感受胞内pH变化的Smad5蛋白及其应用

摘要

本发明提供了一种感受胞内pH变化的Smad5蛋白及其应用。具体地，本发明提供了一种对于胞内pH高度敏感的蛋白即Smad5蛋白。本发明的研究表明，该Smad5蛋白对于温度、胞外pH和胞外渗透压的变化高度敏感，而温度、胞外pH和胞外渗透压的变化都会改变胞内pH的变化，胞内pH的变化最终影响Smad5的核浆穿梭和核浆分布。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及感受胞内pH变化的Smad5蛋白及其应用。 

背景技术

所有生物体都需要适应环境的变化，这包括温度、胞外pH和渗透压的变化，营养匮乏及氧自由基压力。细胞对不断变化的环境条件的适应能力，对于其在不利环境下的生存是必不可少的。 

生物体要适应环境压力，其首先需要感知这种压力，然后传导压力信号。因此，每种生物体都会有一些列压力感受器来检测外界环境的变化。例如，对于哺乳动物，在感觉神经元的膜上存在能感受温度变化的离子通道蛋白，这些通道蛋白能够感受外界温度的变化，从而使动物体免受极端温度的伤害⁴。在酵母中，渗透压的感受是通过膜上蛋白Sln1、Hkr1和Msb2来实现的。在哺乳动物的细胞中，AMPK蛋白激酶和mTOR蛋白能感受营养的缺乏状况，从而使细胞相应的控制生长状况。 

在细胞内，几乎所有生理过程都是胞内pH值所依赖的，因此，对胞内pH需要进行严格的调控。然而，胞内pH受到不断变化的胞内外环境影响，如胞外pH、渗透压的变化，代谢酸的不断积累等等。因而，完善的胞内pH的感受和调节机制对维持胞内pH的稳态是至关重要的。 

在真核细胞内，至今所发现的对pH敏感的蛋白大多都是位于质膜上的通道蛋白，如Na⁺-H⁺泵，其能排出H⁺，从而调控胞内的酸性环境。Cl^--HCO₃^-泵能排出HCO₃^-来碱化胞浆。另外，Anne等人的研究发现，在人的大脑和脊髓中ASIC3离子通道能同时感受酸碱的变化。然而，是否还存在其它对胞内pH高度敏感的蛋白仍不清楚。 

综上所述，本领域对于pH敏感的蛋白的研究尚不够充分，尤其是对于胞内pH敏感型蛋白知之甚少。 

因此，本领域迫切需要开发新的胞内pH敏感型蛋白，以便应用于不同的场合。 

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的胞内pH敏感型蛋白及其应用。 

在本发明的第一方面，提供了一种Smad5蛋白或其编码序列的用途，用于构建 具有核浆穿梭功能的重组蛋白。 

在另一优选例中，所述的重组蛋白为融合蛋白。 

在另一优选例中，所述的融合蛋白是Smad5与蛋白标签序列的融合蛋白。 

在另一优选例中，所述的融合蛋白是Smad5与荧光蛋白的融合蛋白。 

在另一优选例中，所述的融合蛋白是Smad5-GFP融合蛋白。 

在另一优选例中，所述的Smad5蛋白是野生型或突变型。 

在另一优选例中，所述的Smad5蛋白具有野生型Smad5的MH1结构域。 

在另一优选例中，所述的Smad5蛋白的MH1具有选自下组三个酸性及碱性氨基酸残基区段：如SEQ ID NO.:2中第25位至28位、第40位至46位、第50位至53位所示的区段。 

在另一优选例中，所述的Smad5蛋白具有一个或多个NES序列。 

在本发明的一个优选实施例中，所述的重组蛋白具有选自下组的一种或多种功能： 

(a)所述重组蛋白的核浆穿梭受温度调控；(即可感受低温，并在低温下导致促进重组蛋白的出核；感受高温，并在高温下导致促进重组蛋白的入核)； 

(b)所述重组蛋白的核浆穿梭受胞外pH调控；(即可感受胞外pH升高情况(如pH高于7.48时)导致促进重组蛋白的出核；感受胞外pH降低情况(如pH低于6.62时)导致促进重组蛋白的入核)； 

(c)所述重组蛋白的核浆穿梭受胞内pH调控；(即可感受胞内pH升高情况(如pH高于7.48时)导致促进重组蛋白的出核；感受胞内pH降低情况(如pH低于6.62时)导致促进重组蛋白的入核)； 

(d)所述重组蛋白的核浆穿梭受胞外渗透压的调控；(即可感受胞外渗透压升高情况(如渗透压高于350mOSM/kg时)导致促进重组蛋白的出核；感受胞外渗透压降低情况(如渗透压低于250mOSM/kg时)导致促进重组蛋白的入核)。 

在本发明的第二方面，提供了一种Smad5的MH1结构域(或其编码序列)的用途，用于构建感受温度变化、胞外pH变化、胞内pH变化以及胞外渗透压变化的重组蛋白。 

在另一优选例中，所述的重组蛋白为融合蛋白。 

在另一优选例中，所述的重组蛋白不是Smad5蛋白。 

在另一优选例中，所述的融合蛋白含有Smad5的MH1结构域。 

在另一优选例中，所述的融合蛋白是Smad1与Smad5互换MH1结构域所形成的融合蛋白。 

在本发明的一个优选例中，所述的Smad5的MH1结构域具有SEQ ID NO.:2中第25-28位、第40-46位、第50-53位所示的三个酸性及碱性氨基酸残基区段。 

在本发明的另一个优选例中，所述的Smad5的MH1结构域的氨基酸序列如SEQ  ID NO.:2中第1-133位所示。 

在本发明的第三方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白含有(a)外源的、温度/胞内外pH/渗透压感受元件(核浆穿梭信号感受元件)以及(b)与所述元件(a)操作性相连的第一蛋白的氨基酸序列，并且所述的重组蛋白不是Smad5蛋白。 

