官能化的PLA-PEG共聚物,其纳米颗粒,其制备及其用于靶向药物递送和造影的应用

摘要

本发明涉及新型的官能化的含PEG-PLA的共聚物，包含其的纳米颗粒，其制备方法，及其用于位点特异性药物递送和造影的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及靶向药物递送和造影领域，特别地，涉及通过将药物非共价 包囊或缀合入聚(乙二醇)-聚(乳酸)(PEG-PLA)纳米颗粒的方式的递送。

背景技术

PLA-PEG纳米颗粒的合成及其在药物递送中的应用已在文献中大量描 述。在PLA-PEG组合物中，PLA(聚(乳酸))为疏水的且PEG为亲水的。 PLA-PEG在含水介质中组装成为纳米颗粒，PLA形成核且PEG形成冠。在 静脉注射时，已显示PLA-PEG纳米颗粒中的PEG冠保护纳米颗粒对抗吞噬 作用(“隐形作用”)，并且由此使纳米颗粒的快速的系统性清除最小化，并由 此增加它们的系统性半衰期(美国专利5,683,723，描述基于聚氧乙烯和聚乳 酸嵌段共聚物的纳米颗粒)。此外，这样的纳米颗粒通过先前描述的“增强的 渗透性和保留”(EPR)而在肿瘤中聚集。特别地，在癌症领域中，由于化学治 疗的强副作用，期望肿瘤特异性治疗，并且在此语境中，聚合物纳米颗粒已 被认为是有前景的药物递送系统。当被引入PLA-PEG纳米颗粒中时，药物 经历延长的系统循环并且由于EPR作用而在肿瘤中可能具有较高的浓度。 为了以增加的特异性将纳米颗粒递送至肿瘤，可以采用使用归航设备的组织 靶向/聚集方法(Pulkkinen等，Eur J Pharm Biopharm 70(2008)66-74；Zhan 等，J Control Rel 143(2010)136-142；Farokhzad等，Cancer Res 64(2004) 7668-7672；Gao等，Biomaterials 27(2006)3482-3490)。

因此，发明人已对进一步使用靶向配体官能化的PLA-PEG纳米颗粒的 应用进行研究。

在不同聚合物纳米颗粒(Lv等，J Colloid Interface Sci.356(2011)16-23； Jubeli等，J Polym Sci Part A:Polym Chem.48(2010)3178-3187；Lecomte等， Macromol Rapid Commun.29(2008)982-997)或金属纳米颗粒(Hanson等， US2010/0260676A1,2010)的合成的文献中已描述点击化学(Huisgen偶联)的 应用。

由于产生高收率，反应条件易于操作，并且由于反应对氧气和水不敏感 因此可放大，因此点击化学受到关注。此反应的背景是公知的，涉及少量的 催化剂并导致高偶联收率。

最近，Deshayes等(Pharm.Res.(2011),28,1631-1642)报导了环肽(用作特 异性结合至靶向血管内皮生长因子(VEGF)的配体)通过点击化学缀合至聚偏 二氟乙烯-聚(丙烯酸)纳米颗粒。

点击化学已被考虑用于合成包含PLA和PEG聚合物两者的大分子。 Tang等，Macromolecules 2011,44,1491-1499公开了PEG-g-PLA-炔基(alkinyl) 中间体与叠氮衍生物(聚(叠氮基丙基-L-谷氨酸根))的偶联。此外，YU等， Macromolecules,2011,44(12),4793-4800，最近描述了由大分子PLA-g-多西 紫杉醇-PEG制成的纳米颗粒，其中多西紫杉醇桥接PLA主链和PEG侧链。 然而，药物未物理地包囊入纳米颗粒，且结构不包括靶向配体。Lu等， Bioconjugate Chem 2009,20,87-94，也描述了通过点击化学制备的包含PLA 和PEG的大分子，并且在其上连接用于细胞靶向的肽(RGD＝精氨酸-甘氨 酸-天冬氨酸根)。大分子的结构涉及结构上复杂的中间体的合成：叠氮化物 共聚物(聚(2-甲基-2-羧基三亚甲基-碳酸根-共-D,L-丙交酯)-g-PEG-叠氮化物) 和炔修饰的KGRGDS肽。

Zhang等(Mol.Pharmaceutics 2012,9,2228-2236)公开了由包含PLA和 PEG的大分子制备的纳米颗粒，其中表面使用点击化学用配体缀合，由此产 生直接地与三唑基团连接的配体。Xiao等(International Jounal of  nanomedicine 5,1,2010,1057-1065)一般地提及包含PEG-PLA的纳米颗粒。 Arutselvan等(Chemical Communications 7,2007,695-697),WO 2011/046946, Steinmetz等Journal of the American Chemical Society 131,47,2009, 17093-17095)和Adibekian等(Nature Chemical Biology 7,2011,469-479)公开 了炔-PEG衍生物。

