构建在电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面以及通过电压可逆控制细胞粘附的方法

摘要

本发明提供了一种构建在电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面以及通过电压可逆控制细胞粘附的方法。所述构建方法为：将金片、银片、铂片或铜片浸泡在末端连接有带电荷基团的RGD肽和一端端基为可与金、银、铂或铜自组装的基团的聚乙二醇的混合溶液中，在惰性气氛中通过自组装，得到组装好的金属片，电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面构建完成。本发明利用相同电荷之间互相排斥和相反电荷互相吸引的原理，在非特异性粘附细胞的RGD肽的末端增加一个带电荷的基团使其与抗细胞粘附的聚乙二醇以一定比例混合，在金、银、铂或铜表面形成自组装单分子膜，实现电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面的构建，可用于通过电压可逆控制细胞粘附。

说明书

技术领域

本发明属于动态控制细胞在表面粘附的生物技术领域，涉及一种构建在电 控制下可逆控制细胞粘附的智能表面以及通过电压可逆控制细胞粘附的方法， 具体涉及一种可逆控制细胞粘附的智能表面的构建方法以及可逆的控制细胞在 该智能表面即金、银、铂、铜电极表面的自组装单分子膜上粘附的方法，该方 法是通过在金、银、铂、铜电极表面施加不同的电压实现的。

背景技术

“智能”表面是能够对外界光、电、温度等变化进行响应的功能化表面， 在传感器、仿生器件、光电检测和药物释放等领域有广泛的应用前景。细胞粘 附是一种很重要的生命过程，很多疾病都与细胞粘附有着密切的关系。在表面 上动态的研究细胞粘附一直是生物学研究中的一个重要方向，因此构建能够随 外界条件的改变而改变其粘附性质的智能表面同样非常重要。

目前，能够控制细胞粘附的智能表面的种类主要有光响应、热响应、电化 学响应、酸度响应和电荷响应这几种类型。

以往的电荷响应的智能表面有的工作采用将带有电荷的基团接到烷基链末 端，通过控制带电荷基团的远离或靠近电极表面，来控制烷基链是亲水的带电 荷部位裸露还是疏水的烷基链裸露，从而控制细菌的粘附和脱附。有的工作将 带电荷的基团接到PEG分子的末端，此PEG分子与RGD肽混合自组装在电极 表面，通过控制PEG分子的直立或弯曲来控制RGD肽的裸露或隐藏，从而控 制细胞的粘附和脱附。其他的电荷响应的表面研究了荧光分子或蛋白的吸附或 脱附。

但是，在此之前的工作均未通过电荷响应的智能表面研究过RGD肽的构象 改变对细胞粘附行为的影响。

发明内容

针对已有技术的问题，本发明构建了一种可对电荷进行响应的可逆控制细 胞粘附的智能表面，将带电荷基团连接到RGD肽的末端，通过带电基团在不同 电压下远离或靠近电极表面，使RGD肽的构象发生变化，从而导致该智能表面 对细胞的粘附力的改变。在该方法中，可逆的控制细胞粘附是通过对智能表面 施加不同的电位实现的，本发明为研究细胞粘附相关工作提供了一种可靠的方 法，填补了已有技术的空白。

为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种构建在电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面的方法，将金片、银 片、铂片或铜片浸泡在末端连接有带电荷基团的RGD肽和一端端基为可与金、 银、铂或铜自组装的基团的聚乙二醇的混合溶液中，在惰性气氛中通过自组 装，得到组装好的金片、银片、铂片或铜片，电控制下可逆控制细胞粘附的智 能表面构建完成。

在本发明中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽即为RGD肽。

在本发明中，金、银、铜或者铂表面混合自组装一层单分子膜，RGD肽末 端有一个带电荷基团。

当带电荷基团为带正电荷基团时，当在金、银、铜或者铂表面施加 +0.2V～+0.4V的电压时，RGD肽处于直链状，此时对细胞的粘附力较小，而当 在金、银、铜或者铂表面施加-0.2V～-0.4V的电压时，RGD肽处于环状，对细 胞的粘附力较大。此过程是可逆的，可以通过施加的电压不同调节金、银、铜 或者铂表面对细胞的粘附。