在另一优选例中，所述的温度/胞内外pH/渗透压感受元件是来源于Smad5的MH1结构域。 

在本发明的一个优选例中，所述的重组蛋白还含有一个或多个NES序列。 

在另一优选例中，所述的重组蛋白还含有来源于Smad蛋白的MH2结构域和/或Linker区域。 

在另一优选例中，所述的重组蛋白是融合蛋白。 

在本发明的第四方面，提供了一种核酸序列，所述核酸序列编码本发明第三方面所述的重组蛋白。 

在本发明的第五方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第四方面所述的核酸序列。 

在本发明的第六方面，提供了一种重组细胞，所述的重组细胞含有本发明第五方面所述的载体或基因组中整合有本发明第四方面所述的核酸序列。 

在本发明的第七方面，提供了一种产生本发明第三方面所述的重组蛋白的方法，包括步骤： 

(i)培养本发明第六方面所述的重组细胞，从而表达本发明第三方面所述的重组蛋白；和 

(ii)分离或纯化所述的重组蛋白。 

在本发明第八方面，提供了一种Smad5蛋白的用途，用于制备感受胞内pH变化、胞外pH变化、胞外渗透压变化、温度变化、或其组合的检测试剂或试剂盒。 

在本发明的第九方面，提供了一种确定待测物质能够引起胞内pH变化的方法，包括步骤： 

(a)在测试组中，在所述待测物质存在下，培养细胞，并观察所述细胞中Smad5蛋白的核浆穿梭情况；和 

在对照组中，在无所述待测物质存在下，在相同条件下培养相同的细胞，并观察所述细胞中Smad5蛋白的核浆穿梭情况； 

(b)比较测试组与对照组中Smad5蛋白的核浆穿梭情况，其中，如果测试组中位于细胞核中的Smad5蛋白数量与对照组存在显著差异，则提示该待测物质能够引起胞内pH变化；如果测试组中位于细胞核中的Smad5蛋白数量与对照组不存在显著差异，则提示该待测物质不引起胞内pH变化。 

在另一优选例中，还包括步骤(c)，对于步骤(b)所选出的待测物质，进一步测定 (如通过BCECF-AM法)测试组和对照组中的胞内pH值。 

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。 

附图说明

图1显示了低温下Smad5位于胞浆中。其中： 

图1A显示了时间推移的实验结果，表明25℃下GFP-Smad5逐渐转移到胞浆中，而GFP或GFP-Smad1不受影响。 

图1B显示了激光共聚焦实验结果，表明当温度低于32.5℃时，GFP-Smad5大部分位于胞浆。 

图1C显示了在不同温度下GFP-Smad5的核浆比率。 

图1D显示了Western blot实验的结果，表明内源性Smad5也存在温度敏感的核浆穿梭现象。 

图2显示了在低温下，Smad5存在CRM1受体介导的主动出核现象，并且存在三个出核信号来调控其快速出核。其中： 

图2A显示了在37℃下，甲醇预处理GFP-Smad5稳定表达293细胞1小时，不改变其核浆分布；低温仍会引起核浆穿梭。 

图2B显示了在37℃下，5ng/ml LMB预处理GFP-Smad5稳定表达293细胞1小时，Smad5完全位于核内；低温下，GFP-Smad5不在出核。 

图2C和图2D显示了先将GFP-Smad5稳定表达的293细胞放置于25℃下30分钟，Smad5完全位于胞浆。然后用5ng/ml LMB处理40分钟，GFP-Smad5仍能进核。这说明低温引起Smad5的主动出核而不影响其进核。 

图2E为Smad5三个NES示意图。 

图2F显示了在293中瞬时转染GFP-Smad5，在25℃，其仍会出核。 

图2G,2H和2I显示了单独突变三个NES，低温下其出核速率明显降低。 

图2J显示了联合突变三个NES将完全阻止其低温下出核。 

图3显示了Smad5对胞外pH的变化非常敏感。其中： 

图3A显示了在37℃用10mM盐酸处理10分钟，GFP-Smad5完全位于核内。 

图3B显示了在37℃用2mM氢氧化钠处理2分钟，GFP-Smad5快速转移到胞浆中。 

图3C和图3D显示了激光共聚焦实验展示不同胞外pH下，GFP-Smad5的核浆分布情况。 

图3E显示了不同胞外pH下，GFP-Smad5的核浆分布比率。 

图3F为Western blot实验结果，表明内源性Smad5也存在胞外pH敏感的核浆穿梭现象。 

图4显示了Smad5对胞外渗透压的变化也非常敏感。其中： 

图4A显示了当加入水将胞外渗透压从300mOsm/kg降到250mOsm/kg，Smad5将会更多转移到细胞核内。 

图4B显示了当在培养基中加入氯化钠将胞外渗透压从300mOsm/kg升到350mOsm/kg，Smad5将很快转移到胞浆中。 

图4C显示了Western blot实验的结果，表明内源性Smad5也存在胞外渗透压敏感的核浆穿梭现象。 

图5显示了胞内pH的变化最终影响Smad5的核浆分布。其中： 

图5A显示了在37℃和25℃下，通过BCECF荧光强度实验来测定的胞内pH(定性分析)。其中，BCECF表示2',7'-二(羧乙基)-5(6)-羧基荧光黄。 

图5B显示了在不同温度下，通过BCECF荧光强度统计结果。 

图5C显示了在不同pH溶液下，通过BCECF荧光强度实验来测定胞内pH。 

图5D显示了在不同pH下，通过BCECF荧光强度统计结果。 

图5E显示了在不同渗透压溶液下，通过BCECF荧光强度实验来测定胞内pH。 

图5F显示了在不同渗透压下，通过BCECF荧光强度统计。 

图5G和5H显示了毛地黄皂苷穿膜实验的结果，表明pH逐步升高会逐渐促进Smad5的出核。 

图6显示了Smad5感受胞内pH变化依赖其MH1结构域，并且存在三个酸性和碱性氨基酸聚集区来负责感受胞内pH变化。其中： 

图6A显示了Smad5存在低温出核现象，而Smad1没有这一现象。 

图6B显示了Smad5与Smad1互换MH2结构域不影响它们的核浆分布。 

图6C显示了缺失Smad5MH2结构域，Smad5仍存在低温出核现象。 

图6D显示了Smad5与Smad1互换MH1结构域后，Smad1具有低温出核现象，而Smad5低温不再出核。 

图6E显示了Smad5对温度，胞外pH及渗透压的变化都非常敏感。 

图6F为Smad5在不同环境下的核浆分布统计图。 

图6G显示了突变Smad5的第一个酸性氨基酸聚集域会促进其在核内聚集，并且在碱性或高渗下会大大降低其出核速率。 

图6H为Smad5在不同环境压力的核浆分布统计图。 

图6I显示了突变Smad5的碱性氨基酸聚集域使其分布于胞浆中，并且在酸性或低渗下不能使其进核。 

图6J为Smad5在不同环境压力的核浆分布统计图。 

图6K显示了突变Smad5的第二个酸性氨基酸聚集域会促进其在核内聚集，并且在碱性或高渗下会大大降低其出核速率。 

图6L为Smad5在不同环境压力的核浆分布统计图。 

图7显示了室温下，GFP-Smad5能迅速从细胞核转移到细胞浆。 

图8显示了温度变化时，只有Smad5能有核浆分布的变化，而其它Smad蛋白(如Smad3)没有温度所调控的核浆分布变化。 

图9显示了胞外pH、渗透压、氧自由基、膜电位及不同信号分子的变化对Smad5的核浆分布的影响，其中胞外pH和渗透压影响Smad5的核浆分布。 

图10显示了低温诱导的Smad5转移(核浆穿梭)与BMP信号通路无关。 

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种对于胞内pH高度敏感的蛋白，即Smad5蛋白。研究表明，该Smad5蛋白对于温度、胞外pH和胞外渗透压的变化高度敏感，而温度、胞外pH和胞外渗透压的变化都会改变胞内pH的变化，胞内pH的变化最终影响Smad5的核浆分布。在此基础上完成了本发明。 

