一株产纤维素酶的嗜盐黑曲霉及其应用

摘要

本发明公开了一株产纤维素酶的嗜盐黑曲霉及其应用，属于微生物领域。公开的黑曲霉菌株的保藏编号为CGMCC NO.9404，该黑曲霉菌株分离自中国陕西省陕北榆林市定边县花马盐湖湖水泽沉积物，该菌株经过形态学和分子生物学鉴定为黑曲霉属，可在碳源为2％的玉米芯粉，氮源为0.5％的蛋白胨，起始pH为5.5，孢子悬液接种体积分数为20％，盐浓度为2.5％的培养基中28℃培养5天，达到最高产酶活性。并且该菌株在盐浓度为0％～15％的条件下均可产生纤维素酶。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产纤维素酶的嗜盐黑曲霉及其培养方法和应用。

背景技术

纤维素类物质是地球上最丰富的可再生资源之一，它是由β-D-1,4葡萄糖苷键组成的多糖，分子量可达数十万甚至数百万，不能为微生物细胞直接利用。纤维素酶是生物降解含β-1,4糖苷键的纤维素生成葡萄糖的一类复合酶的总称，主要由3种水解酶类组成，分别是β-葡聚糖苷酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。首先β-葡聚糖苷酶作用于微纤维的非结晶区，使其露出许多末端供外切型酶作用，纤维二糖水解酶从非还原性末端依次分解，产生纤维二糖，然后部分降解的纤维素进一步由β-葡聚糖苷酶和纤维二糖水解酶协同作用，分解生成纤维二糖、三糖等低聚糖，最后由β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌，动物体内都能产生纤维素酶。其中微生物是纤维素酶的主要来源，如细菌主要有梭菌属(Clostridium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、高温单胞菌属(Thermomonospora)等；真菌主要有木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、白腐真菌(P.chrysosporium)、裂殖菌属(Schizophyllum)等。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，目前，研究较多的能够降解天然纤维的微生物主要是木霉、青霉、曲霉和白腐菌等真菌，例如纤维素酶系齐全的绿色木霉(Trichoderma viride)和里氏木霉(T.reesei)等菌株，但木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，另一方面其纤维素酶活力较低，尤其是β-葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累而影响酶解效率，因而其应用范围受到限制。然而，黑曲霉不产生毒素，是公认的安全微生物。在产纤维素酶的真菌中，黑曲霉所产纤维素酶系中以纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶的活力较高，特别是β-葡萄糖苷酶活力较一般菌株高。

目前对于产纤维素酶菌株的研究大多数都集中在常规低盐微生物中，很少涉及盐湖微生物产纤维素酶的研究，目前已经报道的仅有Vibriosp.G21(Gao Z et al.2010)、Chromohalobacter sp.TPSV 101(Prakasha et al.2012)、Haloarcula sp.G10、Haloarcula sp.LLSG7(Li X et al.2013)、Pestalotiopsissp.NCi6(Arfi Y et al.2013)等。由于盐湖环境独特，蕴藏多样的极端微生物及其独特的酶系。嗜盐微生物酶一般在高盐条件下仍具有较高的活性，可以在高盐环境下高效降解纤维素，此种特性有利于解决工业化生产中高盐环境使酶失活的问题，此外，发酵培养基中高浓度的NaCl可抑制大多数微生物的生长繁殖，防止纤维素酶生产过程中杂菌污染。

纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位。天然纤维素的分子内和分子间存在着大量的氢键，同时其聚集结构复杂，结晶度较高，使得纤维素对酶的可及性低，溶解困难，反应性能差，这直接影响了纤维素制品的使用性能，纤维素的预处理是纤维素在某些工业领域有效利用的重要环节，酸碱法预处理天然纤维素的过程中，产生大量的废水，这些盐度高的废水直接排放会造成有机物富集，嗜盐纤维素酶可以在高盐环境下降解纤维素，因此嗜盐纤维素酶对预处理纤维素产生的废水的治理具有重要意义。另外，纤维素酶酶活是表征盐碱土壤碳素循环的主要指标，该酶能有效增加盐碱地碳素的循环速度，促进盐碱地肥力的快速恢复。

发明内容

本发明的目的在于提供一株产纤维素酶的嗜盐黑曲霉及其培养方法和应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种产纤维素酶的嗜盐黑曲霉菌株，该黑曲霉菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9404。

该黑曲霉菌株在盐浓度为0％～15％的条件下产生纤维素酶。

该黑曲霉菌株产生纤维素酶的发酵培养基的碳源为质量分数1％～3.5％的玉米芯粉，氮源为质量分数0.2％～1.0％的蛋白胨；该黑曲霉菌株产生纤维素酶的培养温度为24～32℃，培养时间为1～7天，孢子悬液接种体积分数为5％～25％，培养基pH为4.5～8.5，盐浓度为0％～15％。

