一种丹参素硫化物的液-质检测方法及其在丹参原药材质量控制中的应用

摘要

一种丹参素硫化物的液-质检测方法，包括样品制备、采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱对样品进行检测、将样品的超高效液相色谱图以及一二级质谱图进行结构解析鉴定出丹参素硫酸酯、丹参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯化学成分；本发明解决了从成品药终端检测判断成品药使用的丹参药材是否经过了硫磺熏制的非法炮制的技术瓶颈，为药监机构提供了一种药品质量监控的新途径，是药品质量检测领域的一种技术突破。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药材质量管控方法，更具体的说涉及一种丹参素硫化物的液-质检测方 法及其在丹参原药材质量控制中的应用。

技术背景

硫磺熏蒸方法被长期应用于食品、农产品及药材等产品门类的贮藏养护和加工过程，其 主要目的是实现防腐、防霉、防虫蛀，以及有利于干燥和增色等。药材硫磺熏蒸法是部分药 材加工养护的传统方法之一。2004年，国家食品药品监督管理局下发了《关于对中药材采用 硫磺熏蒸问题的批复》明确规定，“对于在市场流通领土的部分中药才和中药材饮品，通过 采用硫磺熏蒸或浸泡达到外观漂白的行为，应按违反《药品管理法》第四十九条、第七十五 条的规定进行查处”。2005版及2010版《药典》均明确取消了在药材加工环节中采用硫磺熏 制方法，表明了国家将在中药行业中禁止或限制使用硫磺。

传统方法对药材采用硫磺熏蒸的检测方法是，对硫磺熏蒸药材“望”“闻”“尝”“捏” 的简易鉴别方法。一“望”，又称为看，凡是过于鲜艳或发白的药材要警惕；二“闻”，凡 是熏过的都有一股刺鼻的硫磺味；三“尝”，大多数硫磺药材放进嘴里能尝到一种异常的酸 味；四“捏”，硫磺熏蒸后的中药材要比未熏蒸的重，含水量偏高。采用仪器检测方法主要 是对二氧化硫进行检测。二氧化硫含量的测定方法有多种，2010版《中国药典》一部规定为 直接滴定法，此外文献还报道有比色法、滴定法、色谱法、化学发光法、快速检验试剂盒检 验法等方法。

但是现代研究发现。被硫磺熏蒸之后，药性也会发生变化。硫磺毕竟是一种化学物质， 很有可能会跟药材成分中的活性基团发生反应。比如二氧化硫，它本身就是一个很强的还原 剂，它会跟其中一些羟基活性激素发生反应，这样会改变中药材原有的一些化学成份，从而 影响到药效或者产生不良反应、副作用。经过硫磺熏蒸处理的药材在制成成品药后，二氧化 硫等硫化物被除去，但是被二氧化硫等还原剂改变的化学成分继续停留在药物中；往往难以 对原药材的质量进行控制，导致部分不合格药材进入成品药市场。

发明内容

为解决上述的问题，本专利申请提供了一种通过检测含丹参成品药及提取物中是否含有 硫化物-丹参素硫酸酯、丹参素酯亚硫酸酯及丹参素酯亚硫酸酯异构体来判断所使用的丹参原 药材是否经过硫磺熏蒸加工(炮制)的检测方法。

所述的丹参素硫化物的液-质检测方法，包括样品制备、采用超高效液相色谱-四极杆-静 电场轨道阱高分辨质谱对样品进行检测、将样品的超高效液相色谱图以及一二级质谱图进行 结构解析鉴定出丹参素硫酸酯、丹参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯(丹参素酯亚硫酸 酯的异构体)的化学成分；其中，所述的超高效液相色谱条件为：

