支撑。

猪胎儿成纤维细胞是猪体细胞转基因克隆的重要工具细胞，目前用于猪转基因克隆的胎儿成纤维细胞是原代培养分离的混合胎儿体细胞系。在该混合细胞系中基因组中通过转染随机插入带有筛选标记的外源基因，经过加压筛选获得具有唯一筛选标记的转基因混合细胞。

但是，采用上述混合细胞系经加压筛选获得的细胞具有一定的缺陷：一方面由于加压筛选只能得到具有筛选标记的细胞，与其基因组的均一性无关，再将这些经过随机重组的混合细胞分别通过体细胞核移植技术转入受体卵细胞中进行个体激活发育，得到的个体将是具有不同重组位点的转基因猪。另一方面定点转基因的脱靶效应会导致即使基因组完全一致的细胞，产生多种转基因的可能，而这种混合细胞的体细胞克隆产生的后代将严重不均一，可能有这样或者那样的表型，甚至达不到转基因的效果，没有任何新表型。

因此，建立一种有效的胎儿成纤维细胞单细胞培养技术将有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种成纤维细胞的单细胞培养方法。该单细胞培养方法获得的克隆细胞基因组完全一致，有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立；本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆细胞无需进行加压筛选，因此，可简化转基因动物的生产工作。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种成纤维细胞的单细胞培养方法，包括如下步骤：

步骤A：获得成纤维细胞悬液和饲养层细胞；

步骤B：将饲养层细胞以微滴形式接种至培养皿，培养至饲养层细胞密度在微滴内100％汇合，获得饲养层细胞微滴；

步骤C：将成纤维细胞悬液接种至具有饲养层细胞微滴的培养皿，经细胞培养，获得单细胞克隆。

在本发明中，由于饲养层细胞微滴既能够提供细胞因子，又占用少量培养皿面积，达到了既能给成纤维细胞提供生长所需的良好培养环境，又能保证有足够的空间供成纤维细胞增殖形成独立的优质细胞克隆的目的，从而有利于单细胞克隆的获得，可用于均一、无筛选标记的转基因动物的生产。

作为优选，成纤维细胞悬液的细胞浓度为5～10个/mL。

作为优选，成纤维细胞悬液的接种量为10～15mL/皿。

在本发明提供的一些实施例中，步骤C中细胞培养为38℃、5％CO₂恒温培养8～11天。

作为优选，饲养层细胞的接种量为300～500μL/微滴。

作为优选，饲养层细胞微滴在培养皿中的密度为10～12个/皿。

在本发明提供的一些实施例中，步骤B中饲养层细胞的培养条件为37℃、5％CO₂恒温培养。

作为优选，成纤维细胞为3代以内的成纤维细胞。

在本发明提供的一些实施例中，成纤维细胞为猪胚胎成纤维细胞。但成纤维细胞的来源并非限定于此，其它动物来源的成纤维细胞的单细胞培养同样适用于本发明。

在本发明提供的一些实施例中，饲养层细胞的制备方法为：取胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理2.5h，去除丝裂霉素C，加入胰酶消化液孵育，终止消化，获得饲养层细胞。

本发明提供了一种成纤维细胞的单细胞培养方法。该单细胞培养方法，包括：步骤A：获得成纤维细胞悬液和饲养层细胞；步骤B：将饲养层细胞以微滴形式接种至培养皿，培养至饲养层细胞密度在微滴内100％汇合，获得饲养层细胞微滴；步骤C：将成纤维细胞悬液接种至具有饲养层细胞微滴的培养皿，经细胞培养，获得单细胞克隆。本发明至少具有如下优势之一：

本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆细胞基因组完全一致，有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立；

本发明提供的单细胞培养方法获得的克隆细胞无需进行加压筛选，因此，可简化转基因动物的生产工作。

附图说明

图1示由本发明培养的猪胎儿成纤维细胞单细胞克隆；

图2示定量PCR标准曲线(GFP基因)；

图3示本发明单细胞培养克隆基因组GFP拷贝数与DNA质量的关系；

图4示G418筛选克隆基因组GFP拷贝数与DNA质量的关系。

具体实施方式

本发明公开了一种成纤维细胞的单细胞培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的成纤维细胞的单细胞培养方法中所用材料、试剂和仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1猪胚胎的获得

