一种融合基因及其制备方法、融合基因表达载体及其构建方法、融合基因工程菌及其应用

摘要

本发明公开了一种融合基因及其制备方法、融合基因表达载体及其构建方法、融合基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。该融合基因，将蛋白转导域TAT连接入利尿多肽HKI序列，借助TAT的高效跨膜转运作用，使HKI快速地穿过食道系统内膜进入体内位点，确保HKI在体内运送过程中稳定发挥作用，使棉铃虫过度排泄死亡。本发明融合基因表达载体，将融合基因构建于植物表达载体pB Ⅰ 121中，由35S启动子驱动表达，在植株内高效表达，棉铃虫取食本发明融合基因表达载体遗传转化的转基因植株后3龄棉铃虫幼虫体重增幅明显减少，死亡率高。本发明融合基因工程菌，浸染待发芽植株，实现融合基因遗传转化植株，培育出转基因抗虫植株。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种融合基因表达载体及其制备方法，同 时还涉及一种融合基因表达载体的构建方法、融合基因工程菌及其应用。

背景技术

棉铃虫，夜蛾科铃夜蛾属昆虫的一种，是棉花蕾铃期的大害虫，广泛分布在世界各 地，中国棉区和蔬菜种植区均有发生，主要蛀食蕾、花、铃和嫩叶。棉铃虫天敌很多， 有寄生性天敌—寄生蜂、寄生蝇等，捕食性天敌乌雀类及一些细菌、真菌、病毒等可对 棉铃虫的卵和幼虫起到抑制作用。

利尿激肽helicokinin I(HKI)对棉铃虫的水分代谢活动刺激最为强烈(Seinsche et al.， 2000)，在极微量的HKI注射进入棉铃虫幼体后，即可使其过度排泄，进而导致死亡， HKI作为杀虫物质进行应用的潜力巨大。由于其来源于生物体，对高等生物和环境安全， 因此作为杀虫物质进行应用具有先天的环境优势。如何将HKI作为一种杀虫活性物质 进行使用，是否可以利用害虫的取食行为将其摄入体内发挥作用；如何使有活性的短肽 分子穿透消化道进入体内位点，同时保证短肽在运送过程中的稳定，这是亟待解决的问 题。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种对棉铃虫具有强的毒杀 活性的融合基因。

本发明的目的之二在于提供一种融合基因的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种融合基因表达载体。

本发明的目的之四在于提供一种融合基因表达载体的构建方法。

本发明的目的之五在于提供一种融合基因工程菌。

本发明的目的之六在于提供一种融合基因工程菌的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述融合基因由利尿多肽HKI和蛋白转导域TAT融合制备而成。

上述融合基因的制备方法，包括以下操作步骤：

1)将利尿激肽核苷酸连接在固相载体上，加入三氯乙酸反应，得到脱去5’—羟 基的保护基团的利尿激肽核苷酸片段，记为片段1；

2)将亚磷酰胺保护的蛋白转导域核苷酸单体与四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化 中间体，记为片段2；

3)片段1与片段2缩合反应，加入乙酸酐和1-甲基咪唑终止反应，然后加入碘， 得到融合基因粗产品；

4)将步骤3)制备的融合基因粗产品进行切割、纯化、定量，即得所述的融合基 因。

一种融合基因表达载体，包含有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

上述融合基因表达载体的构建方法，包括以下操作步骤：

1)PCR扩增融合基因，得融合基因扩增片段；

2)将pB Ⅰ 121质粒和步骤1)制备的融合基因扩增片段酶切后，进行连接，得连 接产物；

3)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆载体，提取质粒，酶切和测序 结果正确的质粒命名为pBI121-TAT-HKI，即为所述的融合基因表达载体。

步骤2)中酶切为BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切。

步骤1)中PCR扩增采用的引物为：

P1：5’-CGCGGATCCATGTACGGCCGCAAG-3’；

P2：5’-GCGAGCTCACGCCCCAGGGGCTG-3’(下划线为酶切位点)。

步骤1)中连接的连接体系为：pBI121质粒大片段1.0μL、融合基因3.0μL、2× 反应缓冲液5.0μL、T4DNA连接酶1μL；连接条件为：16℃连接反应24h。

步骤3)中所述酶切为BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切。

一种融合基因工程菌，由融合基因表达载体转入宿主制备而得；所述融合基因表达 载体包含有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