因此，需要设计其上可以使用点击化学连接期望的官能化的配体的能够 包囊用于位点特异性递送的药物的包含PEG-PLA的纳米颗粒的直接制备方 法。

发明内容

由此，本发明涉及提供可以通过点击化学获得的包含通过连接子与靶向 配体共价结合的易于制备的PLA-PEG链的PLA-PEG纳米颗粒。

根据本发明，纳米颗粒的制备涉及可起可点击的共聚物平台作用的 PLA-PEG-叠氮化物化合物的合成，在其上可以通过通用的方法使用点击化 学偶联任何官能化的炔配体例如归航设备、造影剂、刺激响应剂、对接剂 (docking agent)、细胞穿透增强剂、解毒剂、药物。

因此，根据第一个方面，本发明涉及式(A)的化合物

其中：

PLA表示聚乳酸剩余部分(rest)；

PEG表示聚乙二醇剩余部分；

连接子PEG’为聚乙二醇剩余部分；且

配体为官能化的配体剩余部分。

此处使用的术语“剩余部分”指二价或单价基团(取决于其衍生自的分子) 或其衍生物。

在上述通式(A)中，可以考虑以下具体的实施方案或其任意组合：

-根据一个实施方案，PEG’具有式

其中：

n’为单元的数目，且为1-10之间

(1)为与–(CH₂)-三唑基团的键连接；

(2)为与配体的键连接。

-根据一个实施方案，PLA具有式：

其中：

(3)为与PEG部分的键连接；且

m为单元的数目，且为1和500之间，对应于约144和72000之间的分 子量。在另一个实施方案中，m通常为100和300之间，对应于约14400和 43200g/mol之间的分子量。

-根据一个实施方案，PEG具有式：

其中：

(4)为与–PLA的键连接；

(5)为与的氮原子的键连接；且

n为单元的数目，且为1和300之间，对应于约44和13200g/mol之间 的分子量。在另一个实施方案中，n为20和70之间，对应于约880和3080 g/mol之间的分子量。

PLA和PEG之间的结合(PLA-PEG)在于PLA部分的末端羧酸基团和 PEG部分的末端羟基基团之间的酯键。

PEG’和配体之间的结合(PEG’-配体)未表示但其在于通过配体的羧酸基 团和产生于PEG’的末端羟基基团的氨基基团形成的酰胺键。

在一个实施方案中，配体可以选自归航设备、诊断剂、造影剂、刺激敏 感剂、对接剂、细胞穿透剂、解毒剂、药物。在式(A)的化合物的具体的实 施方案中，配体可以选自茴香酰胺、叶酸、和荧光染料例如FP-547。

在本发明的语境中：

-卤原子指氟、氯、溴或碘；

-(C₁-C₆)烷基基团指饱和的脂肪族基团，其包含1-6个碳原子(有利地， 1-4个碳原子)且为直链的或支化的。以实例的方式可以提及的是甲基、乙基、 丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。

式(A)的化合物可以以游离碱的形式提供或以与酸的加成盐的形式提 供，其也形成本发明的一部分。

这些盐可以有利地用药学上可接受的酸制备，但可用于例如式(A)的化 合物的纯化或分离的其它酸的盐也形成本发明的一部分。

式(A)的化合物可形成纳米颗粒。因此，根据另一个目的，本发明还涉 及包含一种或多种相同的或不同的式(A)化合物的纳米颗粒。

此处使用的表述“相同的或不同的化合物”说明所述化合物可以具有相 同的或具有不同的式，取决于它们不同的PEG、PLA、PEG’、R、m、n等 的定义。

所述纳米颗粒也可以包含一种或多种相同的或不同的式(I’)的化合物：

PLA-PEG-OR   (I′)

其中PLA、PEG如式(A)中所定义，且R为H或C₁-C₆烷基例如甲基。

所述纳米颗粒可以任选地包含药物。

此处使用的术语“药物”指可以给药至有需要的患者的治疗物质。任何感 兴趣的相关药物(特别是水不溶性药物)都可以被非共价地包囊入纳米颗粒和 /或共价地缀合至纳米颗粒(任选地通过连接子)，以待被递送至身体。