当带电荷基团为带负电荷基团时，当在金、银、铜或者铂表面施加 -0.2V～-0.4V的电压时，RGD肽处于直链状，此时对细胞的粘附力较小，而当 在金、银、铜或者铂表面施加+0.2V～+0.4V的电压时，RGD肽处于环状，对细 胞的粘附力较大。此过程是可逆的，可以通过施加的电压不同调节金、银、铜 或者铂表面对细胞的粘附。

可与金、银、铂或铜自组装的基团为巯基、氨基或羧基。

当金属片为金片，端基为巯基时，即通过金-硫键自组装，实现智能表面的 构建。

优选地，所述金片、银片、铂片或铜片均独立地经过如下预处理过程：将 金片、银片、铂片或铜片润洗，除去表面的灰尘和有机物，然后吹干。所述润 洗可以用二次水和乙醇润洗3次。所述吹干可以用惰性气体如氩气吹干。

即，所述预处理过程如下：

所述金片经过如下预处理过程：将金片润洗，除去表面的灰尘和有机物， 然后吹干。

所述银片经过如下预处理过程：将银片润洗，除去表面的灰尘和有机物， 然后吹干。

所述铂片经过如下预处理过程：将铂片润洗，除去表面的灰尘和有机物， 然后吹干。

所述铜片经过如下预处理过程：将铜片润洗，除去表面的灰尘和有机物， 然后吹干。

优选地，所述金片、银片、铂片或铜片均独立地由如下方法制备得到：首 先在玻璃片上蒸镀铬，然后再蒸镀金、银、铂或铜。

优选地，所述金、银、铂或铜的厚度独立地为100nm。

蒸镀铬是为了使金、银、铂或铜在玻璃片上的结合更牢固，厚度没有限 制，薄薄一层即可，优选5nm。金、银、铂或铜的厚度最好大于等于100nm， 因为太薄会导致表面有缺陷，不致密，本发明选择该厚度是为了在满足实验要 求的前提下尽量节约材料成本)。

示例性的所述金片由如下方法制备得到：首先在玻璃片上蒸镀铬，然后再 蒸镀金，所述金的厚度为100nm。

示例性的所述银片由如下方法制备得到：首先在玻璃片上蒸镀铬，然后再 蒸镀银，所述银的厚度为100nm。

示例性的所述铂片由如下方法制备得到：首先在玻璃片上蒸镀铬，然后再 蒸镀铂，所述铂的厚度为100nm。

示例性的所述铜片由如下方法制备得到：首先在玻璃片上蒸镀铬，然后再 蒸镀铜，所述铜的厚度为100nm。

优选地，所述带正电荷基团为季铵盐基团，该基团较易合成，因此作为本 发明的优选技术方案。优选地，所述带负电荷基团为羧酸或磺酸基。

优选地，所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽具有如下结构：

优选地，所述聚乙二醇的分子量为150～300，如果链长太小，则无法起到 防止非特异性吸附的作用，如果链长太长，则会阻碍RGD肽的弯曲。

优选地，所述聚乙二醇具有如下结构，其分子量为196.08：

优选地，RGD肽占RGD肽和聚乙二醇的摩尔百分比为0.01～1％，例如 0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、 0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％或0.95％。在该优选 的技术方案中，金、银、铜或铂表面自组装一层混合单分子膜，其中聚乙二醇 (PEG)分子为绝大多数，可以起防止细胞的非特异性粘附的作用。RGD肽末 端有一个带电荷的基团。当带电荷基团为带正电荷基团时，当在金、银、铜或 者铂表面施加+0.2V～+0.4V的电压时，RGD肽处于直链状，此时对细胞的粘附 力较小，而当在金、银、铜或者铂表面施加-0.2V～-0.4V的电压时，RGD肽处 于环状，对细胞的粘附力较大。此过程是可逆的，可以通过施加的电压不同调 节金、银、铜或者铂表面对细胞的粘附。当带电荷基团为带负电荷基团时，当 在金、银、铜或者铂表面施加-0.2V～-0.4V的电压时，RGD肽处于直链状，此 时对细胞的粘附力较小，而当在金、银、铜或者铂表面施加+0.2V～+0.4V的电 压时，RGD肽处于环状，对细胞的粘附力较大。此过程是可逆的，可以通过施 加的电压不同调节金、银、铜或者铂表面对细胞的粘附。