怀孕30天实验用母猪用戊巴比妥钠耳静脉注射剂量为1.4mL/Kg，先快速注射全剂量的50％，然后缓慢注射，10分钟内注射麻醉，使用新洁尔灭在腹部消毒，然后在腹正中打开切口，用肠钳夹封闭妊娠子宫的两端，子宫内可触及若干个鸡蛋样胚胎。丝用线结扎子宫两端，切断，缝扎子宫残端，缝合线关闭腹腔。在超净工作台中内剖开子宫，取出胚胎，用含1％抗生素的37℃预热的PBS洗涤三遍，置于无菌瓶皿，除去头、四肢及内脏。

实施例2猪胚胎成纤维细胞的分离与培养

将实施例1获得的胚胎组织切成1mm×1mm×1mm大小的碎块，利用灭菌眼科剪将组织剪碎至糊状，将其涂布到细胞培养皿底部，置于38℃、饱和湿度的CO₂培养箱中放置4h后，加入细胞培养液(DMEM+10％胎牛血清+1％双抗+1％非必需氨基酸)，尽量避免组织块漂浮，继续以上述条件进行培养，每隔72h更换培养液一次，在第8天成纤维样细胞开始从组织块孵出。加入37℃的2.5g/L胰蛋白酶，置CO₂培养箱内消化30min。100目筛网过滤，1000rpm离心5min，收集细胞。以PBS液洗涤1次，再用含10％小牛血清的DMEM培养液洗涤2次，在37℃、5％CO₂培养箱中传代培养。原代分离的细胞记录为P0代，按1:4传代后记录P1代，约四天长到90％以上汇合度可再次传代或冻存，下一代为P2代，以此类推。

实施例3饲养层细胞的制备

1)原代小鼠胚胎成纤维细胞分离培养：

选取6-10周龄雌雄鼠1:1合笼，次晨和下午分别查阴栓1次，见阴栓者计为妊娠0.5d。取妊娠12.5-14.5d孕鼠。处死妊娠小鼠，在75％医用酒精中浸两分钟。取出孕鼠，超净台内无菌取出子宫，置于盛有PBS的90mm培养皿中，PBS清洗1次，吸去废液。在体式镜下用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，去除胎鼠头、尾、四肢和内脏，PBS洗涤3次后，将胎体充分剪碎。加入胰酶消化液(0.5g/L胰酶-0.02％EDTA)10mL吹打成混悬液，于37℃消化5min，后加入等量的含体积含10％胎牛血清的DMEM培养液中，转入50mL的离心管，并充分吹打细胞悬液后，1000rpm，离心5min，弃上清。最后加入含体积分数为10％胎牛血清的。用DMEM培养液重悬细胞，室温静置两三分钟，待未剪碎细胞团块完全沉至离心管底，吸取上清细胞悬液至新的50mL离心管中，补充培养基并混悬细胞液，接种至两个新培养瓶中，补充MEF培养基至培养瓶中至细胞悬液为25mL，并将培养瓶移入37℃，体积分数为5％CO₂，恒温培养箱中培养。等细胞贴满瓶底达到90％以上汇合，吸去培养瓶内的培养基，PBS洗涤1次，分别在各培养瓶内加入1mL 0.5g/L胰酶-0.02％EDTA消化液，37℃消化1min，显微镜观察细胞收缩变圆，细胞逐层脱落时加入等量含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移液器充分吹打散细胞，将细胞悬液转入15mL离心管，1000r/min，离心5min，弃上清。加入新鲜的MEF培养基5mL重悬细胞，按1:4传代到新培养瓶，补足MEF培养基，移入37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养。原代分离的细胞记录为P0代，按1:4传代后记录P1代，约四天长到90％以上汇合度可再次传代或冻存，下一代为P2代，以此类推。