具体地，本发明的试验证明，Smad5对温度、胞外pH和胞外渗透压的变化高度敏感，而温度、胞外pH和胞外渗透压的变化都会改变胞内pH的变化，胞内pH的变化最终影响Smad5的核浆分布。Smad5能感知胞内pH的变化，在酸性条件下，Smad5主要位于核内；然而，当胞外pH大于7.34时，Smad5很快转移到胞浆中。此外，Smad5的MH1结构域主要负责感受胞内pH的变化，而linker区域及MH2结构域存在NES核输出信号，促进Smad5的核输出。并且，在Smad5的MH1结构域存在三个酸性氨基酸和碱性氨基酸聚集区域，其对胞内pH的感受是必不可少的。另外，本发明人还首次证明了，胞内pH的变化所引起的Smad5的核浆穿梭不需要C末端的磷酸化。 

Smad家族 

Smad家族是细胞外TGF-β/bone形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号通路信号传递蛋白家族的成员之一，该蛋白家族是高度保守的。TGF-β/BMP信号通路的许多成员，包括SMAD家族，在癌症发生中也产生影响。 

受体激活的Smads(R-Smads)家族包括Smad1,Smad2,Smad3，Smad5和Smad8。所有Smad蛋白都包括三部分：MH1结构域、Linker区域和MH2结构域。 

在BMP或TGFβ信号刺激下，I型受体使得R-Smads的C末端SSXS结构域发生磷酸化。这些磷酸化的R-Smads与Smad4形成二聚体，然后共同进入细胞核来调节基因转录。 

抑制性Smads(Smad6和Smad7)与R-Smads竞争来抑制BMP或TGFβ信号。 

Smad1、Smad5和Smad8位于BMP下游，而Smad2、Smad3位于TGFβ下游。一些转基因动物研究表明，(a)Smad1、Smad5和Smad8与(b)Smad2、Smad3彼此不能相互代偿。 

在结构上，Smad1存在两个NESs:一个是位于C末端的NES结构域(命名为NES1)，另一个是在linker区域的亮氨酸富集的类似NES结构域(命名为NES2)。一种野生型的Smad1的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。 

Smad5多肽和编码基因 

脊椎动物造血细胞中，SMAD5起着重要的影响作用。早先的研究表明，Smad5是一种典型的人类白血病和实体瘤肿瘤遏制因子；而后又发现它在TGF-β/BMP信号通路中的作用。 

Smad5定位于人类染色体5q31.1上。结构上，Smad5包括N端的MH1结构域以及C端的MH2结构域，二者通过Linker结构域相连；在MH2结构域中包含两个NES出核信号，而在Linker结构域中包含1个NES出核信号(图2E)。功能上，Smad5是骨形成蛋白(BMPs)特异的细胞内信号转导分子,Smad5的C末端被BMP受体磷酸化,介导BMP信号通路：受体对R-Smads的磷酸化使活化的R-Smads构象发生改变后从受体上解离下来,并与Smad4结合形成异源二聚物，转移到核内,激活特定基因的转录。BMP/Smad5被认为具有多种生物学功能,在胚胎时期的组织发育和成年组织缺损修复中起重要作用。 

基于本发明的发现，可将Smad5用作核浆穿梭蛋白，从而感受胞内pH、胞外pH、胞外渗透压、低温等环境变化。 

术语 

如本文所用，术语“本发明基因”、“Smad5基因”、“本发明的核浆穿梭基因”、可以互换使用，都是指Smad5基因。一种代表性的Smad5基因是来源于人的Smad5基因及其变体。 

本发明Smad5基因包括(但并不限于)：野生型人Smad5核苷酸序列，如SEQ ID NO.:1所示。 

如本文所用，术语“本发明多肽”、“本发明蛋白”、“Smad5蛋白”、“Smad5多肽”、“Smad5”、“本发明的核浆穿梭蛋白”可以互换使用，都是指具有核浆穿梭功能的Smad5多肽及其变体。在本发明中，Smad5多肽包括野生型和突变型。 

一种优选的来自人的Smad5多肽包括(但并不限于)：野生型的、具有核浆穿梭功能的Smad5多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。 

在Smad5中存在MH1、Linker和MH2结构域。其中， 

MH1对应于SEQ ID NO.:1所示核苷酸序列的第1位至399位,SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的第1位至133位； 

Linker对应于SEQ ID NO.:1所示核苷酸序列的第400位至792位,SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的第134位至264位； 

MH2位对应于SEQ ID NO.:1所示核苷酸序列的第793位至1398位,SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的第265位至465位。 

在Smad5中，存在三个关键酸性/碱性氨基酸片段的区段，它们对应于SEQ ID NO.:1所示核苷酸序列的第73位至84位、第118位至138位、第148位至159位；对应于SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的第25位至28位、第40位至46位、第50位至53位。 

本发明还包括与本发明的基因序列(SEQ ID NO.:1)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸编码的蛋白也能有效地感受胞内pH、胞外pH、胞外渗透压以及温度的变化。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。 

在本发明中，SEQ ID NO.:1中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.:1的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ ID NO.:1的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO.:1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。 

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于人，但是来源于其它类似物种的、具有一定同源性(保守性)的Smad5基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它物种中分离得到该序列。 

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:2所示序列具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似的核浆穿梭功能的多肽或蛋白。 

所述“相同或相似功能”主要是指具有核浆穿梭功能。 

本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列，经过若干 个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。 

表1 

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.:2差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。 

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸)的序列。 

如本文所用，“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。 

蛋白质或多核苷酸“突变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。突变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。 

“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。 

“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。 

“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。 

如本文所用，“分离”是指将物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。 

术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。 

本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多 肽的功能。 

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50%，优选具有70%的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95%以上，更好是97%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能(如核浆穿梭功能)和活性。 

