一种从外周血中体外大量扩增干细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种从外周血中体外大量扩增干细胞的培养方法，利用存在于人骨髓外的两种内皮祖细胞做为体外扩增干细胞的微环境细胞，从外周血中大量扩增干细胞。本发明利用存在于骨髓外的两种内皮祖细胞做为微环境在体外完成了大量扩增外周血干细胞的目标，并且直接应用实时监控录像形象的展示了在以这两种内皮祖细胞做为微环境时，干细胞可以得到自我复制的扩增，扩增数量达到100倍，扩增后的干细胞具有干细胞的不对称分裂能力，和向下一级祖细胞分化能力，即应用这两种内皮祖细胞做微环境后，干细胞从数量上较没有微环境细胞时得到了100倍的扩增，扩增后的细胞具有自我复制和向下一级祖细胞分化能力，证实扩增的干细胞具备干细胞的关键两个特性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞生物技术，具体涉及利用存在于人骨髓外两种可 以为干细胞扩增提供微环境的内皮祖细胞与种子干细胞共培养，从而完成了 从外周血中体外大量扩增干细胞的培养方法。

背景技术

造血干细胞是造血组织中具有自我更新和分化潜能的一类干细胞。造血 干细胞的生存离不开被称为“龛”的骨髓微环境。当与可做为微环境的骨髓 基质细胞共同移植可以使移植效率明显增加，都表明骨髓微环境对造血干细 胞有重要影响。这些微环境包括最初发现的骨髓内的成骨细胞，到后面的胚 胎的间充质干细胞，神经细胞，脂肪细胞，再到目前非常重要的骨髓内的血 窦内皮细胞。随着研究进展，更多的证据表明造血干细胞很可能来源于胚胎 发育过程中的“造血内皮细胞”，实验表明造血细胞是由被标记的内皮细胞 发展而来的，另一实验也证实成体血细胞来源于表达VE-cadherin的内皮细 胞，加上现有实验证明用胚胎的卵黄囊﹑AGM区﹑卵黄动脉附近的内皮细胞 可以支持成体造血干细胞的体外扩增都说明造血干细胞的存在以及造血过 程均与血管的内皮细胞密切相关，以上的实验均证实胚胎或骨髓内的血管内 皮细胞有微环境的作用，那么骨髓外的血管内皮细胞是否有此作用？到目前 为止未发现应用人骨髓外内皮细胞做为微环境，方便快捷，扩增外周血干细 胞的方法，问题关键是未找到合适的内皮细胞。如能找到合适的可做为微环 境的内皮细胞，这样扩增出来的高潜能的干细胞，对血液病或其它系统疾病 的细胞治疗将有重大开拓作用。另外至今未明确内皮细胞做为微环境如何完 成扩增干细胞作用的？为什么会有“造血内皮细胞”存在？为什么说造血干 细胞来源于内皮细胞？这些问题对我们来说仍是谜，这中间主要是缺乏技术 能够连续观察造血干细胞扩增过程,曾有文章强调可以应用实时录像方法， 用此方法实验已经证实粘附在内皮细胞上的造血干细胞能扩增出非粘附的 呈悬浮状生长的干细胞。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种从外周血中体外大量扩增干细 胞的培养方法，利用存在于骨髓外两种具有微环境功能的内皮祖细胞分别与 种子干细胞共培养，均达到了干细胞的扩增的目标。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种从外周血中体 外大量扩增干细胞的培养方法，利用存在于人骨髓外的两种内皮祖细胞做为 体外扩增干细胞的微环境细胞，从外周血中大量扩增干细胞。

所述的从外周血中体外大量扩增干细胞的培养方法，包括以下步骤：

1)制备微环境细胞：晚期内皮祖细胞和脐静脉内皮祖细胞；

2)干细胞扩增：

①先从外周血MNC中纯化被扩增的干细胞种子细胞：将步骤1)中的微 环境细胞分别预铺到培养皿中，经一定剂量放射处理，将分离好人外周血 MNC分别种植到培养皿中，分别收集扩增的呈悬浮状生长的第一代干细胞；

②实施外周血干细胞扩增：将收集的第一代扩增纯化的种子干细胞分别 种植到经预处理的预铺有微环境细胞的的培养皿中培养，培养液为EGM2；

3)扩增的干细胞的鉴定：从细胞形态，自我复制功能，向下一级祖细 胞分化能力进行干细胞鉴定。

所述步骤2)中预铺的微环境细胞经10Gy放射处理。

所述步骤2)培养皿中预铺的晚期内皮祖细胞和脐静脉内皮祖细胞的细 胞浓度为1×10³/ml。

所述步骤2)种植的被扩增的干细胞为扩增纯化过的第一代干细胞，细 胞的浓度为：1×10⁵/ml。

所述步骤2)培养皿为鼠尾胶原包被的6孔板的培养皿。

所述包被培养皿的鼠尾胶原质量浓度为1％。

本发明的有益效果是：利用存在于骨髓外两种内皮祖细胞做为微环境在 体外完成了从外周血中大量扩增干细胞的目标，且能做到针对每个人利用自 己的内皮祖细胞扩增自己的干细胞，达到无免疫原性的干细胞应用目标，将 会解决异体干细胞移植后排斥反应发生，将为干细胞的临床应用解决了细胞 来源和量的问题，从理论上再次验证了干细胞扩增离不开微环境支持的理 论。利用对干细胞扩增过程的实时监控的录像研究将揭示干细胞发育过程的 很多不明现象，丰富干细胞发育理论。

