一类基于基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的抗肿瘤药物制备及用途

摘要

本发明涉及一类基于基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的抗肿瘤药物，它包含结构为辅基蛋白LDP-连接肽(G

说明书

技术领域:

本发明属于生物医药领域，涉及一类基于基质金属蛋白酶组织抑制剂的抗肿瘤药物及其用途。

背景技术：

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)属于一类Zn²⁺依赖性内肽酶，特别是一种分子量为66kDa的跨膜胶原酶(膜型基质金属蛋白酶，MT-1-MMP/MMP-14)，在正常组织低表达或不表达，但在大部分肿瘤组织中均有较高表达，在很多人类肿瘤的形成和发展过程中发挥关键作用。鉴于MMP-14的膜定位关系，近年被认为是研究肿瘤治疗的一个重要分子靶点。研究报道，MMP-14涉及前列腺癌、肾癌、乳腺癌、黑素瘤及卵巢癌等的侵袭和转移过程，并与病人治疗预后较差及生存期短都有密切关系。因此，有效地利用MMP-14作为靶点，可以提高药物的输送效率，而且，抑制其表达还可以降低肿瘤的恶性度，提高患者生存率。

基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)属于一类古老的真核蛋白；哺乳动物TIMPs家族至少含有四个成员，即TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4，它们的生物学功能极其广泛，主要通过直接或与微环境中组分产生复杂的相互作用关系调控细胞行为。TIMPs家族成员TIMP2，可以通过依赖或非依赖性抑制MMP-2的活性两种方式重塑细胞外基质，抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤生长，或涉及自身免疫性疾病、关节炎、心血管疾病等的发生和发展过程。然而，近年临床试验中开展的TIMP2治疗，并未取得良好的效果。

研究还指出，TIMP2与肿瘤细胞的结合方式存在一种MMP-14依赖性途径，具有一定的特异性，也就是说，如果细胞表面存在MMP-14，并且有TIMP2的参与，就会形成一个三分子结构的复合体MMP-14/TIMP2/MMP-2，该机制目前多应用于肿瘤细胞的体外侵袭和迁移研究中。但在体内，肿瘤的侵袭尤其是转移 具有时间和空间的依赖性，单一因素并不能促使其即刻发生。基于上述两点，本实验室首次利用TIMP2作为一种药物输送载体，并根据它与MMP-2及MMP-14之间的复杂作用关系作为靶向依据，将具有高效细胞毒性的化疗药物输送至肿瘤部位。

辅基蛋白(LDP)的空间结构可以形成一个疏水口袋，保护具有强烈杀伤肿瘤细胞活性的烯二炔发色团(Active enediyne chromophore,AE)，在体外可以通过基因工程方法构建，且具有稳定的生物学活性；此外，LDP蛋白所含的相关基团可以进行定点修饰，与其它抗肿瘤药物结合，如平阳霉素及紫杉醇等。本实验室已有平阳霉素(pingyangmycin,PYM)与巯基化LDP进行偶联的实验研究报道。

在实验研究的基础上，制备得到基于TIMP2的药物输送蛋白LDP-TIMP2(TIMP2-based protein,TIBP)，它不仅能够作为药物输送载体，还可以发挥一定的生物学调控功能，更具有使用安全性特征。本发明所述一类基于基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的抗肿瘤药物的制备及用途，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明的目的之一是，提供一类基于基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的抗肿瘤药物，其既具有靶向性，又具杀伤性的抗肿瘤作用。

本发明的目的之二是，提供一种药物输送载体的选择方案，利用天然存在的基质金属蛋白酶组织抑制剂-2作为研究对象，应用安全性好。

本发明的目的之三是，提供该输送蛋白的编码基因。

本发明的目的之四是，提供以上述蛋白为活性成分的抗肿瘤药物及其用途。

目前国内外文献报道有关TIMP2在抗肿瘤研究中的应用，大多涉及到其可能存在的作用机制，极少有利用TIMP2作为载体，输送高效抗肿瘤药物进行临床前或临床治疗的研究。

本发明通过基因工程技术构建基于TIMP2，同时包含LDP蛋白(TIMP2-based protein,TIBP)的重组载体，并通过毕赤酵母分泌表达系统制备目的蛋白，经纯化及相关的活性评价，获得一种多功能的药用蛋白，有效避免原核表达系统中包涵体复性的不利因素，更好地保证其生物学活性。

