一种用于痰液核酸的解旋酶依赖性等温扩增添加剂及解旋酶依赖性等温扩增方法

摘要

本发明涉及一种用于痰液核酸的解旋酶依赖性等温扩增添加剂及解旋酶依赖性等温扩增方法，所述的添加剂由甜菜碱、二甲基亚砜、乙二醇二乙醚二胺四乙酸混合而成，所述的甜菜碱、所述的二甲基亚砜、所述的乙二醇二乙醚二胺四乙酸的物质的量比为0.4~2:0.8~3.4:1。应用本发明中的添加剂及扩增方法，可以减少痰液样本DNA对HDA的抑制作用，成功扩增痰液DNA中的目的基因片段，有效避免假阴性结果，可用于临床检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于痰液核酸的解旋酶依赖性等 温扩增添加剂及解旋酶依赖性等温扩增方法。

背景技术

体外核酸扩增被广泛用在研究、医学、食品科学和农业等领域，其中最为 广泛被研究和使用的是聚合酶链式反应(PCR)。然而PCR反应依赖于提高和 降低反应混合物的温度循环，需要配备专用的热循环仪器才能进行，并且扩增 时间长，一般需要几个小时，难以在基层尤其是一些偏远地区或条件较差的实 验室推广使用。针对常规PCR反应的不足，以核酸等温扩增技术为基础的检 测技术得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术完成了从实验室到实际应用的 过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛运用。特别是在临床 和现场(point－of－care)快速诊断技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突 出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间且 摆脱了对精良仪器设备的依赖，使得我们对病原体的检测诊断得以快速并高通 量的实现。一个此类例子是新英格兰生物实验室公司发明(专利号03824150) 的解旋酶依赖性等温扩增(HDA)，该技术的特点在于通过解旋酶打开双链核 酸，从而不需要加热或热循环，在恒定的温度如55℃～70℃下即可进行聚合酶 链式反应，因此反应可在常见的基础装置如水浴锅中进行，避免使用昂贵的热 循环仪器，具有更高的灵活性。HDA也可使用序列特异性探针来检测扩增产 物，实现多重实时定量的效果。

体外扩增技术在实际应用当中常见抑制现象。采样方法、样本类型、提取 试剂和提取方法均会影响得到的DNA模板的质量，导致不同程度的扩增抑制。 PCR反应中的抑制现象已经过大量研究，并积累了多种优化手段(如Mark  Wilks(ed.),PCR Detection of Microbial Pathogens:Second Edition,Methods  in Molecular Biology,vol.943,Chapter 2中的报道)，而HDA技术由于反应 温度温和恒定，反应体系中关键的酶组分有2～3种，使反应体系相对PCR更 易受到抑制因子的干扰。此外因为HDA的反应原理和条件与PCR不同，现有 的PCR抑制消除剂并不都适用于HDA。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于痰液核酸的解旋酶依赖性等 温扩增添加剂，该添加剂能够改善抑制因子对扩增反应的抑制。

本发明所要解决的另一技术问题是提供一种解旋酶依赖性等温扩增方法， 抑制因子对该方法的影响较小。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种用于痰液核酸的解旋酶依赖性等温扩增添加剂，所述的添加剂由甜菜 碱、二甲基亚砜、乙二醇二乙醚二胺四乙酸混合而成，所述的甜菜碱、所述的 二甲基亚砜、所述的乙二醇二乙醚二胺四乙酸的物质的量比为0.4～2:0.8～3.4:1。

一种解旋酶依赖性等温扩增方法，所述方法采用的解旋酶依赖性等温扩增 反应体系包含有添加剂，所述添加剂包含甜菜碱、二甲基亚砜和乙二醇二乙醚 二胺四乙酸，其中，甜菜碱在解旋酶依赖性等温扩增反应体系中的物质的量浓 度为0.2mol/L～0.6mol/L，二甲基亚砜在所述的解旋酶依赖性等温扩增反应体 系中的体积浓度为3％～7％，所述的乙二醇二乙醚二胺四乙酸在所述的解旋酶 依赖性等温扩增反应体系中的物质的量浓度为0.3mol/L～0.5mol/L。

具体地，所述的解旋酶依赖性等温扩增反应体系还包含解旋酶、DNA聚 合酶、单链DNA结合蛋白、MgSO₄、dNTP、dATP、探针、上游引物、下游 引物、缓冲剂、DNA模板和双蒸水。

更具体地，在起始反应体系中，所述的解旋酶的添加量为14～20ng/μL， 所述的DNA聚合酶的添加量为2.6～4U/μL，所述的单链DNA结合蛋白的添加 量为1.6～3.2ng/μL，所述的MgSO4添加量为4～6.5mmol/L，所述的dNTP的 添加量为0.4～0.7mmol/L，所述的dATP的添加量为4.5～6.5mmol/L，所述的 探针的添加量为50～120nmol/L，所述的上游引物的添加量为50～120nmol/L， 所述的下游引物的添加量为150～360nmol/L，所述的添加剂占所述的解旋酶依 赖性等温扩增反应体系总体积的10～20％，所述的DNA模板占所述的解旋酶 依赖性等温扩增反应体系总体积的2～8％。