2)饲养层细胞的制备：

①取3-5代内长至80％汇合的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，吸去原培养基，加入终浓度为10mg/L丝裂霉素C的MEF培养基6mL至90mm细胞培养皿中处理细胞2.5h。②弃去培养基，每次加5mL PBS洗涤细胞3遍次，完全去除丝裂霉素C，加2mL胰酶消化液，37℃孵育1min后，显微镜观察细胞收缩变圆，细胞逐层脱落时加入等量含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移液器充分吹打散细胞，将细胞悬液转入15mL离心管，1000r/min，离心5min，弃上清。可以大量制备并按标准方法冷冻保存在液氮中。

实施例4猪胎儿成纤维细胞单细胞培养

以300μL的微滴形式接种丝裂霉素处理过的小鼠成纤维细胞(MEF)即饲养层细胞至90mm培养皿(corning costar)，每个大皿加入12个小鼠成纤维细胞微滴，直径约1厘米，置37℃、5％CO₂恒温培养箱培养，贴壁24小时后的饲养细胞密度在微滴范围内达到100％汇合。

饲养细胞完全贴壁后，换新的培养液。取3代以内的猪成纤维细胞，用含20％胎牛血清的高糖DMEM稀释每毫升5个细胞。然后将15mL含有稀释后细胞的培养液，接种至含有饲养层细胞的90mm培养皿。在38℃、5％CO₂恒温培养箱培养。培养8天后每一个单细胞分化长出一组新的克隆细胞，该克隆即为单细胞增殖克隆(图1)。

用倒置显微镜通过调整光照强度和角度，挑选可看到的细胞克隆。用标记笔在培养皿底部相应位置画一个圈圈住该克隆。选择大小比较平均方便分离的克隆。移除培养液，用不含钙镁的PBS冲洗平皿两次，并移除悬浮起来的细胞。用无菌镊子夹起一个克隆环，轻轻的将克隆环底部粘上无菌甘油，然后快速垂直拿起。轻轻的将克隆环放在一个选定的克隆之上，并用镊子稍用力均匀按压，压力不均匀会导致克隆环底部不密封而漏液。在显微镜下确认克隆环的位置在选定的克隆之上，保证在克隆环密闭的区域内没有其他克隆。加0.2mL胰酶(0.25％)到克隆环里。将培养皿在36.5℃孵育5分钟。每隔两三分钟在显微镜下观察一次细胞，细胞开始变圆并脱离培养皿底部。加一两滴培养液到克隆环中，并轻轻用巴氏吸管或移液器吸出细胞。将细胞转移至合适的培养器皿中并加适量的培养液。用12孔或者24孔板，在38℃、5％CO₂恒温培养箱培养。

实施例5猪胎儿成纤维细胞单细胞培养

以400μL的微滴形式接种丝裂霉素处理过的小鼠成纤维细胞(MEF)即饲养层细胞至90mm培养皿(corning costar)，每个大皿加入11个小鼠成纤维细胞微滴，直径约1厘米，置37℃、5％CO₂恒温培养箱培养，贴壁24小时后的饲养细胞密度在微滴范围内达到100％汇合。

饲养细胞完全贴壁后，换新的培养液。取3代以内的猪成纤维细胞，用含20％胎牛血清的高糖DMEM稀释每毫升8个细胞。然后将12mL含有稀释后细胞的培养液，接种至含有饲养层细胞的90mm培养皿。在38℃、5％CO₂恒温培养箱培养。培养10天后每一个单细胞分化长出一组新的克隆细胞，该克隆即为单细胞增殖克隆。