所述宿主为农杆菌LBA4404。

上述融合基因工程菌可用于培育抗虫植株。

TAT(transactivator of transcription，TAT)为病毒有效转录和复制所必须的多肽序列。 TAT能够将与之共价连接的生物大分子非特异地转导细胞内部，这种过程既不依赖于受 体和转运蛋白，也与温度和能量无关，而且对宿主细胞几乎没有毒性。这种具有携带外 源蛋白穿透细胞膜能力的特异多肽序列称为蛋白转导域(Protein transduction Domains， PTDs)，也称细胞穿膜肽(cell penetratingpeptides，CPP)。

利尿多肽Helicokinin是属于昆虫激肽家族的一类小分子昆虫神经肽，整个家族成 员都具有类似的碳末端五肽序列Phe-Tyr-Pro-Trp-Gly-NH₂(FYPWGa)，这个核心5肽对 于其刺激肌肉活动和利尿活动是必需的，研究表明微量昆虫激肽及其类似物可以对昆虫 生理代谢造成较大的影响(Smagghe et al.Antifeedant activity and high mortality in the pea  aphid Acyrthosiphon pisum(Hemiptera:Aphidae)induced by biostable insect kinin analogs， 2010；Nachman et al.Biostable and PEG polymer-conjugated insect pyrokinin analogs  demonstrate antifeedant activity and induce high mortality in the pea aphid Acyrthosiphon  pisum(Hemiptera:Aphidae)，2012)，在昆虫幼体内注射l0^-9M的helicokinin I即可在很 大程度上促进其过度排泄，进而导致昆虫死亡(Seinsche et al.，2000)。

本发明融合基因，将蛋白转导域TAT连接入利尿多肽HKI序列，借助TAT的高效 跨膜转运作用，使HKI快速地穿过食道系统内膜进入体内位点，确保利尿多肽序列在 体内运送过程中稳定发挥作用，使棉铃虫过度排泄，导致死亡。

本发明融合基因的制备方法采用固相亚磷酰胺三酯法合成融合基因，接枝成功率 高，基因纯度高，操作简便，适于工业化推广应用。

本发明融合基因表达载体，将融合基因构建于植物表达载体pB Ⅰ 121中，由35S 启动子驱动表达，该融合基因遗传转化进入植株后，在植株内高效表达，棉铃虫取食本 发明融合基因表达载体遗传转化的转基因植株后3龄棉铃虫幼虫体重增幅明显减少，死 亡率高。

本发明融合基因表达载体的构建方法，工艺过程简单，便于操作实现，适于工业化 推广应用。

本发明融合基因工程菌，将融合基因表达载体转化入宿主，形成带有融合基因的菌 体，采用本发明融合基因工程菌浸染待发芽植株，实现融合基因遗传转化植株，培育出 转基因抗虫植株，融合基因在转基因植株中高效表达，棉铃虫取食植株后，使融合基因 进入棉铃虫体内，其中的利尿多肽HKI基因在棉铃虫体内发挥作用，致使棉铃虫过度 排泄而死亡，最终实现防治棉铃虫的目的。

附图说明

图1为烟草组织再生及最适卡那霉素筛选再生；a为分化初期叶盘；b为最适分化 培养；c为再生烟草组培苗生根；d为烟草分化受到卡那霉素完全抑制；e为抗性芽的 卡那霉素筛选；f为转基因烟草盆栽开花；

图2为不同烟草植株中融合基因表达RT-PCR分析；其中1和2为实施例1不同批 次培育的转基因烟草植株；3为野生烟草植株；TAT-HKI代表融合基因。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本实施例融合基因在DNA合成仪上进行，其制备方法操作步骤如下：

1)将利尿激肽核苷酸连接在固相载体上，加入三氯乙酸反应，得到脱去5’-羟基 的保护基团的利尿激肽核苷酸片段，记为片段1；

2)将亚磷酰胺保护的蛋白转导域核苷酸单体与四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化 中间体，记为片段2；

3)片段1与片段2缩合反应，加入乙酸酐和1-甲基咪唑终止反应，然后加入碘， 得到融合基因粗产品；

4)将步骤3)制备的融合基因粗产品进行切割、采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化、 定量，即得所述的融合基因。

本实施例融合基因表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本实施例融合基因表达载体的构建方法，具体操作步骤如下：