特别地，药物可以为抗生素、抗癌剂、抗病毒剂、抗炎剂、疫苗抗原或 保健食品。

特别地，药物可以为细胞毒性剂例如紫杉烷类，更具体地为多西紫杉醇。

因此，在一个实施方案中，药物非共价地包囊(例如物理包囊)入纳米颗 粒中。在其另一个实施方案中，药物任选地通过连接子共价地缀合至纳米颗 粒，特别是当配体是药物时。

在具体的实施方案中，配体不是药物，但药物非共价地包囊入纳米颗粒 中。

此处使用的术语“纳米颗粒”指平均直径在10nm和900nm之间的颗粒。 在另一个实施方案中，本发明的纳米颗粒的平均直径在50和300nm之间。

它们通常显示出0.01和0.4之间的多分散指数(PdI)，更特别地在0.1和 0.4之间，且zeta电位在-30和+30mV之间。

具有阳离子配体，zeta电位可以在1和30mV之间，具有阴离子配体， 在-30和-1mV之间。

本发明的纳米颗粒示于图2-3中。

根据本发明，所述纳米颗粒可以通过式(A)的化合物的纳米析出制备， 任选地在存在式(I’)的化合物的情况下和/或任选地随后进行药物的非共价包 囊或共价缀合。

此处使用的术语“纳米析出”指包括在悬浮液中的纳米颗粒形式的一种 或多种化合物的沉淀或乳化和体积减小的方法。

通常，所述方法包括悬浮液的离心。所述方法还可以包括选自以下的一 个或多个步骤：

-在适合的溶剂例如二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、四氢呋喃等或 溶剂的混合物中制备式(A)的化合物和任选存在的式(I’)化合物的有机相。

-制备任选地用一种或多种稳定剂例如胆酸钠、聚乙烯醇(PVA)、泊洛 沙姆、磷脂等稳定的水相；

-将有机相和水相混合；

-悬浮液的体积减小(例如通过使用超声)；

-移除有机相，例如通过在真空下或在气流下蒸发；

-含水相的离心，特别是在高至50000g下超速离心；

-收集纳米颗粒；和/或

-将获得的纳米颗粒再悬浮于含水介质中。

通常，通过使用任选存在的稳定剂通过使用在含水相中沉淀的作为有机 相的与水混溶的有机溶剂(例如丙酮)，或通过使用与含作为稳定剂的PVA或 泊洛沙姆或胆酸钠的水相混合的作为有机相的二氯甲烷或乙酸乙酯，而获得 本发明的纳米颗粒。适于制备纳米颗粒的泊洛沙姆可以商标Pluronic获得。 适合的泊洛沙姆为泊洛沙姆188(可以F68或F68,BASF 的形式获得)。

根据本发明，由PLA-PEG官能化的配体制备的纳米颗粒可用于多种目 的，包括将治疗物质(药物)递送至人体中。在本发明的一个实施方案中，纳 米颗粒另外包含药物。在此情况中，治疗物质非共价地包囊(物理包囊)入纳 米颗粒基质中，且更好地递送至预期的组织。

在另一个实施方案中，药物可以共价地缀合至式(A)的化合物，例如代 替配体，任选地通过连接子。为药物递送和造影应用，为了保持药物与载体 的体内联系，共价缀合可能是受关注的。

通过将不同的式(A)的化合物与不同的配体混合，可以获得多官能化的 纳米颗粒。多官能化的纳米颗粒可以用于组合应用(参见图3)。

根据本发明，纳米颗粒可以通过一种或多种式(A)的化合物和任选存在 的式(I’)的化合物的纳米析出制备，任选地在存在药物或不同的药物(用于组 合治疗)的情况下。

此处在式(A)的化合物中或在由其制备的纳米颗粒中使用的表述“官能 化的配体”指能够靶向或追踪药物进入人体的递送的任意种类的化合物，或 药物自身，特别是当药物为位点特异性时，例如与受体特异性结合的药物。 特别地，官能化的配体可以选自：