附图说明

图1显示了粘附在做为微环境的内皮祖细胞上的小的干细胞，与微环境 细胞一起分化过程(最后结果是即保留了原始自己，同时分化出两个内皮祖 细胞，典型的干细胞不对称分化过程)。

图2中A显示将扩增后的干细胞再植入有微环境细胞的培养皿中，干 细胞能向下分化成内皮祖细胞呈集落样生长，B为对照组未植入干细胞，只 见微环境细胞未见内皮祖细胞集落形成。

图3为对内皮祖细胞的生物特性的FACS鉴定结果。

图4为扩增成集落状生长的内皮祖细胞与Matrigel混合12小时后可见 管状结构形成(×40倍)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

一：先制备做为微环境的内皮祖细胞

1.目前常用的培养晚期EPCs(内皮祖细胞)的方法如下：

用已知的Ficoll密度梯度法从外周血中分离MNC层，而后是将一定密度的 单个核细胞种入铺了纤连蛋白或胶原的培养皿中，而后用EGM2商业培养基 培养,每隔一天更换培养基一次，培养2-3周开始有呈集落状生长，细胞形 态呈鹅卵石状的晚期内皮祖细胞。

2.目前常用的从脐带中分离出的脐静脉内皮细胞：方法从略

二：从外周血中制备被扩增的造血干细胞种子细胞；

1.培养皿中微环境细胞的制备：将先前培养获得的晚期内皮祖细胞或HUVECs 1×10³个细胞种植到1％(质量浓度)胶原包被的6孔板中，以EGM2为培养 液，在37℃,5％CO₂孵箱中培养6小时，待细胞贴壁生长后，经10Gy剂量照 射后，抑制其生长。

2.分离人外周血MNC：取人静脉抗凝血100ml,用Ficoll密度梯度离心法分 离MNC。

3.体外培养MNC：即将分离好的MNC种植到制备好的6孔板中，以EGM2为 培养液，在37℃,5％CO₂孵箱中培养，每隔一天换液一次，第一次换液时丢弃 原上清，第二次换液时收集上清离心后弃液体，将离心获得的沉淀用新鲜培 养液重悬后再种植到原培养皿中，在培养的第五天收集上清离心，并用台盼 蓝计数细胞数量。

上述体外培养液是市场上统一销售的培养液；单个核细胞按1×10⁷个细 胞种植到1％胶原包被的6孔板中；胶原的包被浓度为5－10ul/cm²；微环境 辐射剂量10Gy。

三.利用以上两种内皮祖细胞做为微环境体外扩增造血干细胞

1.培养皿中做为微环境细胞的制备：将先前培养获得的晚期内皮祖细胞或 HUVECs 1×10³个细胞种植到1％胶原包被的6孔板中，以EGM2为培养液，在 37℃,5％CO₂孵箱中培养6小时，待细胞贴壁生长后，经10Gy剂量照射后，抑 制其生长。

2.将计数后的干细胞以1×10⁵个细胞种植到先前方法描述的含晚期内皮祖 细胞或HUVECs做为微环境的培养皿中，以EGM2为培养液，在37℃,5％CO₂孵 箱中培养，每隔一天换液一次，换液时收集上清离心后弃液体，将离心获得 的沉淀用新鲜培养液重悬后再种植到原培养皿中，在培养的第五天收集上清 离心，获得的细胞即为扩增后的干细胞。

四.对扩增后的干细胞的验证

1.细胞形态：扩增出来的干细胞大小是内皮祖细胞的几十分之一，这也符合 细胞发育规律，细胞越处于干细胞早阶段，细胞体积越小，经DAPI染色后 显示细胞核的大小基本上就等同于细胞大小。

2.是否具有自我复制能力：将获得扩增后的干细胞再次以1×10⁵个细胞种植 到先前方法描述的含晚期内皮祖细胞或HUVECs做为微环境的6孔培养皿中， 如上述方法培养，第五天收集培养液上清，计数获得的细胞数量。除数量角 度外，用实时录像显微镜记录细胞如何扩增，即将获得扩增后的干细胞再次 以1×10⁵个细胞种植到先前方法描述的含晚期内皮祖细胞或HUVECs做为微 环境的6孔培养皿中，而后将培养皿置于带37℃,5％CO₂孵箱的具有实时录像 功能显微镜下连续观察，最早在种植后9小时即发现粘附到内皮祖细胞上干 细胞与内皮祖细胞一起完成自我复制程序，并释放出一样大小的小细胞到培 养上清中呈悬浮状生长。