更具体地，所述的缓冲剂包括在所述的解旋酶依赖性等温扩增反应体系中 的物质的量浓度为30mmol/L～100mmol/L的NaCl、在所述的解旋酶依赖性等 温扩增反应体系中的物质的量浓度为8mmol/L～15mmol/L的KCl、在所述的 解旋酶依赖性等温扩增反应体系中的物质的量浓度为16mmol/L～25mmol/L的 Tris-HCl。

更具体地，所述的探针的一端带有荧光基团，另一端带有淬灭基团。

更具体地，所述的探针的5’端带有荧光基团，3’端带有淬灭基团，所述的 荧光基团为Texas Red、Cy5等，所述的淬灭基团为BHQ2、BHQ3等。

更具体地，所述的DNA模板是自痰液中提取的DNA。

更具体地，所述的痰液经NaOH消化后，再进行所述的DNA模板的提取。

更具体地，所述方法具体实施如下：将组成解旋酶依赖性等温扩增反应体 系的各种成分混合后，置于55℃～70℃下恒温扩增40min～60min。

具体地，所述的解旋酶依赖性等温扩增反应体系在60℃～65℃下进行。

上述添加剂在采用解旋酶依赖性等温扩增方法检测痰液核酸中的应用。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

1)在解旋酶依赖性等温扩增反应体系中加入添加剂，能够显著提高痰液 核酸中目的基因的扩增效率，原有体系不能正常扩增的已知阳性样本加入添加 剂后成功扩增；

2)在解旋酶依赖性等温扩增反应体系中加入添加剂，可以消除不同方法 抽提的痰液核酸中可能存在的不同抑制因子的抑制作用；

3)解旋酶依赖性等温扩增反应体系中加入添加剂，在提高检测灵敏度的 同时并未降低反应特异性，已知阴性样本检测显示为阴性；

总之，应用本发明中的添加剂及扩增方法，可以减少痰液样本对HDA的 抑制作用，成功扩增痰液DNA中的目的基因片段，有效避免假阴性结果，可 用于临床检测。

附图说明

附图1为实施例1和对比例1的扩增结果图；

附图2为实施例2和对比例2的扩增结果图；

附图3为实施例3和对比例3的扩增结果图；

附图4为实施例4和对比例4的扩增结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以 下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调 整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。

下例实施例旨在举例说明而不是限制本发明，下列实施例通过检测TB基 因组中IS6110基因的HDA扩增，列举了添加剂对于不同方法抽提的痰液核酸 样本目的基因扩增的促进作用。IS6110是结核杆菌染色体DNA中的一段重复 插入序列，含有1361bp的核苷酸和28bp的反向末端重复序列，存在于结核分 枝杆菌复合群中，为检测结核分枝杆菌的靶基因之一，本实施例中的TB基因 组DNA的获得途径为：应用QIAamp DNA mini试剂盒从培养的结核杆菌中 提取。

上游引物、下游引物和探针具体可根据需要扩增的基因进行选择，没有特 别限制和要求。

本实施例中，上游引物和下游引物的序列来自于Luo et al.，Comparison of  Single-Copy and Multicopy Real-Time PCR Targets for Detection of  Mycobacterium tuberculosis in Paraffin-Embedded Tissue,J Clin Microbiol (2010)48(7):2569-70。扩增产物位于IS6110基因内。

探针序列为上述上下游引物扩增产物中的一段序列，长度为19nt，可形成 茎环结构，5’端带有Texas Red荧光基团，3’端带有BHQ2淬灭基团。

下列实施例中的解旋酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、MgSO4、dNTP、 dATP、缓冲剂、添加剂的获得途径为：解旋酶，DNA聚合酶，单链DNA结 合蛋白来自美国BioHelix公司，MgSO4来自Sigma-Aldrich公司，dNTP和 dATP来自新英格兰生物实验室公司，缓冲剂中的NaCl来自Ambion公司， KCl来自Fluka公司，Trix-HCl来自Sigma公司。

实施例1：利用市售结核杆菌检测试剂盒中的DNA提取试剂提取DNA检 测IS6110基因的HDA扩增

(1)痰液经过NaOH消化后，应用市售结核杆菌检测试剂盒中的DNA 提取试剂提取DNA，最终洗脱体积为100微升，即得DNA模板。

DNA模板包括：

空白阴性对照模板：即采用双蒸水代替从痰液中提取的DNA模板；

阳性对照模板：10拷贝待扩增DNA模板；

已知阳性痰液核酸样本；

已知阴性痰液核酸样本。

(2)解旋酶依赖性等温扩增反应体系：其中每25μL HDA扩增体系包括：

其中缓冲剂的具体组分及工作浓度如下：NaCl的工作浓度为40mmol/L， KCl的工作浓度为10mmol/L，Tris-HCl的工作浓度为20mmol/L。

其中添加剂的具体组分及工作浓度如下：0.2M甜菜碱，5％(v/v)二甲基 亚砜和0.3M乙二醇二乙醚二胺四乙酸。

上述工作浓度指的是在解旋酶依赖性等温扩增反应体系中的浓度。

(3)扩增程序：将上述解旋酶依赖性等温扩增反应体系在63℃下扩增 45min，每分钟于橙色(Texas Red)通道收集一次荧光信号。HDA反应所用仪器 为QIAGEN的Rotor GeneQ实时荧光定量PCR仪。扩增具体Ct值参见表1。