检测系统：超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统；

色谱柱：100×2.1mm，1.9μm C18柱；

色谱条件为：以0.1％甲酸水为A流动相，乙腈为B流动相，按下述进行梯度洗脱；

0-20min,A流动相的体积百分比变化为95％→80％，B流动相的体积百分比变化为5％→ 20％；

20-35min,A流动相的体积百分比变化为80％→45％，B流动相的体积百分比变化为20％→ 55％；

35-43min,A流动相的体积百分比变化为45％→0，B流动相的体积百分比变化为55％→ 100％；

其中，液相流速0.3mL/min，进样量：1μL，检测波长为254nm，柱温为30℃。

其中，所述质谱检测条件为：

离子源为：HESI源，正负离子切换模式，离子源温度300℃，喷雾电压2.8kV，鞘气压力 35arb，辅助气压力10arb，离子传输管温度300℃；

一级质谱采用全扫描模式，分辨率为70000；

二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率17500；二级质谱碎片采用高能碰撞诱导解离方 式获得；

HCD归一化碰撞能量为35.0％，扫描范围m/z 115-1000。

丹参素硫酸酯、丹参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯的检测在含丹参成品药物及丹 参原药的质量控制中的应用，其技术关键在于：通过检测丹参成品药物及丹参原药是否含有 丹参素硫酸酯、丹参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯中的一种或几种判断含丹参成品药 物所使用的丹参及丹参原药是否进行过硫磺漂白的非法炮制。

本发明的有益技术效果是：本发明解决了从成品药终端检测判断成品药使用的丹参药材 是否经过了硫磺熏制的非法炮制的技术瓶颈，为药监机构提供了一种药品质量监控的新途径， 是药品质量检测领域的一种技术突破。

附图说明

图1 香丹注射液总离子流图；

图2 峰3的一级、二级质谱图；

图3 峰3的同位素实测值与理论值图；

图4 峰7、峰8提取离子流图和多级质谱图；

图5 峰7的二级质谱图；

图6 峰8的二级质谱图。

具体实施方式

实施例1 超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测方法的考察

1材料

仪器：Q-Exactive液质联用系统(Dionex UltiMate 3000液相色谱仪，Q-Exactive质谱仪) (美国Thermo Fisher Scientific公司)；色谱柱：Thermo Scientific Hypersil Gold C18柱 (100×2.1mm,1.9μm)

试剂与药品：市售香丹注射液(批号：12042605)，乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher  Scientific公司)，甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)，水为重蒸馏水。

2仪器方法

样品处理：精密吸取香丹注射液1mL，水浴挥尽水分，残渣加甲醇20mL溶解，0.45μm有 机滤膜滤过，即得。

色谱条件：流动相：A相：0.1％甲酸水，B相：乙腈。梯度洗脱，流动相梯度条件如下：

流速0.3mL/min，进样量：1μL，检测波长为254nm，柱温为30℃

质谱条件：离子源为HESI源，正负离子切换模式，离子源温度300℃，喷雾电压2.8kV， 鞘气压力35arb，辅助气压力10arb，离子传输管温度300℃。一级质谱采用全扫描模式(分 辨率为70000)，二级质谱采用数据依赖扫描模式(分辨率17500)，二级质谱碎片采用高能碰 撞诱导解离(HCD)方式获得(较常规的碰撞诱导解离CID能获得更多的低质量端碎片)，HCD 归一化碰撞能量为35.0％，扫描范围m/z 115-1000。

3.结果

离子检测模式：采用上述色谱分离条件和离子检测模式，从香丹注射液中分离得到了22 个主要的色谱峰，见图1。正离子模式由于受到注射液中辅料聚乙二醇的干扰，对信号的抑制 较大。

香丹注射液中化合物信息的解析与鉴定：每个目标峰通过一级高分辨质谱的精确分子量 信息推测出其分子式，二级高分辨质谱碎片精确m/z信息推测出离子碎片化学式，结合 massfrontier软件，推测分析化合物结构式。此外，丹参中含有较多的同分异构体，单纯通 过分子量难以准确确定其结构，再通过二级质谱碎片、同位素分布等确定其结构。丹参素硫 酸酯、丹参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯的精确分子量实测值与理论值误差均在1ppm 以内。结构鉴定结果见表1。