在本发明中，金片、银片、铂片或者铜片的加入量以其能够完全浸泡在混 合溶液中即可。

优选地，所述惰性气氛为氦气、氖气或氩气。

优选地，所述自组装的时间为0.5～7天，优选48h。组装时间长一些，可使 自组装膜更致密一些，0.5～7天均可，但为了减少样品准备时间但又尽可能使自 组装膜致密，优选48h。

优选地，待自组装完成后，将金片、银片、铂片或铜片取出，洗涤，以除 去金片、银片、铂片或铜片表面物理吸附的分子，然后吹干，得到组装好的金 片、银片、铂片或铜片，电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面构建完成。

本发明的目的之二在于提供一种通过电压可逆控制细胞粘附的方法，将采 用如上所述的方法组装好的金片、银片、铂片或铜片和细胞置于培养皿中，通 过施加电压的改变，实现金片、银片、铂片或铜片表面RGD肽分子构象的改 变，从而实现对细胞的粘附力的改变，实现可逆控制细胞粘附。

当带电荷基团为带正电荷基团时，当在金、银、铜或者铂表面施加 +0.2V～+0.4V的电压时(优选+0.3V)，RGD肽处于直链状，此时对细胞的粘附 力较小。电压太小则分子不能完全弯直，形成直链状RGD肽，而电压太大则会 对细胞的正常生产产生影响。而当在金、银、铜或者铂表面施加-0.2V～-0.4V (优选-0.3V)的电压时，RGD肽处于环状，对细胞的粘附力较大。电压太小则 分子不能完全弯过来，形成环状RGD肽，而电压太大则会对细胞的正常生产产 生影响。此过程是可逆的，可以通过施加的电压不同调节金、银、铜或者铂表 面对细胞的粘附。

当带电荷基团为带负电荷基团时，当在金、银、铜或者铂表面施加 -0.2V～-0.4V(优选-0.3V)的电压时，RGD肽处于直链状，此时对细胞的粘附力 较小。电压太小则分子不能完全弯直，形成直链状RGD肽，而电压太大则会对 细胞的正常生产产生影响。而当在金、银、铜或者铂表面施加+0.2V～+0.4V(优 选+0.3V)的电压时，RGD肽处于环状，对细胞的粘附力较大。电压太小则分子 不能完全弯过来，形成环状RGD肽，而电压太大则会对细胞的正常生产产生影 响。此过程是可逆的，可以通过施加的电压不同调节金、银、铜或者铂表面对 细胞的粘附。

与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的构建在电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面的方法，巧妙 的利用相同电荷之间互相排斥和相反电荷互相吸引的原理，在非特异性粘附细 胞的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的末端增加一个带电荷的基团使其与抗 细胞粘附的聚乙二醇以一定比例混合，在金、银、铂或铜表面形成自组装单分 子膜，实现电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面的构建。

在此基础上，本发明提供了电控制下可逆控制细胞在金、银、铂或铜表面 自组装单分子膜上粘附的方法。当带电荷基团为带正电荷基团时，当在金、 银、铜或者铂表面施加+0.2V～+0.4V的电压时，RGD肽处于直链状，此时对细 胞的粘附力较小，而当在金、银、铜或者铂表面施加-0.2V～-0.4V的电压时， RGD肽处于环状，对细胞的粘附力较大。当带电荷基团为带负电荷基团时，当 在金、银、铜或者铂表面施加-0.2V～-0.4V的电压时，RGD肽处于直链状，此 时对细胞的粘附力较小，而当在金、银、铜或者铂表面施加+0.2V～+0.4V的电 压时，RGD肽处于环状，对细胞的粘附力较大。该过程是可逆的，可通过施加 电压的不同而调节金、银、铜或铂表面对细胞的粘附，这将为研究细胞和细胞 外基质相互作用以及研究多细胞之间相互作用提供一个有效的工具，为研究与 细胞粘附相关的疾病打下基础。

此外，该通过电压可逆控制细胞粘附的方法对多种细胞均有效，包括：成 纤维细胞(3T3)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，人乳腺癌细胞(MCF-7) 等。

附图说明

图1为本发明通过电压可逆控制细胞粘附的方法的原理图。

图2为对末端是带有正电荷季铵盐的RGD肽(b)和末端是电中性氨基的 RGD肽(a)两个分子的分子静电势的理论计算结果，该理论结果是用软件高斯 09(Gaussian 09)进行计算的。