本发明所提供的一种药物输送蛋白，其结构为：辅基蛋白LDP-连接肽(G₄S)₂- 基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP2)；所述蛋白具有SEQ ID NO:4氨基酸序列。

其中，所述辅基蛋白LDP具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，共110个氨基酸；所述基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP2)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，共194个氨基酸。此外，辅基蛋白LDP与TIMP2之间的连接肽具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。

另一方面，本发明提供所述输送蛋白的编码基因，具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。

基于基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的输送蛋白能够携带的化疗药物，包括但不限于烯二炔类抗肿瘤化合物如力达霉素发色团AE、还可以为平阳霉素，紫杉醇等。本发明选择活性较强的力达霉素发色团AE进行研究。

再一方面，本发明还提供一种基于TIMP2的高效抗肿瘤药物TIBP-AE在裸鼠移植瘤模型中的治疗作用。优选地，所述抗肿瘤药物应用于治疗人食管鳞癌。

综上所述，本发明通过基因工程技术构建一种新型蛋白，既能够靶向基质金属蛋白酶，又含有强烈杀伤肿瘤细胞活性的烯二炔发色团的保护蛋白LDP。目前，尚未见有利用基质金属蛋白酶组织抑制剂-2作为药物输送载体的报道。

本发明的优点在于，所述基于TIMP2的多功能蛋白TIBP，能够较好地保留TIMP2的生物学功能，而且属于一种天然存在的组织抑制剂，具有应用安全性特点，表现出更好的应用前景。此外，基于TIMP2的新型抗肿瘤药物TIBP-AE对人食管鳞癌细胞KYSE150裸鼠移植瘤的治疗效果显著，因而，此种药物输送载体的选择具有较好的创新性。

附图说明：

图1-TIBP的基因构建示意图、表达菌株的筛选、鉴定及纯度检测

其中：图1A为TIBP的基因构建示意图；

图1B为不同菌株蛋白表达水平的电泳图谱(1：蛋白分子量标准，2：对照，3-5：分别为不同菌株的蛋白分泌情况)；

图1C为纯化产物的Western blot检测结果；

图1D为TIBP纯度的HPLC检测结果。

图2-TIBP与肿瘤细胞之间的结合关系分析

其中：图2A为不同来源细胞MMP-2及MMP-14表达水平的Western blot检测结果；

图2B为免疫共沉淀法分析TIBP与细胞之间存在的结合方式。

图3-ELISA法分析不同浓度TIBP及对照蛋白LDP与KYSE150细胞、HT1080细胞、H460细胞和A549细胞的结合情况。

图4-共聚焦方法检测TIBP与KYSE150细胞的结合及被摄取情况

图5-食管鳞癌组织芯片分析TIBP及对照蛋白的选择性结合能力

其中：图5A为TIBP对人食管鳞癌组织的结合情况；

图5B为对照蛋白LDP对人食管鳞癌组织的结合情况；

图5C为结合情况的分类标准；

图5D为根据分类标准对TIBP组结合情况的统计学分析；

图5E显示与癌组织/癌旁组织具有结合特异性的典型代表。

图6-通过活体成像实验观察TIBP对KYSE150、HT1080和H460裸鼠移植瘤的靶向情况

图7-TIBP和TIBP-AE分别抑制人食管鳞癌KYSE150裸鼠移植瘤的生长情况其中：图7A为实验过程中，移植瘤的生长曲线图；

图7B为实验过程中，对照组及给药组的裸鼠体重变化曲线图。

具体实施方式：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》重组表达载体pHBM-TIBP的构建

力达霉素辅基蛋白LDP与TIMP2组成的TIBP基因序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并经过OptimumGene^TM密码子优化技术处理。分子生物学实验中使用的PCR引物由Invitrogen^TM公司合成。TIBP的全长序列主要包含编码LDP的核苷酸序列以及编码TIMP2的核苷酸序列，二者之间通过柔性连接肽(G₄S)₂连接，全长基因序列(图1A)插入到pHBM-9005质粒获得表达载体，经过SalⅠ内切酶线性化后，回收目的条带，电转化至毕赤酵母Pichia pastoris GS115感受态细胞，获得含有目的基因序列的表达菌株。所述菌株被命名为巴斯 德毕赤酵母Pichia pastoris GS115-TIBP，于2015年04月10日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其编号为CGMCC No.10712。