-能够跟随纳米颗粒在细胞、组织、动物、或患者中的吸收和分布的化 合物，例如通过提供能够提供纳米颗粒分布的造影的标记；

-能够产生纳米颗粒的期望的最终效果例如引发细胞死亡、或激活或抑 制受体、酶、或基因的化学或生物试剂，包括药物；

-受体配体例如雌激素受体拮抗剂、雄性激素受体拮抗剂、叶酸、茴香 酰胺、RGD肽、抗体、肽靶向的基因载体、适配体、和肿瘤坏死因子。

官能化的配体可以包括归航设备、造影剂、刺激敏感剂(热敏剂、pH- 敏感剂、光敏剂等)、对接剂、细胞穿透增强剂、解毒剂、药物等，取决于 预期的应用。

例如，识别并结合至特定的细胞/组织型的归航设备可以用于将负载有 药物的纳米颗粒靶向至特定的关注的器官/有疾病的组织，这也可以被称为 “位点特异性药物靶向”。预期PLA-PEG归航设备纳米颗粒改善包囊的药物 至预期的疾病位点的递送，增加靶组织中的局部药物浓度，并且同时促进药 物缓释。这可能导致有疾病的组织/细胞对药物的增强的和长期的暴露，并 因此可以获得改善的治疗益处和降低的副作用。特别地，这样的归航剂可以 选自膜识别配体例如茴香酰胺(具有对sigma受体的亲和性)、叶酸(具有对一 些肿瘤细胞系的表面上过表达的叶酸根受体的亲和性)、能够识别相应的表 面抗原的抗体(例如HER2、运铁蛋白、抗-EGFR抗体等)、与肿瘤血管生成 内皮细胞上过表达的α_vβ₃整联蛋白结合的RGD序列、与CD44受体结合的 透明质酸、与运铁蛋白受体结合的运铁蛋白等。

在另一种情况中，对于治疗和解毒策略，配体还包括识别并结合至可溶 于生物学流体或在生物学流体中循环的生物学化合物(例如血管内皮生长因 子(VEGF))。

如果偶联至PLA-PEG纳米颗粒上的官能化的配体为造影剂/诊断剂，则 纳米颗粒可以用于身体中的疾病或缺陷的造影/诊断。特别地，这样的造影 剂/诊断剂可以选自氧化铁、钆复合物、吲哚菁绿、近红外荧光探针、正电 子发射体(例如¹⁸F、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu)。

使用例如外部磁场，在通过近红外光照射之后产生局部的刺激响应变化 例如热，官能化的配体例如刺激响应物质可用于将PLA-PEG纳米颗粒引导 至预期的位点。特别地，这样的刺激响应物质可以选自例如氧化铁纳米颗粒、 金纳米颗粒或任何可照射活化的物质。

官能化的配体例如对接剂可以用于将药物对接(例如通过离子配对原 则)，以保护其防止分解并将其递送至体内的合适位置。作为实例，寡核苷 酸通过非胃肠道途径的递送可以通过将其对接至寡肽偶联的PEG-PLA而使 其更有效，其中寡肽带有与寡核苷酸相反的电荷。特别地，这样的对接剂可 以选自寡肽(例如聚赖氨酸、聚(亮氨酸-赖氨酸)、聚(亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸- 亮氨酸))。

官能化的配体例如细胞穿透增强剂可以用于改善纳米颗粒的细胞吸收 并因此改善其包囊的药物的细胞吸收，这可以使得药物的有效性增强。特别 地，这样的细胞穿透增强剂可以选自反式转录的反式激活因子(TAT)序列、 穿膜肽(penetratin)、高精氨酸序列、VP22蛋白序列等。

官能化的配体例如解毒剂可以用于自系统循环中消除毒性物质。特别 地，这样的解毒剂可以选自多种物质例如螯合剂(用于金属解毒)、维生素 B12、钴啉醇酰胺、硫氰酸酶(用于氰化物解毒)、有机磷水解酶(用于有机磷 解毒)、纳洛酮、阿托品(用于阿片样物质解毒)、识别特定的毒素的抗体/抗 体片段。

因此，如上所述，配体可以选自：

选自雌激素受体拮抗剂、雄性激素受体拮抗剂、叶酸、茴香酰胺、能够 识别相应的表面抗原的抗体例如HER2、运铁蛋白或抗-EGFR抗体、与肿瘤 血管生成内皮细胞上过表达的α_vβ₃整联蛋白结合的RGD序列、与CD44受 体结合的透明质酸、与运铁蛋白受体结合的运铁蛋白、肽靶向的基因载体、 适配体、和肿瘤坏死因子的膜识别配体；

选自氧化铁、钆复合物、吲哚菁绿、近红外荧光探针、或正电子发射体 (例如¹⁸F、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu)的诊断剂/造影剂；

选自氧化铁纳米颗粒、金纳米颗粒或任何可照射活化的物质的刺激响应 物质；

选自寡肽(例如聚赖氨酸、聚(亮氨酸-赖氨酸)、聚(亮氨酸-赖氨酸-赖氨 酸-亮氨酸))的对接剂；

选自反式转录的反式激活因子(TAT)序列、穿膜肽、高精氨酸序列、或 VP22蛋白序列的细胞穿透剂；

选自维生素B12、钴啉醇酰胺、硫氰酸酶、有机磷水解酶、纳洛酮、阿 托品、或识别特定的毒素的抗体/抗体片段的解毒剂；或

选自抗生素、抗癌剂、抗病毒剂、抗炎剂、疫苗抗原或保健食品的药物。

根据另一个目的，本发明还涉及上述式(A)的化合物的制备方法。

所述式(A)的化合物的制备方法包括将以下偶联：

-式(I)的化合物：

PLA-PEG-N₃  (I)