表1 香丹注射液化合物鉴定结果

峰3的质谱图如下所示，负离子模式下可见[M-H]^－m/z 277.00266。在负离子模式下，以 C，H，O，和S在1ppm偏差范围内，从一级质谱图拟合元素组成，可得其分子式为C₉H₁₀O₈S。 其一级、二级质谱图见图2。

[M-H]^－m/z 277.00266在70000分辨率的条件下，其同位素分布的实测值与理论值如 图3所示。可见在此条件下，同位素¹⁸O及³⁴S能得到很好的分离，有助于准确的预测[M-H] ^－m/z 277.00266的元素组成为C₉H₉O₈S。

如上图所示，[M-H]^－m/z 277.00266的二级质谱可见其主要的碎片离子为丢失CH₂O₂所得的碎片离子m/z 230.99669，丢失CH₂O₃所得的碎片离子m/z 215.00160，丢失CH₂O₃+SO₃所得的碎片离子m/z 135.04425，及SO₃m/z 79.95623。由二级质谱裂解特征可知此峰为丹参 素硫酸酯(Tichocarpol B)，其结构如下所示：

峰7和8的提取离子流图和多级质谱图见图4所示，负离子模式下均可见[M-H]^－m/z 441.05013。在负离子模式下，以C，H，O和S在1ppm偏差范围内，从一级质谱图拟合元 素组成，可得其分子式均为C₁₈H₁₈O₁₁S，二者互为同分异构体。

在负离子模式下，峰7和8[M-H]^－m/z 441.05013的二级质谱图可见其主要的碎片离子 为丢失H₂SO₃所得的碎片离子m/z 359.07748，丢失C₉H₈O₄所得碎片离子m/z 261.00742，以 及生成丹参素相关的碎片离子m/z 197.04509，179.03430，135.04424，和m/z 72.99197，此 外还可见丹参酰基脱水峰m/z161.02364，具体见附图5、6。

由二级质谱裂解特征，判断其为丹参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯，其结构如下 所示：

结果表明，在高达70000分辨率的情况，再结合应用高能碰撞诱导解离(HCD)获得的二级 质谱碎片信息，可以准确地获得注射液中化合物的结构信息。

申请人根据2010版《药典》一部丹参片的技术标准，分别用经过硫磺炮制的药材和未经 过硫磺炮制的药材制备丹参片，在经过硫磺炮制的药材制备的丹参片中发现了丹参素硫酸酯、 丹参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯；而采用未经过炮制的丹参药材制备的丹参片中未 检测出上述的副产物。

实施例2 丹参素硫化物的液-质检测方法的应用

从丹参原产地同一地块采收丹参，见采收后的丹参自然风干脱水适量；将适度脱水后的 丹参分成6份，其中3份继续阴干(避免阳光暴晒)，作为对照组；另外3份进行采用硫磺熏制 工艺处理后，继续阴干，作为实验组。其中硫磺熏制工艺的操作为：

使用的是用高粱秸秆和麻绳穿起来的薄框子，把丹参均匀的撒在薄框子里面，厚度约5 厘米左右，一层一层的落在一起。在薄框子中间放点砖块等把一层层的隔开有利于透气，在 最底部使用空心砖等把框子于地面撑起可以到达足够的高度(这样的目的是防止硫磺在燃烧 时候把框子烧毁)，在用竹竿等撑起一块做够可以把整个框子盖起来的塑料布，把塑料布底 部用土盖好密封，留出放入硫磺的位置不密封，点燃硫磺后下部不全部密封严实(这样可以 使硫磺燃烧时候不熄灭)；熏制时间为5h。

将对照组与实验组分别用实施例1所述的超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨 质谱技术，对对照组与实验组化学成分进行了分析鉴定。在3份实验组中均检测出了丹参素硫 酸酯、丹参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯。而3份对照组中未检测出丹参素硫酸酯、丹 参素酯亚硫酸酯及异丹参素酯亚硫酸酯。