《实施例2》TIBP的诱导表达、纯化及鉴定

利用实施例1中获得的含重组表达载体的菌株进行小规模诱导表达，筛选出高效表达菌株。主要步骤为：挑取MD平板上长出的单菌落，分别接种至BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mM pH 6.0磷酸钾缓冲液，1％甘油)，28-30℃，280-300rpm，培养至对数期(OD₆₀₀＝2-6)。转接0.5mL培养液至50mL BMGY培养基(500mL摇瓶，按≤10％量装瓶)，28-30℃，280-300rpm，培养24-36h。于室温(RT)，3,000×g离心5min，弃上清后收集菌体，细胞沉淀转移至50mL BMMY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mM pH 6.0磷酸钾缓冲液，1％甲醇)中，28℃，280-300rpm，培养96h(每隔24h添加100％甲醇至终浓度为1.0％)。取少量发酵液至1.5mL Eppendorf管中，于RT，5,000×g离心5min，收集上清。通过12％SDS-PAGE检测蛋白的表达情况(图1B)。筛选获得的菌株经过发酵条件优化后，进行较大规模的表达。收取发酵液上清，进行蛋白纯化；由于TIBP的C-末端带有六聚组氨酸标签，因此主要采用GE Healthcare公司产品HisTrap亲和层析柱(5mL)进行纯化，详细步骤可参阅说明书。纯化产物采用Western blot方法进行鉴定(图1C)，分子量大小与预期接近。之后，通过高效液相色谱(HPLC，S3000柱，流动相0.1M PBS，pH 6.8，1.0mL/min)法检测蛋白纯度；纯化后的TIBP纯度达95％以上(图1D)，产量约18mg/L。

《实施例3》TIBP与肿瘤细胞亲合能力的分析

(一)：Western blot检测不同肿瘤细胞MMP-2,-14的表达水平

取对数生长期的人鳞癌细胞系A431、人非小细胞肺癌细胞系H460和A549、人纤维肉瘤细胞系HT1080、人胰腺癌细胞系PANC-1、人结肠癌细胞系HCT-15以及人食管鳞癌细胞系KYSE150七种细胞，去除培养液，PBS润洗2次，按照6孔板每孔细胞量加入150-250μL裂解液(高效RIPA组织/细胞裂解液，每1mL RIPA中加入10μL PMSF(苯甲基磺酰氟)，至终浓度为1mM)，轻柔吹打数次，使裂解液与细胞充分接触，冰上裂解20min。裂解后的细胞于4℃，10,000-14,000×g离心10min，收集上清，BCA试剂盒进行蛋白定量。取30μg蛋白与适量5×上样缓冲液混合，沸水浴中变性5min，-80℃保存备用。取30μg不同肿瘤细胞的总蛋白，12％SDS-PAGE后进行Western blot分析。所用一抗为，MMP-2 Antibody(购于Cell Signaling TECHNOLOGY公司)，Anti-MMP 14antibody(购于Abcam公司)，稀释液为1％BSA(1:1000稀释)；二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG(购于北京中杉金桥公司，1:5000稀释)。Western blot检测结果表明，KYSE150、HT1080及A431细胞表面都较高表达MMP-14；七种细胞除A431外，都较高水平表达MMP-2(图2A)。

(二)：免疫共沉淀法检测TIBP的结合特异性

具体步骤为： 

1.蛋白样品的制备

取生长状态良好的KYSE150细胞和H460细胞，蛋白样品制备按照上述Western blot步骤。

2.去除非特异性结合

分别取200μg上述两种细胞的总蛋白，加入约1μg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20μL充分重悬的Protein A+G Agarose，于4℃缓慢摇动30min-2h。之后，2,500rpm(约1,000×g)离心5min，取上清进行后续实验。

3.免疫沉淀

(a)将以上过程所得上清分别与50μg的TIBP在4℃缓慢摇动条件下孵育2h，同时设置不加蛋白的阴性对照；

(b)加入0.2μg抗MMP-2或抗MMP-14的单克隆抗体，4℃缓慢摇动条件下孵育过夜，同时设置加入非免疫血清的阴性对照；

(c)在各混合物中分别加入40μL Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动条件下孵育4h；

(d)于4℃，1,000×g离心5min，吸弃上清；

(e)预冰冷的PBS洗涤沉淀5次，每次1mL，洗涤时离心条件为4℃， 1,000×g离心5min。洗涤完成后，吸弃上清，并加入30μL的1×上样缓冲液，旋涡振荡重悬沉淀，瞬时高速离心样品至管底；