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码SMAD5蛋白的多核苷酸。 

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。 

本发明涉及融合蛋白或重组蛋白的各元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。 

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。 

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。 

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤： 

(1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞； 

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞； 

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。 

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。 

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。 

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。 

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。 

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。 

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。 

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。 

本发明中，LMB、Leptomycin B和“出核转运抑制剂”可互换使用。LMB是一种常用的出核转运(nuclear export)抑制剂，也是一种重要的出核转运的研究工具，可以直接和CRM1结合，从而抑制CRM1和带有出核信号(nuclear export signal)的 蛋白结合，最终导致由CRM1介导的出核转运的抑制。LMB是一种不饱和支链脂肪酸，可以通透细胞，抑制细胞核向细胞浆的蛋白转运。 

本发明的主要优点包括： 

(a)首次揭示了一种在细胞中存在的野生型蛋白Smad5,能通过核浆穿梭来感受胞内pH、胞外pH、胞外渗透压以及温度的变化。 

(b)首次揭示了一种方法，用以赋予目的蛋白(非Smad5)感受胞内pH、胞外pH、胞外渗透压以及温度变化的能力。 

(c)提供了一种筛选改变胞内pH的化合物的方法。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 

实施例1 

Smad5核浆穿梭现象 

为了研究BMP/TGFβ信号在胚胎干细胞维持和分化中的作用，本发明人通过慢病毒感染的方法建立了表达GFP-Smad1-8融合蛋白的稳定人胚胎干细胞系。然而，在日常观察中，意外而偶然发现，在室温下，GFP-Smad5能迅速从细胞核转移到细胞浆中(图7)。然而，其它Smad蛋白并没有这种现象。 

为了验证该发现，在HEK293细胞中进行了重复试验，方法如下： 

步骤1.构建质粒pTight-GFP-BNME 

在本实施例中，738bp长度的GFP片段(模板来自质粒PLVTHM,购自addgene公司)插入到pLVX-Tight-Puro载体(购自Clontech,United States公司)中，并通过pTight启动子驱动。方法如下： 

利用GFP基因特异引物，引物序列如下： 

BglII-GFP-F:GATCAGATCTACCGGTCGCCACCATGGTGAG(SEQ ID NO.:20) 

BamHI-GFPns-R:GATCGGATCCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTG(SEQ ID NO.:21) 

以PLVTHM质粒为模板，通过PCR扩增出长度为738bp的片段，通过限制性内切酶BglII和BamHI酶切，构建到市售的pLVX-Tight-Puro载体中，构建为新的载体pTight-GFP-BNME。(注：GFP的终止密码子已去掉，以便构建GFP与目的基因的融合蛋白。) 

步骤2.将Smad5克隆到pTight-GFP-BNME中 

在本实施例中，1398bp长度的Smad5片段插入到载体pTight-GFP-BNME中，最终构建GFP-Smad5融合蛋白。方法如下： 

利用Smad5基因特异引物，引物序列如下： 

BamHI–hSmad5V123-F: 

GATCGGATCCATGACGTCAATGGCCAGCTTG(SEQ ID NO.:5) 

MluI–hSmad5V123-R: 

ACGCGTTTATGAAACAGAAGATATGG(SEQ ID NO.:6) 

以用常规方法抽提的人细胞RNA，然后利用Invitrogen SuperScriptIII First-Strand Synthesis System将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，通过PCR扩增出长度为1398bp的片段，通过限制性内切酶BamHI和MluI酶切，构建到上一步骤制备的载体pTight-GFP-BNME中，最终构建成pTight-GFP-Smad5载体，用于表达GFP-Smad5融合蛋白。 

步骤3.包装慢病毒 

培养在T75瓶中的HEK293细胞长满后，用胰酶消化，并用10ml HEK293培液重悬，取2ml细胞悬液，加上13ml培液，混匀，以每孔2.5ml接种到六孔板中。20h后观察细胞，细胞密度为80%左右时包装慢病毒。利用慢病毒感染的方法在HEK293中建立GFP-Smad5稳定表达的细胞系，然后将细胞置于室温下，观察其核输出现象。 

结果表明，在稳定表达GFP-Smad5的HEK293细胞系中观察到GFP-Smad5能从细胞核转移到细胞浆的现象。正如图1A所示，在只表达GFP的细胞系中，GFP平均分布于胞核与胞浆，并且温度变化不影响其核浆分布。然而，在稳定GFP-Smad5的HEK293细胞系中，在37℃，Smad5主要分布于细胞核中，但当将细胞置于25℃3分钟后，Smad5开始在胞浆中聚集，6-9分钟后，Smad5几乎完全位于胞浆中。当把胞浆分布的GFP-Smad5重新放回37℃30分钟后，GFP-Smad5又重新回到细胞核内。 

虽然，位于BMP信号下游的Smad1,Smad5及Smad8都属于同一家族，当温度变化时，只有Smad5能有核浆分布的变化(图1A和图8)。位于TGFβ下游的Smad3，也没有温度所调控的核浆分布变化(图8)。这些数据表明，Smad5区别于其它Smads的地方在于其能感受温度变化来改变其核浆分布。 

实施例⒉ 

Smad5核浆穿梭与温度的关系 

在本实施例中，研究温度与Smad5的核浆分布的关系。 

方法如下：将稳定表达GFP-Smad5的HEK293细胞置于盖玻片(coverslips)上48 小时，接着，将细胞依次放于42℃到27℃并含5%CO₂的条件下20分钟。再用放于同一温度下的10分钟的4%多聚甲醛固定，然后用激光共聚焦显微镜来检测Smad5的分布。 

结果： 

在37℃，有超过50%的Smad5分布于细胞核内(图1B和1C)。将细胞置于低于32.5℃下，大部分Smad5将转移的胞浆中(图1B和1C)。甚至将细胞放于冰上，Smad5也会很快转移到胞浆中。有趣的是，当温度高于37℃时，更多的Smad5将分布于细胞核内(图1B和1C)。因此，Smad5能通过核浆穿梭来感受较广范围内的温度变化。 

实施例3 

核浆穿梭与GFP无关 

为了排除GFP对Smad5核浆分布的影响，通过核浆分离来检测HEK293细胞中内源Smad5的分布变化，方法如下： 

HEK293细胞生长于10厘米培养皿中48小时后，其中一个培养皿中的细胞仍放于37℃，另一个培养皿中的细胞放于25℃15分钟；然后分别加入3ml含160μg/ml毛地黄皂苷的MOPS缓冲液破膜3分钟；然后300g离心5min来收集细胞核，而上清为胞浆蛋白。 