优选地，该黑曲霉菌株产生纤维素酶的发酵培养基的碳源为质量分数2％的玉米芯粉，氮源为质量分数0.5％的蛋白胨；该黑曲霉菌株产生纤维素酶的培养温度为28℃，培养时间为5天，孢子悬液接种体积分数为20％，培养基起始pH为5.5，盐浓度为2.5％。

本发明公开的产纤维素酶的嗜盐黑曲霉菌株在生产纤维素废水治理中的应用。

本发明公开的产纤维素酶的嗜盐黑曲霉菌株在盐碱地修复中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供了一种新的产纤维素酶的嗜盐黑曲霉菌株，命名为Aspergillus niger，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.9404。该嗜盐黑曲霉菌株从分离自中国陕西省榆林市定边县花马盐湖泽沉积物中分离获得。

本发明公开的产纤维素酶的嗜盐黑曲霉菌株可在0％～15％盐浓度的培养基中生长产生纤维素酶，嗜盐纤维素酶可以在高盐环境下高效降解纤维素，在造纸和纤维素预处理废水的治理及盐碱地的修复中具有较为广泛的应用。保藏说明

本发明对所述的嗜盐黑曲霉菌株进行了下述保藏：

保藏时间：2014年7月1日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏号为CGMCC No.9404。

附图说明

图1为嗜盐黑曲霉菌株的显微形态特征照片；

图2为本发明的嗜盐黑曲霉菌株与已鉴定Aspergillus属的ITS序列构建的系统发育树；

图3为培养基碳源对CMCase影响的柱状图；

图4为培养基氮源对CMCase影响的柱状图；

图5为发酵温度对CMCase影响的折线图；

图6为发酵时间对CMCase影响的折线图；

图7为孢子悬液接种的体积分数对CMCase影响的折线图；

图8为培养基pH对CMCase影响的折线图；

图9为培养基盐浓度对CMCase影响的折线图。

具体实施方式

下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明的嗜盐产纤维素酶的菌株分离自中国陕西省榆林市定边县花马盐湖泽沉积物。该黑曲霉属菌株(Aspergillus niger),于2014年7月01日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址：中国北京中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号：CGMCC9404。

通过刚果红固体培养基筛选，该菌株具有产生纤维素酶的能力，并对其形态学和ITS系统发育关系进行研究，确定为黑曲霉(Aspergillus niger)。酶学性质的研究表明，该菌株产生纤维素酶发酵培养基的最适碳源为质量分数2％的玉米芯粉，最适氮源为质量分数0.5％的蛋白胨，最适培养温度为28℃，最佳培养时间为5天，最佳孢子悬液接种体积分数为20％，培养基最最适pH为5.5，最适盐浓度为2.5％。

本发明发现的嗜盐产纤维素酶的真菌经如下具体步骤得到：

1.纤维素酶的初步筛选

采用透明圈法，将真菌单菌落接种于刚果红培养基上，28℃恒温培养7d，待菌落长成后，测量透明圈直径(D)与菌落直径(d)，根据二者差值的大小可初步判断产酶活性大小。

2.菌株的鉴定

1)形态鉴定

将菌种接种到查氏培养基上，28℃倒置培养7～14d，观察菌落形态，在接种位点旁斜插入无菌盖玻片，经培养待菌丝爬满盖玻片后，取出玻片并在尼康高级光学显微镜下观察菌丝的形态特征及产孢结构。

所用到的培养基的组成：

加水定容至1L，pH自然；121℃灭菌30min。

2)分子生物学鉴定

a.采用CTAB法提取该菌株的基因组DNA，溶于40μL TE缓冲液中，于-20℃保存备用。

b.使用真菌ITS通用引物序列：

ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)

ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，以该菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增。

c.扩增得到的片段，经电泳验证后，做胶纯化。

d.纯化后送由上海生工进行测序，对序列进行系统发育分析。参见图1，根据形态学及ITS系统发育关系，确定该株真菌为黑曲霉(Aspergillus niger)。

菌株6MA1的ITS序列已提交到GeneBank，登录号为KP987453。参见图2，序列比对分析结果为：提交序列的覆盖度在100％以上。与Aspergillus属黑曲霉(Aspergillus niger)的同源相似度在99％以上，其中同源相似度最高达到100％。菌株与A.niger(登录号：JF436883)、A.niger(登录号：KF496080)、A.niger(KC341970)等处于同一分支，同源比对结果显示其同源度达到100％，确定该菌株为为黑曲霉的一种新菌株。

所用到的培养基的组成：

加水定容至1L，pH自然；121℃灭菌30min。

6、形态特征

菌株6MA1在查氏培养基上培养4d产生呈放射状向外延伸的白色菌丝(图1A所示)，菌丝与培养基结合较牢，整个菌落正面呈绒毛状，继而产生黑色分生孢子头，菌落反面呈淡黄褐色，有折皱。显微镜下观察(图1B)，菌丝宽度为9.5-12.5um，分生孢子梗由一个直立的菌丝生成，顶囊呈均一的圆球形，大小为2.5×2.5um，壁近于平滑或稍粗糙。根据其形态特征，可初步确定为黑曲霉(Aspergillus niger)。