与

-式(XI)的化合物：

其中PLA、PEG、PEG’和配体如上述式(A)中定义。

偶联可以通过所谓的“点击化学”进行。此术语指其中叠氮化物(N3)化合 物与炔基基团反应以形成1,2,3-三唑的任意方法。通过应用或采用本领域技 术人员通常已知的任意Huisgen实验步骤，特别是参考Chem.Rev.2008,108, 2952–3015中公开的条件，可以根据Huisgen反应进行点击化学偶联反应。 通常，在有机条件下或含水条件下，根据Huisgen反应进行所述点击化学偶 联反应。

式(I)的化合物可以为在有机溶剂中的溶液的形式或在含水介质中的纳 米颗粒的形势，任选地包含以下定义的式(I’)的化合物。

在有机条件下，所述点击化学偶联反应通常在存在溴化铜(I)(CuBr)和 N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)的条件下进行(Chem.Rev. 2008,108,2952–3015)。尤其，此反应可以在有机溶剂例如二甲基甲酰胺 (DMF)、四氢呋喃(THF)、甲苯、二甲基亚砜(DMSO)中，在室温和反应混合 物的回流温度之间的温度下进行，有利地在无水环境中进行。通常，使用过 量的式(XI)的化合物。

在含水条件下，通常根据Chem.Rev.2008,108,2952–3015进行所述点 击化学偶联反应，特别是在存在水和铜衍生物例如CuSO₄-5H₂O的条件下。 存在催化剂的还原剂例如抗坏血酸可能是有利的。通常，当式(I)的化合物为 纳米颗粒的形式时使用含水条件，特别是在含水悬浮液中。

在点击反应中，包含式(I)的化合物的纳米颗粒也可以包含式(I’)的化合 物：

PLA-PEG-OR   (I′)

其中PLA和PEG如式(A)中所定义，且R为H或C₁-C₆烷基，例如甲 基。

其中R为甲基的式(I’)的化合物在例如US 5,683,723中公开。

如果需要，纳米颗粒悬浮液还可以包括稳定剂、例如聚乙烯醇(PVA)、 (例如F68)或胆酸钠。

式(A)的化合物的制备中涉及的式(I)的化合物为本发明的另一个独特的 目的。

因此，本发明还涉及式(I)的化合物：

PLA-PEG-N₃   (I)

其中PLA和PEG如式(A)的化合物中所定义。

式(I)的化合物可以形成纳米颗粒，其为本发明的另一个目的。

所述纳米颗粒还可以包含一种或多种相同的或不同的如上所定义的式 (I’)的化合物：

PLA-PEG-OR   (I′)。

所述纳米颗粒示于图1中。

所述纳米颗粒可以通过任选地在存在一种或多种相同的或不同的式(I’) 的化合物的条件下将一种或多种相同的或不同的如上所定义的式(I)的化合 物纳米析出而获得。

纳米析出可以根据上述公开的关于包含一种或多种式(A)的化合物的纳 米颗粒的方法进行。

包含式(A)的化合物的纳米颗粒也可以通过使包含一种或多种根据本发 明和下述的式(I)化合物的纳米颗粒与一种或多种如上所定义的式(XI)的化 合物反应而制备，任选地随后进行药物的非共价包囊或共价缀合。

由于本发明的方法允许对由式(A)的化合物形成的纳米颗粒的官能度的 容易的修饰，因此是高度通用的。

通过将式(I)的化合物与PLA-PEG共聚物以不同的比例混合以制备包含 式(I)或(A)的化合物以及未被叠氮化物基团官能化的PLA-PEG共聚物(参见 图1)的纳米颗粒，随后使所述纳米颗粒与式(XI)的化合物反应，本发明的方 法包括按期望改变或调节纳米颗粒的表面上的配体的密度的可能性。

使用不同的PEG和PLA链长(参见图2)，本发明的方法允许式(I)或(A) 的化合物用于不同的应用。例如，在系统室中对降解敏感的治疗物质(例如 寡核苷酸)可以通过对接剂配体偶联至包含短链长PEG的PLA-PEG，随后与 由长链PEG制成的PLA-PEG共聚物混合，使得长链PEG形成似刷子的表 面，其中治疗剂被掩蔽并由此防止其在系统循环中被快速降解。

此外，本发明的方法允许将不同的PLA-PEG官能化的配体型(例如 PLA-PEG归航设备+PLA-PEG造影剂+PLA-PEG刺激响应物质)组合，用于 形成用于组合应用的多官能化的纳米颗粒(参见图3)。