结果： 

如图1D所示，在37℃，内源Smad5大部分位于细胞核内。当置于25℃时，Smad5很快转移到细胞浆中。在低表达Smad5的293细胞系中，Smad5的条带明显减弱，但仍具有同样现象。这表明，核浆穿梭与GFP无关。 

实施例4 

低温核输出Smad5是由CRM1受体介导的 

方法： 

在37℃，对于GFP-Smad5HEK293细胞，对照组用甲醇处理1小时，实验组用5ng/mlLMB处理1小时，观察核浆分布情况。然后在LMB仍存在情况下，将细胞放于25℃40分钟，观察核浆分布情况。 

结果： 

如上所述，低温诱导Smad5快速胞浆聚集。原理上，Smad5胞浆转移可通过降低核输入或加快核输出来实现。一般认为核输出过程是信号所依赖的，并且是通过核输出蛋白来实现的。最常见的出核受体是CRM1。LMB能结合CRM1，从而抑制其结合RanGTP和其它出核底物。因此，LMB被广泛用来研究主动出核的一个工具¹⁵。正如图2A所示，对照甲醇处理没有影响Smad5的低温出核现象。尽管在37℃，大多Smad5都 位于核内，但LMB处理1小时后，Smad5几乎完全位于核内(图2B)。这些数据表明，在37℃，GFP-Smad5既能出核又能进核，由于有更多Smad5位于核内，因此，在37℃其更有利于进核。当存在LMB时，将细胞放于25℃40分钟也不能诱导Smad5的胞浆聚集(图2B)。这些数据表明，低温诱导的Smad5的胞浆聚集是CRM1介导的主动出核过程。 

实施例5 

低温加速Smad5的核输出 

方法： 

首先将GFP-Smad5HEK293细胞放于25℃30分钟使其完全出核，将细胞一直放于25℃，然后，加入甲醇或LMB，处理40分钟后，观察核浆分布情况。 

结果： 

为了进一步排除低温影响Smad5的进核，首先将GFP-Smad5HEK293细胞放于25℃30分钟。正如图2C和2D所示，Smad5几乎完全位于胞浆中。将细胞一直放于25℃，然后，加入甲醇或LMB，LMB能阻止已进核的Smad5蛋白重新回到胞浆中。在25℃，LMB处理40分钟后，原先位于胞浆的GFP-Smad5又重新回到细胞核内(图2D)。然而，甲醇处理不能使GFP-Smad5重新回到核内(图2C)。因而，在25℃，Smad5的进核能力不变，低温会加速其出核。 

实施例6 

Smad5存在3个NESs来促进其低温出核 

CRM1所依赖的核输出需要传统的核输出信号。核输出信号(NES)是一段有四个疏水氨基酸残基组成的短肽¹⁶。 

通过分析氨基酸序列，本发明人认为Smad位于NES1下游的另一个NES，命名为NES3(图2E)。为了研究低温所介导的Smad5的出核是否通过这3个NESs，我们运用点突变进行分析。我们首先单独突变这上三个NESs： 

对于NES1，将L⁴⁰⁶TKM⁴⁰⁹→A⁴⁰⁶TKA⁴⁰⁹(NES1mut),对于NES2，将VESPV¹³⁵L¹³⁶PPV¹³⁹L¹⁴⁰V→VESPA¹³⁵A¹³⁶PPA¹³⁹A¹⁴⁰V(NES2mut)，对于NES3，将V⁴⁵⁰LTQM⁴⁵⁴→A⁴⁵⁰LTQA⁴⁵⁴NES3(NES3mut)。 

结果表明，这3个NES突变的任何一个突变都导致在核中存在更多的Smad5(图2F-J)。这表明这三个NES都可以调控Smad5的出核。在25℃，尽管这三个NES的突变体仍能出核，但其出核速率明显减慢(图2F-J)。 

接下来，我们联合突变这三个NES，其低温下不再出核(图2J)。因此，这三个NES调控Smad5的低温出核。另外，Smad5存在三个NES，这也解释了其低温快速出核这一现象。 

实施例7 

Smad5感受胞外pH和渗透压变化 

7.1Smad5对胞外pH和渗透压的变化也非常敏感 

低温可以调控Smad5的出核，而是否还有其它因素能调控Smad5的核浆分布等信息还有待揭示，如胞外pH、渗透压、氧自由基、膜电位及不同信号分子的变化。方法如下： 

在GFP-Smad5HEK293细胞中，分别加入400uM H₂O₂，5mM NAC，10mM KCl，10mM CaCl₂，10Mm MgCl₂，37℃处理细胞10分钟，然后荧光显微镜下观察Smad5的核浆分布。 

在GFP-Smad5HEK293细胞中，分别加入10uM SB431542，10uM LDN193189，10uM PD0325901，10uM IWP2，37℃处理细胞12小时，然后荧光显微镜下观察Smad5的核浆分布。 

结果表明，胞外pH和渗透压都可以改变Smad5的核浆分布。 

在37℃，本发明人使用10mM盐酸处理GFP-Smad5HEK293细胞10分钟后，GFP-Smad5完全分布于细胞核内(图3A)。在37℃，本发明人用2mM氢氧化钠处理2分钟后，GFP-Smad5很快转移到胞浆中(图3B)。 

7.2Smad5核浆穿梭与胞外pH的关系 

为了研究能引起Smad5核质穿梭的胞外pH范围，首先，本发明人在无二氧化碳的37℃配箱培养GFP-Smad5HEK293细胞60分钟，然后加入不同量的1M盐酸处理10分钟，再用多聚甲醛固定细胞并用激光共聚焦显微镜来分析其核浆分布情况。当胞外pH低于6.62时，Smad5大部分位于胞核中(图3C和3E)。当胞外pH高于7.62时，Smad5大部分位于胞浆中(图3D和3E)。 

因此，Smad5能感受生理范围内的胞外pH的细微变化。 

7.3内源Smad5可感受胞外pH和胞外渗透压的变化 

7.3.1.胞外pH的变化 

为了分析内源Smad5是否具有胞外pH敏感的核浆穿梭现象，本发明人通过Western blot来分析HEK293细胞中Smad5的分布。方法如下： 

HEK293细胞生长于10厘米培养皿中48小时后，然后分别用10mM HCl and2mM NaOH处理15分钟；分别加入3ml含160μg/ml毛地黄皂苷的MOPS缓冲液破膜3分钟；然后300g离心5min来收集细胞核，而上清为胞浆蛋白。 