(f)沸水浴中处理5-10min，取适量样品SDS-PAGE分析。

4.Western blot检测

具体步骤如前所述。一抗为His-Tag(10E2)Mouse mAb(l:2000稀释)，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(图2B)。

(三)：ELISA法分析蛋白与肿瘤细胞的结合能力

将KYSE150、HT1080、H460及A549细胞分别按1×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板。培养24h后，PBS缓冲液润洗2次，加入预冷的4％甲醛50μL(PBS配置)，于4℃固定30min。固定好的细胞PBS润洗3次，每次5min。每孔加入200μL 1％BSA/PBS溶液，4℃封闭过夜。PBST(PBS中加入0.05％的Tween-20)润洗3次，每次5min，200μL/孔。分别加入不同浓度的蛋白LDP及TIBP(PBS稀释)，50μL/孔，每个浓度设3个平行孔。于37℃孵育2h。PBST润洗5次，每次3min，然后加入His-Tag(10E2)Mouse mAb(Abmart公司，l:2000稀释)，50μL/孔，于37℃孵育2h。PBST润洗5次，每次3min，然后加入HRP标记的山羊抗小鼠/IgG(1:3000稀释)，50μL/孔，于37℃孵育2h。PBST润洗5次，每次3min，然后加入100μL/孔可溶型单组分TMB底物溶液(北京天根生化科技有限公司)，室温避光反应10-30min，根据显色程度，2mol/L硫酸溶液(100μL/孔)终止反应。酶标仪测定OD_450nm处的吸光值。结果表明，TIBP与四种肿瘤细胞均有较好的结合能力，然而即使在浓度达到100μM时，LDP蛋白与上述细胞的结合能力也很弱(图3)。

《实施例4》激光共聚焦显微镜观察TIBP的靶向及细胞的摄取能力

采取Confocal法观察TIBP与KYSE150细胞的结合活性以及活细胞对蛋白的摄取情况。

将处于对数生长期的KYSE150细胞制成单细胞悬液，细胞计数并调整其浓度，按每孔1×10⁵个细胞接种于12孔板中(底部放有灭菌的圆盖玻片)，常规培养至细胞汇合度约70％。吸弃培养液，PBS润洗2次，与FITC(异硫氰酸荧光素)标记的TIBP(1mg/mL)于37℃避光孵育1h。PBS润洗3次，每次5min，于室温(RT)，DiI(细胞膜红色荧光探针，C-1036，碧云天生物技术研究所)处理10-20min。PBS润洗3次，每次5min。4％甲醛固定1h，PBS润洗3次，每 次5min。DAPI(终浓度为2μg/mL)染核处理15-20min，PBS润洗3次，每次5min。之后，滴加适量抗淬灭剂，封片，油镜检查(LEICA TCS SP5,×630)。结果表明：TIBP与KYSE150细胞具有较好的结合能力，并且能够很好地被细胞摄取(图4)。

《实施例5》组织芯片分析蛋白与食管鳞状细胞癌及癌旁组织的结合情况

实验所用含人食管鳞状细胞癌及癌旁组织的芯片(购于上海芯超生物科技有限公司，产品编码为OD-CT-DgEso03-002)，其中食管鳞状细胞癌31例，共62点(癌/癌旁各1点)，病理分级Ⅰ级和Ⅰ-Ⅱ级。主要步骤包括：脱蜡处理、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断、孵育一抗、孵育二抗、DAB显色及苏木素复染。详细操作步骤可参照公司标准化方案。本发明选择蛋白LDP以及TIBP作为研究对象。结果(图5)发现，TIBP与肿瘤组织和癌旁组织的结合作用有显著性差异，表明基于TIMP2的药物载体具有较好的选择性；LDP蛋白与肿瘤组织和癌旁组织几乎完全成阴性结合，与上述研究结果一致。

