一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒及其在肝癌血清学诊断中的应用

摘要

本发明涉及医学生物检测技术领域，本发明利用lncRNA芯片筛选与肿瘤干细胞相关的lncRNA，结果发现lncRNA-NEAT1在肝癌干细胞中高表达并可以调节肝癌干细胞的功能。本发明提供了lncRNA-NEAT1在制备肝癌诊断标志物中的应用，以及lncRNA-NEAT1在制备诊断肝癌的检测试剂或试剂盒中的应用。进一步地，本发明人建立了人血清中lncRNA-NEAT1的检测方法和提供了血清中lncRNA-NEAT1检测的试剂盒，通过对肝癌病人血清的检测，发现在血清中能够检测到lncRNA-NEAT1，并且HCC病人血清中的lncRNA-NEAT1含量明显高于正常人。本发明为肝癌血清学诊断提供了新的临床手段。

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测血清中 lncRNA-NEAT1的试剂盒及其在肝癌血清学诊断中的应用。

背景技术

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷 酸的非编码RNA，其表达具有明显的组织和细胞特异性，作用方式多样，可 以从表观遗传、转录、翻译等多个水平对基因表达进行调控。lncRNA能够广 泛地参与细胞分化、个体发育等生命过程，其异常表达与包括肿瘤在内的多 种人类重大疾病密切相关。

lncRNA-NEAT1(核旁斑组装转录本1，nuclear paraspeckle assembly  transcript 1)包括两个转录本，分别是3.7kb的NEAT1v1(NR_028272.1)和 23kb的NEAT1v2(HG503867.1)，均是核旁斑的重要组成部分。核旁斑能够 通过调节基因转录、mRNA核转位等参与调控多种生理过程如应激反应、细 胞分化(参见文献Fox,A，et al.P54nrb Forms a Heterodimer with PSP1That  Localizes to Paraspeckles in an RNA-dependent Manner.Molecular Biology of the  Cell，2005，16(11):5304–15.)。lncRNA-NEAT1与肿瘤的关系也有报道，如 缺氧诱导因子2(HIF-2)通过增强lncRNA-NEAT1的转录从而促进乳腺癌细 胞的存活(参见文献Choudhry H,et al.Tumor hypoxia induces nuclear  paraspeckle formation through HIF-2αdependent transcriptional activation of  NEAT1leading to cancer cell survival.Oncogene,2014:1-9)。此外， lncRNA-NEAT1作为雌激素受体的靶基因与前列腺癌的进展密切相关(参见 文献Chakravarty D,et al.The oestrogen receptor alpha-regulated lncRNA NEAT1 is a critical modulator of prostate cancer.Nature communications,2014,5:1-16)。 这些研究提示了lncRNA-NEAT1在肿瘤发生发展中的作用。

近些年来，血清学标志物的筛选鉴定和在疾病诊断中的应用一直是医学 领域的研究热点。非编码RNA作为血清学诊断标志物的研究取得了很大进展， 例如已有多种microRNA被发现可以用于疾病的诊断。但是，lncRNA在血清学 诊断标志物中的应用研究还非常少。以肝癌为例，目前肝癌诊断标志物主要 是甲胎蛋白(AFP)，但有相当一部分肝癌病人(30～40％)AFP检测结果呈 阴性。目前尚缺乏其他血清学检测方法可以用来发现这部分病人，使其失去 了诊断和治疗的机会。因此，寻找和发现新的血清学标志分子弥补AFP临床诊 断的不足以提高肝癌的诊断水平，是肝癌防治研究的重要内容。

Panzitt K等人应用PCR的方法首次在肝癌患者的血清中检测到了 lncRNA-HULC，提出其可能是一个肝癌诊断及预后判断的血清学标志物(参 见文献Panzitt K,et al.Characterization of HULC,a novel gene with striking  up-regulation in hepatocellular carcinoma,as noncoding RNA. Gastroenterology,2007,132(1):330-42)。

lncRNA-NEAT1作为肿瘤血清学诊断标志物的价值至今尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA NEAT1(lncRNA-NEAT1) 的新用途，具体是lncRNA-NEAT1作为肝癌血清学诊断标志物的应用，以及在 制备肝癌血清学诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒， 及其该试剂盒在肝癌血清学诊断中的应用。

在前期的研究中，本发明人所在的国际生物信号转导研究中心利用 lncRNA芯片筛选了与肝癌干细胞相关的lncRNA，结果发现lncRNA-NEAT1在 肝癌干细胞中高表达并可以调节肝癌干细胞的功能。目前认为肿瘤来源于肿 瘤干细胞，因此这些结果提示lncRNA-NEAT1在包括肝癌等恶性肿瘤发生的早 期即可能有作用，也提示了其在肿瘤诊断标志物方面可能具有一定的应用价 值。

进一步地，本发明人建立了人血清中lncRNA-NEAT1的检测方法和提供了 血清中lncRNA-NEAT1检测的试剂盒，通过对肝癌病人血清的检测，我们首先 发现在血清中能够检测到lncRNA-NEAT1，并且12例HCC病人血清中有2例 lncRNA-NEAT1含量明显高于正常人，其中1例AFP<400ug/L，提示 lncRNA-NEAT1可以作为肝癌血清学诊断标志物，并且作为AFP肝癌诊断的补 充，也提示lncRNA-NEAT1在肿瘤血清学诊断中的应用前景。