3.是否具有向下一级祖细胞阶段分化能力：将获得扩增后的干细胞再次以1 ×10⁵个细胞种植到先前方法描述的含晚期内皮祖细胞或HUVECs做为微环境 的6孔培养皿中，如上述方法培养，每隔一天换液一次，在培养第6天，计 数获得的晚期内皮祖细胞的集落数目，与对照组(只是微环境细胞，未植入 扩增后的干细胞)，每孔集落数目平均为4个，而对照组未形成集落，细胞 基本未见增殖。同时将获得扩增后的干细胞再次以1×10⁵个细胞种植到先前 方法描述的含晚期内皮祖细胞或HUVECs做为微环境的6孔培养皿中，而后 将培养皿置于带37℃,5％CO₂孵箱的具有实时录像功能显微镜下连续观察，最 早在种植后6小时发现粘附到内皮祖细胞上的干细胞在内皮祖细胞参与下 出现不对称分裂现象，一方面保留了原始自己，同时向下一级分化了两个内 皮祖细胞出来(图1)。对分化的内皮祖细胞进行形态学上验证(见图2) 显示其形态为集落状生长，呈鹅卵石状。进行流式细胞仪验证(见图3)其 表达内皮祖细胞的标志即获得的贴壁生长细胞表达CD31 99.9％ (99.3％～100％)，CD34 12.4％(11％～15.2％)，eNOS 62.9％(60.1％～65.4％)， FLt-1 37.1％(35.6％～38.2％)，P1H12 100％(100％～100％)，Sendo 43.4％ (41％～45.7％)，VEcadherin2.0％(1.9％～2.2％)，CD117 2.2％(2.1％～2.8％)。 进行细胞功能验证(见图4)。Matrigel检测扩增的细胞体外能有管状结构 形成能力，以上均说明此细胞具有内皮祖细胞的生物特性。

骨髓内的或胚胎的内皮细胞具有做为微环境扩增造血干细胞的功能，这 些结论已经被多篇文献证实，并证实扩增后的造血干细胞具有向造血细胞分 化能力。但在成体骨髓外是否存在这样具有起微环境功能的内皮细胞，目前 尚未有报道，如果存在，业界就可以在体外扩增针对每个个体，利用自己取 之方便的内皮细胞扩增自己的干细胞，应用到个体本身，就不存在移植后排 异反应，如本个体不适合应用自己的细胞进行扩增，目前的异体移植也存在 着所应用的干细胞的数量及质量(干细胞的所处阶段直接决定细胞的质量) 的不足，所以在成体骨髓外找到能起干细胞扩增微环境功能的内皮细胞，对 干细胞的临床移植疗效有至关重要的作用。本发明显示首次证实存在于成体 骨髓外的两种内皮祖细胞--晚期内皮祖细胞和HUVECs可以起到微环境细胞 的作用，达到了干细胞的扩增目的。这里需要说明的是，第一：因为干细胞 的多阶段性，决定着他们的表面标志在随着细胞所处阶段不同而不同，在目 前还没有确切的细胞表面标志与确定的干细胞阶段相对应的情况下，也不能 确定是否那一阶段干细胞能被扩增或不能被扩增，我们选择应用的被扩增的 种子干细胞是用我们的方法扩增的第一代干细胞，我们验证这第一代的干细 胞是否能被再扩增，扩增后是否仍具有干细胞的特性。第二：很多实验已经 证实经骨髓的内皮细胞做微环境扩增后的干细胞具有造血干细胞特性，即可 以经长期集落培养出造血集落，但我们这里采取验证扩增后的干细胞是否具 有干细胞的自我复制及能向下阶段细胞分化的干细胞两大特性。就前面所说 不管干细胞所处阶段如何，干细胞两大特性是其所有阶段均共有的特性，是 确定干细胞的标准。所以本专利对扩增的干细胞鉴定采取的就是鉴定其是否 能自我复制，是否能向下一阶段即祖细胞或成熟细胞分化。本发明是在体外 通过选择晚期内皮祖细胞和脐静脉内皮细胞做为微环境扩增周血干细胞的 方法，数量上能达到100倍的扩增，扩增出的干细胞具备干细胞的两大特性， 从而证明此发明方法具有实用价值，从而为临床工作提供了丰富的高效的细 胞治疗的细胞来源，具有重大临床价值，也将创造不可忽视的经济及社会价 值。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有 识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这 种实施例都包括在本发明的范围之内。