结果： 

如图3F所示，当胞外为酸性时，Smad5大部分位于核内，当胞外为碱性时，Smad5大部分位于胞浆。 

7.3.2胞外渗透压的变化 

方法如下：HEK293细胞生长于10厘米培养皿中48小时后，然后分别用1ml H₂O and250μl1.5M NaCl处理15分钟；然后分别加入3ml含160μg/ml毛地黄皂苷的MOPS缓冲液破膜3分钟；然后300g离心5min来收集细胞核，而上清为胞浆蛋白。 

结果： 

当我们加入纯水将胞外渗透压调为250mOsm/kg时，GFP-Smad5大部分位于核内，当我们加入氯化钠将胞外渗透压调为350mOsm/kg时，GFP-Smad5大部分位于胞浆(图4B)。内源Smad5也可以感受胞外渗透压的变化(图4C)。 

实施例8 

环境变化所引起的Smad5的核质穿梭不依赖于BMP信号 

在本实施例中，研究Smad5与BMP的关系。Smad5是BMP信号下游的重要转录因子，当受BMP信号刺激时，Smad1、5和8发生磷酸化，并与Smad4形成二聚体，然后进核来调节基因转录。。因此，环境变化可能影响BMP信号，从而改变Smad5的磷酸化或去磷酸化，然后引起Smad5的核浆转运。 

方法如下： 

在37℃，用BMP信号抑制剂LDN-193189或TGFβ信号抑制剂SB431542来处理GFP-Smad5HEK293细胞3小时，观察核浆分布情况。 

结果： 

用BMP信号抑制剂LDN-193189或TGFβ信号抑制剂SB431542来处理GFP-Smad5HEK293细胞3小时。结果表明，在正常培养条件下，我们并没有观察到Smad5的分布变化，低温仍能引起Smad5的出核(图10),这表明BMP或TGFβ信号不能引起Smad5的核浆分布的变化。 

接下来，去除了包含SSVS磷酸化位点的Smad5的C末端11个氨基酸(GFP-Smad5Δ11)，在37℃，GFP-Smad5Δ11大部分位于核中，低温下仍能出核。 

接着，将SSVS磷酸化位点突变为AAVA或DDVD，以阻止其磷酸化或去磷酸化。Smad53A或Smad53D突变体表现出与野生型Smad5同样的现象。 

这些结果表明，环境因素引起的Smad5的核浆穿梭并不是通过BMP信号介导的， 与Smad5的磷酸化或去磷酸化状态无关。 

实施例9 

温度、胞外pH和渗透压的变化都能改变胞内pH 

温度、胞外pH和渗透压的变化都能改变Smad5的核浆分布，因此在本实施例中，研究这些环境因素是否影响共同因子，然后改变Smad5的核浆分布。 

为了证明温度、胞外pH和渗透压的变化是否都会改变胞内pH，通过BCECF-AM来测定胞内pH¹⁷。BCECF能通过其荧光强度反应胞内pH的变化。方法如下： 

在37℃，用1μM BCECF-AM处理HEK29320分钟，然后用Hanks溶液洗两遍以完全除去染料，再用不同条件处理：(37℃ and25℃),胞外pH(pH6.0,pH7.0,pH7.8),胞外渗透压(188mOsm/kg,300mOsm/kg,545mOsm/kg)，最后在荧光显微镜下观察荧光变化。 

结果： 

如图5A和5B所示，与37℃相比，在25℃，BCECF荧光强度会增加，说明胞浆碱化。另外，盐酸会引起胞浆酸化，氢氧化钠会引起胞浆碱化(图5C和5D)。低渗会引起胞浆酸化，高渗会引起胞浆碱化(图5E和5F)。 

因此，上述结果证实，温度、胞外pH和渗透压都能改变胞内pH。低温、胞外碱化和高渗条件都可以碱化胞浆并引起Smad5的胞浆转运。高温、胞外酸化和低渗条件都可以酸化胞浆并引起Smad5的胞核聚集并降低出核速率。 

实施例10 

胞内pH能直接调控Smad5出核 

为了进一步证实胞内pH能直接调控Smad5出核，用10mM盐酸处理GFP-Smad5HEK293细胞10分钟来促进Smad5的胞核聚集。接着，用160μg/ml毛地黄皂苷(digitonin)穿膜1分钟，然后分别加入不同pH的缓冲液：pH5.0,6.0,7.0或8.0。 

结果如图5G所示，在pH5.0及6.0时，其完全抑制Smad5的出核(图5G)。相反，在pH7.0及8.0时，Smad5仍具有出核能力(图5H)。这些数据表明，胞内pH的改变最终引起Smad5的核浆穿梭。其中，低温能降低细胞代谢速率并减少线粒体的质子产生，因此会碱化胞浆。另外，胞外pH也会明显改变胞内pH的变化，并且，高渗也会增加胞内pH。 

实施例11 

Smad5MH1结构域对于其感受胞内pH的变化是必不可少的 

上述结果已表明，3个NES对于Smad5的出核是必须的。在本实施例中，通过Smad1与Smad5结构域互换，进一步研究Smad5蛋白中负责感受胞内pH的变化的结构域。 

方法如下： 

通过分子克隆的方法，设计引物，运用PCR及融合PCR的方法来进行Smad1与Smad5结构域互换。方法如下： 

(1)将Smad1MH2区域接到Smad5上：即Smad5w/1MH2： 

首先用以下引物： 

BamHI–hSmad5V123-F: 

GATCGGATCCATGACGTCAATGGCCAGCTTG(SEQ ID NO:5)Smad5w/1MH2263-465-R: 

GTTTTGGTTCCTCATAAGCAACGGCAACAGGCTGAACATCCC(SEQ ID NO:7)，以pTight-GFP-Smad5为模板，扩增Smad5的MH1-linker结构域；并用以下引物： 

Smad5w/1MH2263-465-F: 

GGGATGTTCAGCCTGTTGCCGTTGCTTATGAGGAACCAAAAC(SEQ ID NO:8)NotI-hSmad1-R: 

gatc GCGGCCGCTTAAGATACAGATGAAATAGG(SEQ ID NO:9)为引物，以pTight-GFP-Smad1为模板，扩增Smad1的MH2结构域。然后将扩增的Smad5的MH1-linker与Smad1的MH2做融合PCR:反应体系(40ul)： 

10xbuffer:4ul,10mM dNTP1ul,酶1ul,两个片段各1ug,其余加水。94℃30s,72℃1min,10个循环，再加入引物： 

BamHI–hSmad5V123-F: 