图3为不同的细胞在此表面上不同电压下接种2h后的粘附情况。

图4为不同的细胞在此表面上不同电压下接种2h后的粘附情况的统计结 果。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

理论模拟

为了确定该发明的有效性，证明该末端有季铵盐基团的RGD肽上的正电荷 主要集中在分子的末端，这样才能在加电压时起到只对分子末端起到排斥或吸 引的作用，对分子进行了分子静电势的理论模拟。我们分别模拟了末端带有季 铵盐的RGD肽和末端为氨基的RGD肽的分子静电势，模拟结果如图2所示。 从结果中，我们可以看出，相比末端为氨基的RGD肽，末端带季铵盐的RGD 肽的电正性很强，且主要集中在季铵盐所在的末端区域。这就保证了该发明理 论上的可行性。

实施例2

电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面的构建

首先将蒸镀好的金片(2cm×0.5cm，玻璃片上先蒸镀一层5nm厚的铬， 再蒸镀一层100nm的金)分别在二次水和乙醇中润洗3次，除去金片表面的灰 尘和有机物，用氩气吹干，待用。

配置RGD肽和PEG的混合乙醇溶液5ml，其中RGD肽的质量为0.04mg， 浓度为10^-5mol/L，PEG的体积为13.2μL，浓度为99×10^-4mol/L，通氩气以除 去氧气，储存在10ml的离心管中。将处理好的金片浸泡在溶液中，密闭，静 置48h。在这48h内，溶液中的RGD肽分子与PEG分子按溶液中的比例(0.1％ RGD肽)通过金-硫键自组装到金片表面。48h后，将金片取出，用无水乙醇冲 洗5遍，以除去金片表面物理吸附的分子，并用氩气吹干，此时，得到组装好 的金片，电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面构建完成。

细胞培养

使用DMEM高糖培养基培养小鼠NIH 3T3成纤维细胞，培养基中含有 10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素或链霉素，细胞密度为10⁵个/ml， 在37℃条件下，通入二氧化碳使培养环境中二氧化碳的体积浓度为5％(v/v)， 培养2h。HUVEC细胞和MCF-7细胞与3T3细胞的培养条件相同。

电控制下可逆控制细胞在金片表面的自组装单分子膜上的粘附

将处理好的金片放入到直径为6cm的细胞培养皿中，作为工作电极，以银 丝(直径2mm，长度5cm，纯度99.99％)为参比电极，以铂丝(直径2mm， 长度5cm，纯度99.99％)位对电极，连接好电化学工作站(CHI 1040C)。设 置好电化学工作站的参数，采用恒电压模式，设置电压(-0.3V或+0.3V)，时 间为7200s。

将前述细胞加到培养皿中，细胞的密度为0.5×10⁵个/cm²，操作电化学工 作站，开始施加电压，在细胞培养条件下培养2h，2h后，停止施加电压，取 出银丝和铂丝，在光学显微镜下进行观察并拍照，如图3和图4所示。

图3为三种细胞在不同的电压下在表面的粘附情况。我们可以看出，当电 压为-0.3V时，这三种细胞的粘附数量明显多于当电压为+0.3V时，这个结果 在图4中的在不同电压下粘附细胞数量的统计图中也可看出。这说明当电极表 面加-0.3V的电压时，表面对细胞的粘附力更大，即RGD肽表现为对细胞粘附 力较大的环状构象；而当电极表面加+0.3V的电压时，表面对细胞的粘附力较 小，即RGD肽表现为对细胞粘附力较小的链状构象。且这个表面对多种细胞均 有效，说明该表面具有普适性。

实施例3

电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面的构建

首先将蒸镀好的银片(2cm×0.5cm，玻璃片上先蒸镀一层5nm厚的铬， 再蒸镀一层100nm的银)分别在二次水和乙醇中润洗3次，除去银片表面的灰 尘和有机物，用氩气吹干，待用。

配置RGD肽和PEG的混合乙醇溶液5ml，其中RGD肽的质量为0.04mg， 浓度为10^-5mol/L，PEG的体积为13.2μL，浓度为99×10^-4mol/L，通氩气以除 去氧气，储存在10ml的离心管中。将处理好的银片浸泡在溶液中，密闭，静 置12h。在这12h内，溶液中的RGD肽分子与PEG分子按溶液中的比例(0.1％ RGD肽)自组装到银片表面。12h后，将银片取出，用无水乙醇冲洗5遍，以 除去银片表面物理吸附的分子，并用氩气吹干，此时，得到组装好的银片，电 控制下可逆控制细胞粘附的智能表面构建完成。