式(I)的化合物是本发明的关键，这是由于起可点击的可生物降解的共聚 物平台的作用，使用点击化学(通过式(XI)的化合物的方式)可以在其上偶联 任意炔官能化的配体，根据官能化的配体的类型用于多种应用例如药物递 送、造影、解毒等。因此，本发明的益处尤其包括合成能够通过非胃肠道途 径给药的多种官能化的配体偶联的共聚物纳米颗粒的灵活性。

此外，可以通过将适合比例的式(I)的化合物和式(I’)的化合物混合而调 节纳米颗粒表面上的官能化的配体密度。此外，可以构建纳米颗粒使得具有 不同链长的PEG部分，以促进在系统循环中为化学上敏感的治疗物质的静 脉递送。此外，用于偶联官能化配体的点击反应可以在纳米颗粒形成前进行 或可以在预先形成的纳米颗粒上进行，取决于配体的化学性质。

根据另一个目的，本发明还涉及制备式(I)的化合物的方法，包括使式(II) 的化合物：

H-PEG-X   (II)

其中PEG如式(A)中所定义，且X表示叠氮化物(N₃)官能或卤素例如Br 原子；

与下式的丙交酯化合物反应：

当X为卤素原子时，随后使获得的式(III)的化合物与NaN₃反应：

PLA-PEG-Hal   (III)

其中PLA和PEG如式(A)中所定义，且Hal表示卤素原子，例如Br。

与丙交酯的此反应通常通过开环聚合进行。通常，此反应在存在 Sn(Oct)₂的调价下进行。其可以本体地进行，通常在加热下进行，或者在具 有高沸点的适合的有机溶剂例如甲苯或二甲苯中进行。

通常，已知反应总是可以在完成前停止，丙交酯化合物的量取决于式(I) 的化合物中期望的n。通常，PEG大分子引发剂(macro-initiator)和催化剂 Sn(Oct)₂的摩尔比例为1和10之间。

优选地，反应在无水条件下进行和/或在室温和反应混合物的回流温度 之间的温度下进行。

与NaN₃的反应通常在质子惰性有机溶剂例如DMF、二甲基甲酰胺、丙 酮等中进行，NaN₃过量。

式(II)的化合物：

H-PEG-X   (II)

可以通过取代反应随后通过脱保护反应由式(IV)的化合物制备：

Pg-PEG-OH   (IV)

其中Pg表示羟基保护基团例如苄基(苯基-CH₂-)且PEG如式(A)中所定 义。

下述保护基团Pg对应于以下基团：一方面，其使得可以在合成步骤 期间对反应性官能团例如羟基或胺的保护，另一方面，其使得可以在合成步 骤末恢复完整的反应性基团。保护基团的实例以及保护和脱保护各种官能基 团的方法在P.G.M.Wuts和T.W.Greene,Greene's Protective Groups in  Organic Synthesis,4.ed.(2007),John Wiley & Sons和J.F.W.McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry,Plenum Press,1973中给出。

取代反应包括通过适合的试剂，例如分别用N-卤代琥珀酰亚胺(例如 N-溴代琥珀酰亚胺(NBS))或叠氮化钠，使用卤素原子或叠氮化物基团取代OH 基团。

当卤素基团待被取代时，此反应通常使用在适合的有机溶剂例如二氯 甲烷中的PPh₃，使用适合的N-卤代琥珀酰亚胺试剂进行。

当叠氮化物基团待被取代时，可以如下使用离去基团进行初始取代：

1)使用离去基团取代式(IV)的化合物的OH基团，

2)使用叠氮化物(N₃)基团取代步骤1)中获得的化合物的离去基团。

此处使用的“离去基团”对应于以下基团：其可以通过破坏异裂键(即分 裂产生阳离子和阴离子的键)而容易地自分子分开，具有电子对的分离。此 基团随后可以容易地被另一个官能基团代替，例如在取代反应期间。这样的 离去基团可以在于卤素原子或活化的羟基基团，例如甲磺酸根、甲苯磺酸根、 三氟甲基磺酸根或乙酰基基团等。离去基团的实例以及涉及其制备的参考文 献在《Advances in Organic Chemistry》,J.March,3^rd Edition,Wiley  Interscience,p.310-316中给出。