对比例1

对比例1与实施例1的区别点仅在于对比例1中不添加添加剂，其他均与 实施例1相同。扩增具体Ct值参见表1。

表1

结果显示，对比例1和实施例1中，空白阴性对照均没有扩增，阳性对照 10拷贝纯化DNA模板均正常扩增，证明两种HDA反应体系均可正常进行扩 增反应。对于利用市售结核杆菌检测试剂盒中的DNA提取试剂抽提的痰液核 酸样本，对比例1的反应体系中由于痰液样本中的抑制因子影响，5个已知阳 性痰液核酸样本无扩增；实施例1中，该5个已知阳性样本均能成功扩增。同 时对于已知阴性的痰液核酸样本，这两种HDA反应体系结果显示为阴性。

实施例2利用商品化的QIAamp DNA mini kit抽提试剂盒抽提痰液DNA 检测IS6110基因的HDA扩增

(1)痰液经过NaOH消化后，按QIAamp DNA mini kit抽提试剂盒具体 操作要求提取DNA，即得DNA模板。

(2)解旋酶依赖性等温扩增反应体系与实施例1相同。

(3)扩增程序：将上述解旋酶依赖性等温扩增反应体系在65℃下扩增 45min，每分钟于橙色(Texas Red)通道收集一次荧光信号。HDA反应所用仪器 为QIAGEN的Rotor GeneQ实时荧光定量PCR仪。扩增具体Ct值参见表2。

对比例2

对比例2与实施例2的区别点仅在于对比例2中不添加添加剂，其他均与 实施例2相同。扩增具体Ct值参见表2。

表2

结果显示，对比例2和实施例2的反应体系，空白阴性对照均没有扩增， 阳性对照10拷贝纯化DNA模板均正常扩增，证明两种HDA反应体系均可正 常进行扩增反应。对于利用QIAamp DNA mini kit抽提试剂盒抽提的痰液核酸 样本，对比例2的原始HDA反应体系中由于痰液样本中的抑制因子影响，4 个已知阳性痰液核酸样本无扩增；实施例2中，该4个已知阳性样本均能成功 扩增。同时对于已知阴性的痰液核酸样本，这两种HDA反应体系结果显示为 阴性。

上述实验结果表明痰液核酸样本的HDA反应体系加入添加剂后，可以提 高目的基因的扩增效率和灵敏度，对于不同抽提方法得到痰液DNA都具有显 著的促进作用，并且保持了良好的反应特异性。

实施例3：利用市售结核杆菌检测试剂盒中的DNA提取试剂提取DNA检 测IS6110基因的HDA扩增

(1)实施例3中的样本DNA模板的获得方法与实施例1相同，DNA模板 包括空白阴性对照和2个已知阳性痰液核酸样本。

(2)解旋酶依赖性等温扩增反应体系与实施例1相同。

(3)扩增程序与实施例1相同。

对比例3与实施例3的区别点仅在于对比例3中添加剂组分中甜菜碱的工 作浓度为0.8M，其他均与实施例3相同。扩增具体Ct值参见表3。

表3

结果显示实施例3中两个已知阳性痰液样本均正常扩增，对比例3中样本 1可以正常扩增但Ct值远大于实施例3中样本1的Ct值；对比例3中样本2 不能正常扩增，说明添加剂组分甜菜碱的工作浓度为0.8M时，该反应体系的 扩增效率明显降低。

上述实验结果表明当添加剂组分甜菜碱的工作浓度不在权利要求保护范 围内时，反应体系扩增效率明显降低或体系不能正常扩增，所以添加剂组分甜 菜碱的工作浓度应设定在权利要求保护范围之内。

实施例4：利用商品化的QIAamp DNA mini kit抽提试剂盒抽提痰液DNA 检测IS6110基因的HDA扩增

(1)实施例4中的样本DNA模板的获得方法与实施例1相同，DNA模板 包括空白阴性对照和2个已知阳性痰液核酸样本。

(2)解旋酶依赖性等温扩增反应体系与实施例1相同。

(3)扩增程序与实施例1相同。

对比例4与实施例4的区别点仅在于对比例4中添加剂组分中不添加乙二 醇二乙醚二胺四乙酸，其他均与实施例4相同。扩增具体Ct值参见表4。

表4

结果显示实施例4中两个已知阳性痰液样本均正常扩增，对比例4中样本 1Ct值远大于实施例4中样本1的Ct值；对比例4中样本2不能正常扩增， 说明添加剂组分不添加乙二醇二乙醚二胺四乙酸时，该反应体系的扩增效率明 显降低。

上述实验结果表明当添加剂不加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸时，反应体系 扩增效率明显降低或体系不能正常扩增，所以乙二醇二乙醚二胺四乙酸应作为 权利要求保护的一种必要添加剂。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够 了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本 发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。