用倒置显微镜通过调整光照强度和角度，挑选可看到的细胞克隆。用标记笔在培养皿底部相应位置画一个圈圈住该克隆。选择大小比较平均方便分离的克隆。移除培养液，用不含钙镁的PBS冲洗平皿两次，并移除悬浮起来的细胞。用无菌镊子夹起一个克隆环，轻轻的将克隆环底部粘上无菌甘油，然后快速垂直拿起。轻轻的将克隆环放在一个选定的克隆之上，并用镊子稍用力均匀按压，压力不均匀会导致克隆环底部不密封而漏液。在显微镜下确认克隆环的位置在选定的克隆之上，保证在克隆环密闭的区域内没有其他克隆。加0.2mL胰酶(0.25％)到克隆环里。将培养皿在36.5℃孵育5分钟。每隔两三分钟在显微镜下观察一次细胞，细胞开始变圆并脱离培养皿底部。加一两滴培养液到克隆环中，并轻轻用巴氏吸管或移液器吸出细胞。将细胞转移至合适的培养器皿中并加适量的培养液。用12孔或者24孔板，在38℃、5％CO₂恒温培养箱培养。

实施例6猪胎儿成纤维细胞单细胞培养

以500μL的微滴形式接种丝裂霉素处理过的小鼠成纤维细胞(MEF)即饲养层细胞至90mm培养皿(corning costar)，每个大皿加入10个小鼠成纤维细胞微滴，直径约1厘米，置37℃、5％CO₂恒温培养箱培养，贴壁24小时后的饲养细胞密度在微滴范围内达到100％汇合。

饲养细胞完全贴壁后，换新的培养液。取3代以内的猪成纤维细胞，用含20％胎牛血清的高糖DMEM稀释每毫升10个细胞。然后将10mL含有稀释后细胞的培养液，接种至含有饲养层细胞的90mm培养皿。在38℃、5％CO₂恒温培养箱培养。培养11天后每一个单细胞分化长出一组新的克隆细胞，该克隆即为单细胞增殖克隆。

用倒置显微镜通过调整光照强度和角度，挑选可看到的细胞克隆。用标记笔在培养皿底部相应位置画一个圈圈住该克隆。选择大小比较平均方便分离的克隆。移除培养液，用不含钙镁的PBS冲洗平皿两次，并移除悬浮起来的细胞。用无菌镊子夹起一个克隆环，轻轻的将克隆环底部粘上无菌甘油，然后快速垂直拿起。轻轻的将克隆环放在一个选定的克隆之上，并用镊子稍用力均匀按压，压力不均匀会导致克隆环底部不密封而漏液。在显微镜下确认克隆环的位置在选定的克隆之上，保证在克隆环密闭的区域内没有其他克隆。加0.2mL胰酶(0.25％)到克隆环里。将培养皿在36.5℃孵育5分钟。每隔两三分钟在显微镜下观察一次细胞，细胞开始变圆并脱离培养皿底部。加一两滴培养液到克隆环中，并轻轻用巴氏吸管或移液器吸出细胞。将细胞转移至合适的培养器皿中并加适量的培养液。用12孔或者24孔板，在38℃、5％CO₂恒温培养箱培养。

实施例7不同细胞插入基因拷贝数测定

(一)细胞DNA的提取

将等量实施例4获得的细胞克隆(6孔)(A组)与参考文献(李秋艳.利用体细胞核移植技术生产表达增强绿色荧光蛋白(EGFP)的转人溶菌酶基因(HLY)的猪克隆胚胎.自然科学进展.2008，18(10)：1157-1162)中所得pBC1-HLY-GFP-NEO细胞克隆(6孔)(B组)分别接种于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，在38℃、5％CO₂恒温培养箱培养。72小时后，加0.5mL PBS洗涤细胞3遍次，分别加1mL胰酶(0.25％)，将培养皿在36.5℃孵育5分钟。每隔两三分钟在显微镜下观察一次细胞，细胞开始变圆并脱离培养皿底部。加入1mL细胞培养液体，终止消化，通过活细胞计数仪(II FL全自动细胞计数仪，life technology)，结果见表1，根据计数结果，将A组细胞用培养液稀释至1.7×10⁵/mL。分别将相同细胞数的A组和B组细胞2mL接种至6孔板中，在38℃、5％CO₂恒温培养箱培养72小时，后分别加1mL PBS洗涤细胞2遍次，分别加入0.5mLReagent(life technology)，枪头吹打混匀裂解。10000rpm 4°离心10分钟。将粘稠的上清液转移到一个新的EP管，在上清中加入0.5mL无水乙醇。充分混匀后，在室温沉淀1-3分钟，然后10000rpm离心4分钟，倒掉上清，用0.7-1mL 75％的乙醇颠倒洗涤两次。倒掉多余的乙醇，在空气中30秒挥发乙醇。将沉淀溶解于100μL的TE(tris-EDTA)缓冲溶液中，通过nanodrop定量DNA浓度。结果如表1所示。