GATCGGATCCATGACGTCAATGGCCAGCTTG(SEQ ID NO:5)NotI-hSmad1-R: 

gatc GCGGCCGCTTAAGATACAGATGAAATAGG(SEQ ID NO:9) 

各1ul；然后进行正常PCR扩增出长度为1398bp的片段，通过限制性内切酶BamHI和NotI酶切，构建到载体pTight-GFP-BNME中， 

(2)将Smad5MH2区域接到Smad1上：即Smad1w/5MH2： 

首先以BamHI-hSmad1-F: 

GATC ggatccATGAATGTGACAAGTTTATTTTCC(SEQ ID NO:10)Smad1w/5MH2263-465-R: 

CAATGTTTAGGCTCTTCATACGCCTGAACATCTCCTCTGTTG(SEQ ID NO:11) 为引物，以pTight-GFP-Smad1为模板，扩增Smad1的MH1-linker结构域；并以Smad1w/5MH2263-465-F: 

CAACAGAGGAGATGTTCAGGCGTATGAAGAGCCTAAACATTG(SEQ ID NO:12)MluI–hSmad5V123-R: 

gatcACGCGT TTATGAAACAGAAGATATGG(SEQ ID NO:13)为引物，以pTight-GFP-Smad5为模板，扩增Smad5的MH2结构域。然后将扩增的Smad1的MH1-linker与Smad5的MH2做融合PCR:反应体系(40ul)： 

10xbuffer:4ul,10mM dNTP1ul,酶1ul,两个片段各1ug,其余加水。94℃30s,72℃1min,10个循环，再加入引物： 

BamHI-hSmad1-F: 

GATCggatccATGAATGTGACAAGTTTATTTTCC(SEQ ID NO:10)MluI–hSmad5V123-R: 

gatcACGCGT TTATGAAACAGAAGATATGG(SEQ ID NO:13) 

各1ul；然后进行正常PCR扩增出长度为1398bp的片段，通过限制性内切酶BamHI和MluI酶切，构建到载体pTight-GFP-BNME中， 

(3)缺失smad5MH2结构区：即Smad5dMH2 

以BamHI–hSmad5V123-F: 

GATCGGATCCATGACGTCAATGGCCAGCTTG(SEQ ID NO:5)MluI–hSmad5linker stop-R： 

gatcACGCGTTTAGGCAACAGGCTGAACATCCC(SEQ ID NO:14)为引物，以pTight-GFP-Smad5为模板，扩增Smad5的MH1-linker结构域，通过限制性内切酶BamHI和MluI酶切，构建到载体pTight-GFP-BNME中。 

(4)将Smad1MH1区域接到Smad5上：即Smad5w/1MH1： 

首先以BamHI-hSmad1-F: 

GATC ggatccATGAATGTGACAAGTTTATTTTCC(SEQ ID NO:10)Smad5w/1MH1263-465-R: 

CTAATACTGGAGGTAAGACTGGGCTTTCTACTCTCTTATAG(SEQ ID NO:15)为引物，以pTight-GFP-Smad1为模板，扩增Smad1的MH1结构域；并以Smad5w/1MH1263-465-F: 

CTATAAGAGAGTAGAAAGCCCAGTCTTACCTCCAGTATTAG(SEQ ID NO:16)MluI–hSmad5V123-R: 

gatcACGCGT TTATGAAACAGAAGATATGG(SEQ ID NO:13)为引物，以pTight-GFP-Smad5为模板，扩增Smad5的linker-MH2结构域;然后扩增的Smad1的MH1与Smad5的linker-MH2做融合PCR:反应体系(40ul)： 

10xbuffer:4ul,10mM dNTP1ul,酶1ul,两个片段各1ug,其余加水。94℃30s,72℃1min,10个循环，再加入引物： 

BamHI-hSmad1-F: 

GATC ggatccATGAATGTGACAAGTTTATTTTCC(SEQ ID NO:10)MluI–hSmad5V123-R: 

gatcACGCGTTTATGAAACAGAAGATATGG(SEQ ID NO:13) 

各1ul；然后进行正常PCR扩增出长度为1398bp的片段，通过限制性内切酶BamHI和MluI酶切，构建到载体pTight-GFP-BNME中， 

(5)将Smad5MH1区域接到Smad1上：即Smad1w/5MH1： 

首先以BamHI–hSmad5V123-F: 

GATC GGATCCATGACGTCAATGGCCAGCTTG(SEQ ID NO:5)Smad1w/5linker177-262-R2: 

GTTTTGGTTCCTCATAAGCAACAGGCTGAACATCCCTGCTGG(SEQ ID NO:17)为引物，以pTight-GFP-Smad5为模板，扩增Smad5的MH1结构域;并以Smad1w/5linker177-262-F3: 

CCAGCAGGGATGTTCAGCCTGTTGCTTATGAGGAACCAAAAC(SEQ ID NO:18)NotI-hSmad1-R: 

gatc GCGGCCGC TTAAGATACAGATGAAATAGG(SEQ ID NO:9)为引物，以pTight-GFP-Smad1为模板，扩增Smad1的linker-MH2结构域;然后扩增的Smad5的MH1与Smad1的linker-MH2做融合PCR:反应体系(40ul)： 

10xbuffer:4ul,10mM dNTP1ul,酶1ul,两个片段各1ug,其余加水。94℃30s,72℃1min,10个循环，再加入引物： 

BamHI-hSmad5-F: 

GATC GGATCC ATGACGTCAATGGCCAGCTTG(SEQ ID NO:19)NotI-hSmad1-R: 

gatc GCGGCCGCTTAAGATACAGATGAAATAGG(SEQ ID NO:9) 

各1ul；然后进行正常PCR扩增出长度为1398bp的片段，通过限制性内切酶BamHI和NotI酶切，构建到载体pTight-GFP-BNME中。 

结果： 

如图1所示，野生型Smad1没有核浆穿梭现象，而野生型Smad5有核浆穿梭现象(图1A、1B和6A)。因此，在本实施例中，通过Smad1与Smad5结构域互换来研究。互换Smad1与Smad5的MH2结构域没有改变它们的核浆分布(图6B)。当缺失Smad5的MH2结构域时，Smad5仍具有低温出核这一现象(图6C)。由于Smad5的MH2结构域含有2个NES，其出核速率相对于野生型有所减慢。 

接下来，互换Smad1与Smad5的MH1结构域。有趣的是，当Smad5含有Smad1的MH1结构域时，其与Smad1相似，在37℃和25℃都位于核内(图6D)。而当Smad1含有Smad5的MH1结构域时，其分布与Smad5相似，且低温下可以出核(图6D)。因此，上述结果表明，Smad5的MH1结构域负责感受胞内pH的变化，而linker及MH2结区域负责在碱性条件下核输出。 