细胞培养同实施例2

电控制下可逆控制细胞在银片表面的自组装单分子膜上的粘附

将处理好的银片放入到直径为6cm的细胞培养皿中，作为工作电极，以银 丝(直径2mm，长度5cm，纯度99.99％)为参比电极，以铂丝(直径2mm， 长度5cm，纯度99.99％)位对电极，连接好电化学工作站(CHI 1040C)。设 置好电化学工作站的参数，采用恒电压模式，设置电压(-0.3V或+0.3V)，时 间为7200s。

将前述细胞加到培养皿中，细胞的密度为0.5×10⁵个/cm²，操作电化学工 作站，开始施加电压，在细胞培养条件下培养2h，2h后，停止施加电压，取 出银丝和铂丝，在光学显微镜下进行观察并拍照。

通过拍照，我们可以看出，当电压为-0.3V时，这三种细胞的粘附数量明 显多于当电压为+0.3V时。这说明当电极表面加-0.3V的电压时，表面对细胞 的粘附力更大，即RGD肽表现为对细胞粘附力较大的环状构象；而当电极表面 加+0.3V的电压时，表面对细胞的粘附力较小，即RGD肽表现为对细胞粘附力 较小的链状构象。且这个表面对多种细胞均有效，说明该表面具有普适性。

实施例4

电控制下可逆控制细胞粘附的智能表面的构建

首先将蒸镀好的铜片(2cm×0.5cm，玻璃片上先蒸镀一层5nm厚的铬， 再蒸镀一层100nm的铜)分别在二次水和乙醇中润洗3次，除去铜片表面的灰 尘和有机物，用氩气吹干，待用。

配置RGD肽和PEG的混合乙醇溶液5ml，其中RGD肽的质量为0.04mg， 浓度为10^-5mol/L，PEG的体积为13.2μL，浓度为99×10^-4mol/L，通氩气以除 去氧气，储存在10ml的离心管中。将处理好的铜片浸泡在溶液中，密闭，静 置60h。在这60h内，溶液中的RGD肽分子与PEG分子按溶液中的比例(0.1％ RGD肽)自组装到铜片表面。60h后，将铜片取出，用无水乙醇冲洗5遍，以 除去铜片表面物理吸附的分子，并用氩气吹干，此时，得到组装好的铜片，电 控制下可逆控制细胞粘附的智能表面构建完成。

细胞培养同实施例2

电控制下可逆控制细胞在铜片表面的自组装单分子膜上的粘附

将处理好的铜片放入到直径为6cm的细胞培养皿中，作为工作电极，以银 丝(直径2mm，长度5cm，纯度99.99％)为参比电极，以铂丝(直径2mm， 长度5cm，纯度99.99％)位对电极，连接好电化学工作站(CHI 1040C)。设 置好电化学工作站的参数，采用恒电压模式，设置电压(-0.3V或+0.3V)，时 间为7200s。

将前述细胞加到培养皿中，细胞的密度为0.5×10⁵个/cm²，操作电化学工 作站，开始施加电压，在细胞培养条件下培养2h，2h后，停止施加电压，取 出银丝和铂丝，在光学显微镜下进行观察并拍照。

通过拍照，我们可以看出，当电压为-0.3V时，这三种细胞的粘附数量明 显多于当电压为+0.3V时。这说明当电极表面加-0.3V的电压时，表面对细胞 的粘附力更大，即RGD肽表现为对细胞粘附力较大的环状构象；而当电极表面 加+0.3V的电压时，表面对细胞的粘附力较小，即RGD肽表现为对细胞粘附力 较小的链状构象。且这个表面对多种细胞均有效，说明该表面具有普适性。

实施例5

其余与实施例2相同，除设置电压为-0.2V或+0.2V，可观察到与实施例2 相同的结果。

实施例6

其余与实施例2相同，除设置电压为-0.4V或+0.4V，可观察到与实施例2 相同的结果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明 并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实 施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品 各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保 护范围和公开范围之内。