因此，我们认为，lncRNA-NEAT1具备作为肝癌诊断血清学标志物的可能 性。

本发明的第一方面，提供了一种长链非编码RNA NEAT1(lncRNA-NEAT1) 在制备肝癌诊断标志物中的应用。

本发明的第二方面，提供了lncRNA-NEAT1在制备诊断肝癌的检测试剂或 试剂盒中的应用。

特别是，lncRNA-NEAT1在制备诊断肝癌的血清学检测试剂或试剂盒中的 应用。

所述的检测试剂或试剂盒，是通过逆转录、实时定量PCR技术等方法检 测生物样品中lncRNA-NEAT1的表达量。

所述的检测试剂或试剂盒，包括：对lncRNA-NEAT1具有检测特异性的 探针、基因芯片，或PCR引物等。

所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石 蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。

所述的生物样品，优选为血清。

所述的检测试剂或试剂盒，优选为通过定量实时PCR技术检测血清中 lncRNA-NEAT1的表达量。

所述的对lncRNA-NEAT1具有检测特异性的PCR引物如下：

上游引物为：GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15)；

下游引物为：CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16)；

本发明的第三方面，提供了一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒。

本发明提供的一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒，该试剂盒的组 成包括：

1.逆转录系统

由逆转录体系缓冲液、随机引物N6、dNTPs、逆转录酶和RNA酶抑制剂 组成；

2.引物系统

由1对Real-time PCR的上、下游引物组成，引物序列如下：

上游引物为：GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15)；

下游引物为：CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16)；

引物由上下游引物等量混合至5μM。

3.扩增系统

由SYBR Premix Ex Taq^TM试剂组成。

本发明的第四方面，提供了上述用于检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂 盒的检测方法，具体步骤如下：

按常规方法抽血并取血清，富集血清中的小RNA；

由逆转录系统将RNA逆转录成cDNA；

用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定lncRNA-NEAT1的含量。

本发明的第五方面，提供了上述的检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒 在制备诊断肝癌的检测试剂盒中的应用。

本发明所述的肝癌为原发性肝细胞癌等。

本发明的lncRNA-NEAT1可以作为肝癌诊断血清学标志物，本发明为诊断 肝癌提供了新临床手段。

附图说明

图1为10个lncRNA在肝癌干细胞中的表达检测；

图2为8对引物检测lncRNA-NEAT1在血清中的表达量；

图3为正常人与肝癌病人血清中lncRNA-NEAT1的表达检测。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于 此。

实施例1：lncRNA-NEAT1的筛选、鉴定

前期我们利用高通量的lncRNA芯片筛选了与肝癌干细胞相关的lncRNA， 从筛到的lncRNA中选出了变化最显著的10个lncRNA，然后对其从Huh7肝 癌细胞中富集的肝癌干细胞中的表达进行PCR验证，结果发现 lncRNA-NEAT1在肝癌干细胞中表达最高(见图1)。

目前认为肿瘤来源于肿瘤干细胞，因此这些结果提示lncRNA-NEAT1在 包括肝癌等恶性肿瘤发生的早期即可能有作用，也提示了其在肿瘤诊断标志 物方面可能具有一定的应用价值。

实施例2：血清样本的采集、处理及提取其中的小RNA

(1)血清样本收集：收集约4ml肝细胞癌病人术前的外周血放入含EDTA 的抗凝管中,静置约1小时。

(2)血清样本处理：采集的外周血样品4000rpm 4℃离心10min，取上 清分装于EP管中，-80℃保存。

(3)提取血清中小RNA：每个血清样品均取350μl，按照从Ambion公 司购买的mirVana^TMPARIS^TMKit提取小RNA。

(4)逆转录成cDNA：每个样品取相同量RNA，用随机引物N6进行逆 转录。按照5×M-MLV RT Buffer 5μl、M-MLV Reverse transcriptase1μl、 rRNasin0.5μl(Promega公司)、dNTPs1μl、随机引物N61μl、提取的小RNA 15ul、 DEPC水(补充H₂O使总体积达到25μl)进行逆转录。以上步骤所用的tip头、 EP管均经过RNA酶灭活处理。

实施例3：引物设计与筛选

(1)引物设计：利用NCBI查得lncRNA-NEAT1的全长序列 (NR_028272.1)，针对lncRNA-NEAT1的序列利用Primer Premier 5软件设计 Real-time PCR的上下游引物8对(如表1所示)，由invitrogen公司负责引物 合成。

表1：用于检测血清中lncRNA-NEAT1设计的8对引物

(2)引物筛选：采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq^TM试剂和美国 Applied Biosystems公司的ViiA7Dx实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR 反应：

PCR条件：

按照上述Real-time PCR条件，利用3例前期制备的血清样本逆转录产物 对8对lncRNA-NEAT1引物进行检测。每个样本均做2个复孔，取其平均值 分析。

结果8对引物均能检测出信号，且溶解曲线为单峰，其中第8对引物扩 增的片段的表达量明显高于其它引物(见图2)，将PCR产物送公司测序，测 序结果经比对确实为lncRNA-NEAT1。

因此，本发明经过筛选提供了最优化的1对用于检测血清中 lncRNA-NEAT1的Real-time PCR引物，序列如下：

上游引物为：GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15)；

下游引物为：CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16)；

实施例4：正常人与肝癌病人血清中lncRNA-NEAT1的差异表达检测

按照实施例2、3相同的方法，用筛选出的引物对12例正常人血清与10 例肝癌病人术前血清中的lncRNA-NEAT1进行检测，结果发现与12例正常人 相比，10例肝癌病人有2例病人的血清lncRNA-NEAT1含量明显升高(见图 3)，而且其中1例病人AFP<80ug/L。

这一结果提示：lncRNA-NEAT1可作为肝癌血清学诊断标志物使用； lncRNA-NEAT1可能成为AFP在肝癌诊断方面必要和有益的补充。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不 限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下 还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请 权利要求所限定的范围内。