实施例12 

Smad5的MH1结构域的三个酸性及碱性氨基酸结构域负责感受胞内pH的变化 

在本实施例中，进一步研究Smad5中负责感受胞内pH的变化的具体序列区段。 

在本实施例中，对于Smad5的MH1结构域的多个残基进行了突变，并观察其对感受胞内pH的能力是否发生变化。 

结果表明，三个酸性及碱性氨基酸残基区段对其感受胞内pH是必须的。 

具体地，对这三个酸性及碱性氨基酸残基区段进行突变，方式如下： 

Smad5E1，D²⁵EEE²⁸→A²⁵AAA²⁸； 

Smad5K，K⁴⁰KLKKKK⁴⁶→A⁴⁰ALAAAA⁴⁶； 

Smad5E2，E⁵⁰ELE⁵³→A⁵⁰ALA⁵³。 

与野生型相比，在37℃，Smad5E1与E2表现出更多的核聚集，并且在低温、胞外碱化和高渗条件下出核能力减弱(图6E-H和6K-L)。相反，突变Smad5的碱性氨基酸基团促使Smad5分布于胞浆，并且高温、胞外酸化和低渗条件都不能促进Smad5的核聚集(图6I-J)。这表明，Smad5的MH1结构域的三个酸性及碱性氨基酸结构域对其感受胞内pH是必须的。 

讨论 

在当前研究中，我们证明Smad5是一个新的胞内pH敏感的蛋白。点突变、缺失、互换研究证实，Smad5是通过MH1结构域来感受胞内pH的变化，并且有三个NES来负责其出核。在Smad5的MH1结构域存在三个酸性及碱性氨基酸结构域来负责感受胞内pH的变化。对于Smad1，其包含这三个酸性及碱性氨基酸结构域，但其不能感受环 境变化。因此，我们假设Smad5独特的构象使其感受胞内pH的变化，并能调节其细胞分布。 

蛋白的亚细胞定位对其行使功能来说是关键的。转录因子、蛋白或RNA伴侣、细胞周期调节子及信号分子都能调节其亚细胞定位。通常，信号调节的磷酸化与去磷酸化、蛋白间的相互作用、ATP/ADP和GTP/GDP结合位点都能调节蛋白的转运。我们证实Smad5是一个高度动态的蛋白，其不断进行核浆穿梭。这是第一个发现的其亚细胞定位是有温度、胞外pH、渗透压和胞内pH所调节的蛋白，尽管其生理功能有待继续研究。胞内pH的稳态对细胞正常功能如酶的活性、能量代谢、细胞增殖与迁移都是必须的。对胞内pH敏感的染料、探针等都可以检测胞内pH的变化。由于Smad5对胞内pH高度敏感，因此其可以检测体外培养的细胞或动物体内的胞内pH变化。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

参考文献 

1.Shimokawa,N.,Londono,M.&Koibuchi,N.Gene expression and signaling pathways by extracellular acidification.Advances in experimental medicine and biology580,267-274;discussion351-269,doi:10.1007/0-387-31311-7_42(2006). 

2.Spriggs,K.A.,Bushell,M.&Willis,A.E.Translational regulation of gene expression during conditions of cell stress.Molecular cell40,228-237,doi:10.1016/j.molcel.2010.09.028(2010). 

3.Peier,A.M.et al.A TRP channel that senses cold stimuli and menthol.Cell108,705-715(2002). 

4.Voets,T.et al.The principle of temperature-dependent gating in cold-and heat-sensitive TRP channels.Nature430,748-754,doi:10.1038/nature02732(2004). 

5.Horie,T.,Tatebayashi,K.,Yamada,R.&Saito,H.Phosphorylated Ssk1 prevents unphosphorylated Ssk1from activating the Ssk2mitogen-activated protein kinase kinase kinase in the yeast high-osmolarity glycerol osmoregulatory pathway.Molecular and cellular biology28,5172-5183,doi:10.1128/MCB.00589-08(2008). 

6.Tatebayashi,K.et al.Transmembrane mucins Hkr1and Msb2are putative osmosensors in the SHO1branch of yeast HOG pathway.The EMBO journal26,3521-3533,doi:10.1038/sj.emboj.7601796(2007). 

7.Sengupta,S.,Peterson,T.R.&Sabatini,D.M.Regulation of the mTOR complex1pathway by nutrients,growth factors,and stress.Molecular cell40,310-322,doi:10.1016/j.molcel.2010.09.026(2010). 

8.Salvi,A.,Quillan,J.M.&Sadee,W.Monitoring intracellular pH changes  in response to osmotic stress and membrane transport activity using5-chloromethylfluorescein.AAPS pharmSci4,E21,doi:10.1208/ps040421(2002). 

9.Casey,J.R.,Grinstein,S.&Orlowski,J.Sensors and regulators of intracellular pH.Nature reviews.Molecular cell biology11,50-61,doi:10.1038/nrm2820(2010). 

10.Delaunay,A.et al.Human ASIC3channel dynamically adapts its activity to sense the extracellular pH in both acidic and alkaline directions.Pr℃eedings of the National Academy of Sciences of the United States of America109,13124-13129,doi:10.1073/pnas.1120350109(2012). 

11.Massague,J.,Seoane,J.&Wotton,D.Smad transcription factors.Genes &development19,2783-2810,doi:10.1101/gad.1350705(2005). 

12.Shi,Y.&Massague,J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus.Cell113,685-700(2003). 

13.Chang,H.,Lau,A.L.&Matzuk,M.M.Studying TGF-beta superfamily signaling by kn℃kouts and kn℃kins.Molecular and cellular end℃rinology180,39-46(2001). 

14.Kaivo-oja,N.,Jeffery,L.A.,Ritvos,O.&Mottershead,D.G.Smad signalling in the ovary.Reproductive biology and end℃rinology:RB&E4,21,doi:10.1186/1477-7827-4-21(2006). 

15.Fukuda,M.et al.CRM1is responsible for intracellular transport mediated by the nuclear export signal.Nature390,308-311,doi:10.1038/36894(1997). 

16.Kutay,U.&Guttinger,S.Leucine-rich nuclear-export signals:born to be weak.Trends in cell biology15,121-124,doi:10.1016/j.tcb.2005.01.005(2005). 

17.Miyauchi,K.,Marin,M.&Melikyan,G.B.Visualization of retrovirus uptake and delivery into acidic endosomes.The Bi℃hemical journal434,559-569,doi:10.1042/BJ20101588(2011). 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。