表1不同方式获得克隆的DNA浓度和纯度

分组细胞数DNA浓度260/280(OD)A组1.7×10⁵/mL(2mL)65ng/μL(100μL)1.9B组1.8×10⁵/mL(2mL)67ng/μL(100μL)1.9

(二)不同克隆GFP拷贝数的测定

a)绝对定量标准品的构建

应用Primer Premier 5.0软件设计GFP(绿色荧光蛋白)扩增引物，序列为:5′TGAACCGCATCGAGCTGAAGGG3′(上游序列如SEQ ID NO：1所示)和5′ACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTG 3′(下游序列如SEQ ID NO：2所示)，probe序列为：5′GAGACAGAAACTTTCGAAGC3′(探针序列如SEQ IDNO：3所示)扩增产物110bp。将上述引物扩增的PCR产物与pEGM-18T(Promega)连接，经转化、筛选、摇菌，最后抽提质粒测序。将构建经测序鉴定正确的菌株，提取质粒后备用。根据紫外分光光度计测定质粒OD260值，计算浓度，质粒拷贝数为2×10¹⁰/μL。拷贝数＝质粒浓度(ng/μL)×6.02×10¹⁴/2055900(质粒分子量)。按10倍倍比的梯度稀释标准质粒分子，依次配制成1000000copies/μL、100000copies/μL、10000copies/μL、1000copies/μL，100copies/μL六个梯度的标准溶液。

实时定量PCR体系：

条件按ABI7500FAST(美国)仪器使用手册设置，PCR条件如下：95℃2min；95℃10s，60℃40s，40个循环。反应体系在96孔板(MJ ResearchHSP29655)中混匀并用超净光盖(MJ Research TCS20803)封口。反应结果使用Opticon MonitorTM软件收集、分析。样品在同一块板中做3次重复。计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为起始拷贝数的自然对数。结果如图2所示。

b)不同培养细胞GFP拷贝数检测(TaqMan探针法)体系：

不同来源DNA基因组(A组，B组)配置成1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、4ng/μL、5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL等浓度。按照如下体系分别进行PCR配置：

PCR条件如下：95℃2min；95℃10s，60℃40s，40个循环。获得每一组样品的CT值，根据标准曲线获得每一组样品的GFP拷贝数，以拷贝数为纵坐标，以DNA质量为很坐标进行作图，结果如图3、4所示，其中，图3示本发明单细胞培养克隆(A组)基因组GFP拷贝数与DNA质量的关系；图4示G418筛选克隆(B组)基因组GFP拷贝数与DNA质量的关系。

由结果可以看出，本发明单细胞培养克隆细胞(A组)的基因组单一，在动物克隆中能够产生单一表型的克隆猪。而G418筛选出的克隆(B组)是基因组不均一的细胞，在动物克隆中会产生多种表型的克隆猪。因此，本发明实施例4提供的单细胞培养方法获得的细胞基因组完全一致，有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立。

将实施例5、6获得的细胞克隆进行GFP拷贝数的测定，结果与实施例4获得的细胞克隆的实验结果相近，表明本发明实施例5、6获得的单细胞克隆的基因组完全一致，有利于提高转基因猪的特异性，有利于转基因猪克隆效率的评价，以及特定均一转基因猪品系的建立。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。