例如，在步骤1)中，离去基团为甲磺酸根，且因此在存在甲磺酰氯(MsCl) 的情况下进行取代。此反应通常在存在DMAP的情况下，在有机溶剂例如 二氯甲烷中进行。

步骤2)中的离去基团被叠氮化物基团的取代可以在存在叠氮化钠的条 件下，在适合的有机溶剂例如DMF中进行。

脱保护步骤包括将获得的取代的卤代化合物或叠氮基化合物的保护基 团Pg水解，以获得式(II)的化合物。

通常，根据公知的步骤在酸性条件下进行水解，特别是当Pg-为苯基 -CH₂-时使用浓HCl。

根据另一个目的，本发明还涉及式(XI)的化合物：

其中PEG’和配体如式(A)中所定义。

特别地，本发明涉及除以外的式(XI)的化 合物。

根据另一个目的，本发明还涉及制备式(XI)的化合物的方法：

包括将

-式(XII)的化合物

与

-配体前体偶联

其中PEG’和配体如上述式(A)中所定义。

“配体前体”为当与式(XII)的化合物的-NH₂基团反应时生成基团配体的 化合物，其中配体为如式(A)中所定义的官能化的配体的剩余部分。

所述偶联可以在存在碱的条件下，在存在肽偶联试剂的条件下进行。

所述肽偶联剂可以选自已知的肽偶联剂，且更特别地选自PyBOP(苯并 噻唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)或EDC/NHS(1-乙基-3-[3-二甲 基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐/N-羟基磺基琥珀酰亚胺)。

碱可以为任何有机碱或无机碱，更具体地为无机碱例如三乙胺(TEA)或 N,N-二异丙基乙二胺(DIPEA)。

对于具体的组合，在一个实施方案中，PyBOP(苯并噻唑-1-基-氧基三吡 咯烷子基鏻六氟磷酸盐)与N,N-二异丙基乙二胺(DIPEA)一起使用，且在另一 个实施方案中，EDC/NHS(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐/N- 羟基磺基琥珀酰亚胺)与三乙胺一起使用。

反应可以在适合的有机溶剂例如二氯甲烷、DMF、或二甲基亚砜(DMSO) 中进行。

代表性的配体前体包括：

其为茴香酰胺前体，产生配体-＝为茴香酰胺的剩余部 分；

叶酸；

FP-547-NHS，产生配体-＝-NH-C(＝O)-(CH₂)₂-FP547为FP547的剩余部 分。

根据一个实施方案，式(XII)的化合物可以通过以下制备：

-使式(XIII)的化合物：

H-PEG′-OH   (XIII)

与式(XIV)的化合物：

和碱反应，

其中PEG’如式(A)中所定义且Hal’表示卤素原子例如Br，

以形成式(XV)的化合物：

随后：

-将式(XV)的化合物转化为式(XII)的化合物。

式(XIII)的化合物与式(XIV)的化合物的反应通常在存在强碱例如NaH 的条件下，在适合的有机溶剂例如DMF中进行。

式(XV)的化合物至式(XII)的化合物的转化可以通过多种方法实现。

特别地，其可以包括：

使式(XV)的化合物与邻苯二甲酰亚胺和PPh₃反应以形成式(XVI)的化合 物：

随后：

-使式(XVI)的化合物与水合肼反应以形成式(XII)的化合物。

式(XV)的化合物与邻苯二甲酰亚胺和PPh₃的反应通常在适合的有机溶 剂例如THF中，在存在二异丙基偶氮二羧酸酯(DIPAD)的条件下进行，通常 在室温下进行。

获得的式(XVI)的化合物与水合肼(N₂H₄.H₂O)的反应可以在作为溶剂的 乙醇中进行。

可选地，式(XV)的化合物至式(XII)的化合物的转化包括：

-使式(XV)的化合物与式(XVII)的化合物反应：

Lg-Hal″   (XVII)

其中Lg为离去基团且Hal”为卤素原子，

以形成式(XVIII)的化合物：

随后：

-使获得的式(XVIII)的化合物与水合肼(N₂H₄.H₂O)和邻苯二甲酸钾反 应，以形成式(XII)的化合物。

在式(XVII)中，Lg有利地为甲磺酰基基团(Ms)且Hal”可以为Cl原子。

此反应通常在存在碱例如有机碱例如三乙胺(Et₃N)和任选存在的催化剂 例如二甲基氨基吡啶(DMAP)的条件下进行，和/或在适合的有机溶剂例如二 氯甲烷中进行。

获得的式(XVIII)的化合物的反应通常通过首先添加邻苯二甲酸钾和催 化量的碘化钠(NaI)在溶剂例如DMF中的溶液，随后除去溶剂并添加水合肼 (N₂H₄.H₂O)在溶剂例如乙醇中的溶液。

根据另一个实施方案，式(XII)的化合物还可以通过以下制备：

-使式(XIX)的化合物：

H-PEG′-N₃   (XIX)