《实施例6》FITC标记的TIBP在活体中靶向肿瘤组织的能力

将人食管鳞癌KYSE150细胞、人纤维肉瘤HT1080细胞、人非小细胞肺癌H460细胞接种至裸鼠右侧腋下。约2周后，当肿瘤体积至100-200mm³，将FITC标记的TIBP，通过尾静脉给药荷瘤裸鼠(n＝3)的方式，每只给药剂量30mg/kg。利用XENGOEN(美国Caliper公司)的小动物活体成像仪进行观察。于不同时间点，采用医用麻醉剂异氟烷进行处理，置于37℃预热的观测板上(同时麻醉)，利用冷却到-90℃的CCD镜头监测TIBP在荷瘤裸鼠体内靶向肿瘤的情况。结果(图6)发现，TIBP能较好地靶向KYSE150裸鼠移植瘤处，2h时可见微弱强度黄色荧光，4-6h富集程度最强，8h左右荧光开始衰弱，10h或更长时间均无荧光信号出现；TIBP也有一定的靶向HT1080裸鼠移植瘤的能力；但对H460裸鼠移植瘤几乎无靶向能力。本实验室已经有大量数据证明，LDP蛋白无论在细胞水平、组织水平及体内都无结合肿瘤细胞或组织的能力；因此，可以确定，本实验的结果是由TIMP2部分产生，进一步表现出其作为药物载体的可行性。《实施例7》MTT法检测TIBP-AE对肿瘤细胞杀伤活性

取对数生长期的KYSE150、HT1080、A549及H460细胞，胰酶消化后计数，并以2-5×10³/孔接种于96孔板中，于37℃培养12-24h。然后，加入不同浓度的TIBP-AE(LDM作为阳性对照)，每个药物浓度设置3个平行孔。于37℃孵 育48h，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h。吸弃上清，每孔加入150μL DMSO，室温摇动反应10min，酶标仪测定570nm处的吸光值(A₅₇₀)。实验过程中分别设置空白组(不含细胞)及对照组(无药物处理)，按下列公式计算细胞的存活率及IC50值：细胞存活率＝(加药组A₅₇₀值-空白组A₅₇₀值)/(对照组A₅₇₀值-空白组A₅₇₀值)×100％。

根据结果(表一)，TIBP-AE与LDM具有相似的IC50值，表明通过柔性连接肽构建的基于TIMP2的运输蛋白并不影响力达霉素辅基蛋白LDP与AE的组装，因此该发明获得的TIBP-AE不仅可以有效地发挥TIMP2部分的生物学功能，还兼有LDM对肿瘤细胞的高效杀伤活性。

表1 TIBP-AE和LDM对不同肿瘤细胞IC50值的测定

《实施例8》TIBP及TIBP-AE对裸鼠移植瘤KYSE150的生长抑制作用

取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠2-3只建立移植瘤传代模型，将人食管鳞癌细胞KYSE150接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种1×10⁷个细胞。待瘤块长至200-300mm³，采用颈椎脱臼法处死荷瘤裸鼠，无菌条件下取出皮下生长的瘤块，修剪去除包膜及坏死组织，生理盐水中剪成约2mm³大小的瘤块，并用套管针将瘤块分别移植到裸鼠右腋窝皮下，火棉胶粘住切口。待瘤块长至约100mm³时，按照裸鼠体重和瘤体积进行分组，每组6只。按照下述给药方案处理：TIBP(5mg/kg和20mg/kg)、LDM(0.05mg/kg)以及TIBP-AE(0.20，0.35和0.50mg/kg)。尾静脉给药，每只200μL，对照组不作处理。第一次给药后的第8天，按照相同剂量再给药一次。实验期间，每3天对裸鼠体重和肿瘤的体积进行测量， 并观察裸鼠的精神状态。根据公式V＝ab²/2计算肿瘤体积(a:肿瘤长径，b:肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线及裸鼠体重变化曲线图。观察结束后，处死动物，解剖出瘤块，同时取出心、肝、脾、肺、肾和小肠，然后采用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片以及苏木精-伊红(H&E)染色。Leica图像分析系统进行分析。结果表明：TIBP抑制KYSE150移植瘤生长的能力较弱，而TIBP-AE治疗效果显著，三组抑瘤率分别约为64％，76％和82％(图7)。上述各治疗组的小鼠状态良好，未发生死亡，体重变化区间在10％以内。

序列表

SEQ ID NO:1力达霉素辅基蛋白(LDP)氨基酸序列

SEQ ID NO:2基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP2)氨基酸序列

SEQ ID NO:3连接肽氨基酸序列

SEQ ID NO:4力达霉素辅基蛋白-连接肽-基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIBP)氨基酸序列

SEQ ID NO:5输送蛋白，力达霉素辅基蛋白-连接肽-基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIBP)编码基因的核苷酸序列