7、本发明嗜盐黑曲霉的纤维素酶学性质检测

实施例1黑曲霉产纤维素酶发酵培养基的最佳碳源的筛选

①将种子液于10％的接种量分别接种于碳源为玉米芯粉、麸皮、纤维素、木屑，米糠的发酵培养基中，28℃，160r·min^-1条件下培养72h。

②将发酵液4000r·min^-1离心10min，得到上清粗酶液，取1mL粗酶液，加入9mL的pH 4.8，0.05mol/L柠檬酸缓冲液，配制成稀释酶液。取2支20mL试管，一支试管中加入0.5mL稀释酶液和1.5mL 0.5％CMC溶液，另一支对照管中加入2.0mL 0.5％CMC溶液，稀释酶液试管每管做3个重复。

③50℃水浴30min，加入3mL DNS试剂。

④沸水浴5min，取出后立即置于冰水中冷却至室温，定容至20mL，摇匀。

⑤在波长540nm条件下测定吸光值。以酶活值对不同碳源绘制柱状图，参见图3，酶学性质的研究表明，该菌株产生纤维素酶发酵培养基的最适碳源为质量分数2％的玉米芯粉。

实施例2黑曲霉产纤维素酶发酵培养基的最佳氮源筛选

①确定最优碳源，分别以(NH4)2SO4、黄豆粉、牛肉膏、酵母膏，蛋白胨为氮源，将种子液于10％的接种量接种于发酵培养基中，28℃，160r·min^-1条件下培养72h。

②-⑤步骤同实施例1。以酶活值对不同氮源绘制柱状图，参见图4，酶学性质的研究表明，该菌株产生纤维素酶发酵培养基的最佳氮源为质量分数0.5％的蛋白胨。

实施例3黑曲霉产纤维素酶发酵培养的最适温度筛选

①确定最佳碳源、氮源的培养基，将种子液于10％的接种量接种于发酵培养基中，分别在24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，160r·min^-1条件下培养72h。

②-⑤步骤同实施例1。以酶活值对不同温度绘制折线图，参见图5，酶学性质的研究表明，该菌株产生纤维素酶发酵培养基的最佳温度为28℃。

实施例4黑曲霉产纤维素酶发酵培养的最佳时间筛选

①确定最佳碳源、氮源及培养温度，将种子液于10％的接种量接种于发酵培养基中，从发酵第2天开始，每隔24h抽样进行酶活测定，直至第7天结束。

②-⑤步骤同实施例1。以酶活值对培养时间绘制折线图，参见图6，酶学性质的研究表明，该菌株产生纤维素酶发酵培养基的最佳时间为5天。

实施例5黑曲霉产纤维素酶发酵培养的最佳孢子悬液接种的体积分数

①确定最佳碳源、氮源、培养温度及时间，将种子液按5％、10％、15％、20％，25％的接种量接种于发酵培养基中，最适温度及时间条件下培养。

②-⑤步骤同实施例1。以酶活值对孢子悬液接种的体积分数绘制折线图。参见图7，酶学性质的研究表明，该菌株产生纤维素酶发酵培养基的最佳孢子悬液接种的体积分数为20％。

实施例6黑曲霉产纤维素酶发酵培养的最适起始pH

①确定最佳碳源、氮源、培养温度、时间及孢子悬液接种的体积分数，用0.05mol/L柠檬酸盐缓冲液配制pH为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5的培养液作为起始培养pH。

②-⑤步骤同实施例1。以酶活值对起始pH绘制折线图，参见图8，酶学性质的研究表明，该菌株产生纤维素酶发酵培养基的最适起始pH为5.5。

实施例7黑曲霉产纤维素酶发酵培养的最适盐浓度

①确定最佳碳源、氮源、培养温度、时间、接种量及起始pH，在培养基中分别添加质量分数为0、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％的NaCl。

②-⑤步骤同实施例1。以酶活值对不同盐浓度绘制折线图，参见图9，酶学性质的研究表明，该菌株产生纤维素酶发酵培养基的最适盐浓度为2.5％。

综上所述，本发明公开的在高盐环境下可以产生纤维素酶的黑曲霉菌株，本发明经过如下方法得到：保藏号CGMCC9404的嗜盐黑曲霉分离自中国陕西省陕北榆林市定边县花马盐湖水泽沉积物，通过刚果红固体培养基初步鉴定该菌株具有产生纤维素酶的能力，并对其进行形态学和ITS分子生物学鉴定，确定为黑曲霉(Aspergillus niger)。经酶学性质的研究，该菌株产生纤维素酶的发酵培养基的最适碳源为质量分数2％的玉米芯粉，最适碳源为质量分数0.5％的蛋白胨，最适培养温度为28℃，最佳培养时间为5天，最佳孢子悬液接种体积分数为20％，培养基起始pH为5.5，最适盐浓度为2.5％。该菌株在盐环境下产生的纤维素酶能保持较高的活性，在造纸和纤维素预处理废水的治理及盐碱地的修复中将具有广阔的应用前景。