1)以融合基因为模板，设计引物为

P1：5’-CGCGGATCCATGTACGGCCGCAAG-3’；

P2：5’-GCGAGCTCACGCCCCAGGGGCTG-3’(下划线为酶切位点)。

PCR扩增融合基因，得融合基因扩增片段；

PCR反应体系：加入2.5μL 10×buffer,1.8μL 25mmol/L MgCl₂,1μL 10mmol/L  dNTP，Taq DNA聚合酶1.0U(以上试剂购自上海生工生物工程公司),10nmol/L引物各 1μL,加适量双蒸水至25μL；

PCR反应程序：94℃4min预变性后，94℃30s，59℃30s，72℃90s，共30个 循环，最后72℃延伸7min；

2)将pB Ⅰ 121质粒和步骤1)制备的融合基因扩增片段采用BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶 切酶切，酶切后凝胶回收pBI121质粒大片段和融合基因，采用T4-DNA连接酶进行连 接，得到连接产物；其中连接体系为：pBI121质粒大片段1.0μL、融合基因3.0μL、 2×反应缓冲液5.0μL、T4DNA连接酶1μL；连接条件为：16℃连接反应24h；

3)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有60mg/L的卡那霉素的LB平板上筛 选抗性质粒，对菌斑小量提取质粒，并对所提取载体质粒用BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切分 析鉴定，最终挑选测序分析正确的载体质粒命名为pBI121-TAT-HKI，即为所述的融合 基因表达载体。

本实施例融合基因工程菌，将融合基因表达载体pBI121-TAT-HKI电击转入农杆菌 LBA4404，即得融合基因工程菌。

本实施例融合基因工程菌用于培育抗虫植株，如图1所示，K326烟草叶片经过融 合基因工程菌浸染，进行分化筛选，分化筛选的培养基组成为：MS培养基、1㎎/L 6- 苄氨基腺嘌呤、0.2㎎/L萘乙酸、50㎎/L卡那霉素，10d后外植体开始萌生小芽点，芽 点逐渐长大为不定芽，绿色不定芽长至3cm左右时，转移至生根培养基上诱导生根， 生根培养基的组成为：1/2MS培养基、0.05㎎/L萘乙酸、50㎎/L卡那霉素，生根苗长 大后载移至花盆中培养，获得转基因烟草植株，棉铃虫取食转基因烟草植株后，融合基 因在棉铃虫体内表达，致使棉铃虫过度排泄死亡，达到防治棉铃虫的目的。

性能检测：

1、分别检测实施例1和对比例制备的转基因烟草植株中融合基因表达量，结果如 图2所示，由图2可知，经RT-PCR分析，1和2表示的实施例1制备的转基因烟草中 融合基因均得到了转录表达，转基因系1相比转基因系2融合基因的表达量更高。

2、对实施例1制备的转基因烟草植株进行毒力测定：

测定分组：实施例1第一批次培育的转基因烟草植株为试验组1；实施例第二批次 培育的转基因烟草植株为试验组2；野生型烟草植株为对照组。

测定方法：分别取3组中生长一致的烟草叶片，蒸馏水洗净晾干，放入培养皿中， 并接入体重均为15mg的棉铃虫3龄初的幼虫，每个培养皿中接种1头棉铃虫，每组烟 草叶片接种60头棉铃虫，20头为一小组，置于培养箱中。

培养条件：温度27±1℃，相对湿度65～70％，光照比(L：D)16：8h，每天更换一次 饲料，保持烟草叶片充足，每2d称量各棉铃虫体重，并统计死亡率；死亡判断标准： 以小毛笔轻触虫体，不能协调运动认为死亡；测定数据采用DPS软件进行方差分析。

测定结果如下表1所示：

表1 死亡率和体重检测结果比较

上述表1显示的数据表明，棉铃虫幼虫取食本发明融合基因培育的转基因烟草后， 棉铃虫幼虫生长明显受到抑制，体重增加比其他组小，且随着取食时间的延长，死亡的 个体逐渐增多，取食第一批培育的转基因烟草第6天，死亡率达到65.5％，而取食第二 批培育转基因烟草后，第6天死亡率为49.8％，取食野生型烟草的试验组校正死亡率仅 为5.9％，取食本发明融合基因培育的转基因烟草试验组幼虫死亡率同野生型对照组之 间差异极显著，由此可见本发明融合基因通过构建的表达载体遗传转入植株内，培育出 抗虫植株，融合基因在抗虫植株内能高效表达，并对棉铃虫具有很强的毒害活性。