与式(XIV)的化合物反应：

其中Hal’为卤素原子例如Br且PEG’如式(A)中所定义，

以形成式(XX)的化合物：

随后：

-使式(XX)的化合物与三苯基膦(PPh₃)反应，生成式(XII)的化合物。

式(XIX)的化合物与式(XIV)的化合物的反应通常在存在碱例如NaH的 条件下，在有机溶剂例如DMF中进行。

式(XX)的化合物与三苯基膦(PPh₃)的反应通常在溶剂例如四氢呋喃 (THF)中进行，任选地在存在水的条件下进行。

式(XIX)的化合物可以通过取代反应随后通过脱保护反应由式(XXI)的 化合物制备：

Pg-PEG′-OH   (XXI)

其中Pg如式(IV)中所定义。

取代和脱保护反应可以如关于上述化合物(II)所述进行。

如果期望或需要，本发明的方法还可以包括在各步骤之后分离或纯化获 得的化合物的步骤，和/或顺序进行期望的步骤。

可以通过常规的方式自反应混合物回收由此制备的化合物。例如，可以 通过自反应混合物蒸馏出溶剂，或如果需要，在自反应混合物蒸馏出溶剂之 后将残留物倾入水中随后用与水不混溶的有机溶剂提取并自提取物蒸馏出 溶剂而回收化合物。此外，如果期望，可以通过多种公知的技术例如重结晶、 再沉淀或各种色谱技术尤其是柱色谱或制备薄层色谱将产品进一步纯化。

除非另有指明，否则上述方法中的起始化合物和反应物为可商购的或描 述于文献中，或可以通过文献中描述的方法制备，如以下实施例中所公开或 如本领域技术人员所公知。

必要时，本领域技术人员将理解上述方法的变化，并且所述变化也是本 发明的一部分。对于本领域技术人员而言，适当的修改和代替是显而易见的 和公知的或可容易地自科学文献获得。特别地，这样的方法可以在R.C. Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH publishers,1989中找到。

本发明的式(A)的化合物或至少包含式(A)的化合物的纳米颗粒可以用于 药剂的制备。

因此，本发明的另一个目的是药剂，其包含至少一种式(A)的化合物，任 选地为本发明的纳米颗粒的形式。

本发明的另一个目的也是药物组合物，其包含式(A)的化合物作为活性物 质，任选地为本发明的纳米颗粒的形式，具有一种或多种药学上可接受的赋形 剂。

这些药物组合物包含有效剂量的至少一种本发明的化合物(A)和至少一种 药学上可接受的赋形剂。

根据期望的药学形式和给药途径，所述赋形剂选自本领域技术人员公知的 常用的赋形剂。

在用于口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、局部(topical,local)、 气管内、鼻内、透皮、或直肠给药的本发明的药物组合物中，活性成分可以 以单一剂型的形式在与常规的药物赋形剂的共混物中给药至动物和人类。

合适的单一剂型包括口服形式例如片剂、硬或软明胶胶囊剂、散剂、颗 粒剂和口服溶液剂或混悬剂；舌下；口腔；气管内；眼内；鼻内形式；通过 吸入给药；局部；透皮；皮下；肌肉内；静脉内或动脉内形式；直肠形式和 植入物。对于局部施用，本发明的化合物可以以乳膏剂、凝胶剂、软膏剂或 洗剂的形式使用。

作为实例，片剂形式的根据本发明的化合物的单一剂型可以包括以下成 分：

在具体的情况中，较高或较低的剂量可能是适合的；这些剂量包括在本 发明的范围之内。由医师根据常规的实践通过给药途径、患者的重量和反应 确定适于各患者的剂量。

附图说明

图1图示暴露于不同密度的N₃的PLA-PEG-N₃可点击的纳米颗粒表面。 通过将适合的比例的PLA-PEG-N₃与PLA-PEG共聚物混合，可以按期望改 变纳米颗粒表面上的N₃密度。

图2图示使用不同PEG链长(更短或更长)合成的PLA-PEG可点击纳米 颗粒，以促进化学敏感性物质例如(寡核苷酸)的负载和静脉内递送。

图3图示通过将多种PLA-PEG官能化的配体共聚物以适合的比例混合 而制备的用于组合应用的多官能化的纳米颗粒(例如包含归航设备、造影剂、 刺激响应剂的纳米颗粒)。

图4表示使用表面等离子体共振实验评价PLA-PEG-叶酸纳米颗粒的受 体结合能力。图表明PLA-PEG-叶酸纳米颗粒中特定信号(共振单位，标记为 RU)相对于叶酸浓度的演化。

图5a图示PLA-PEG-叶酸纳米颗粒(■＝S1)对于过表达叶酸根受体的 KB-3-1细胞的体外细胞毒性，与PLA-PEG-OMe(◆＝S2)相比较。

图5b图示荧光PLA-PEG-茴香酰胺纳米颗粒(■＝S3)对于表达sigma受 体的PC-3细胞的体外细胞毒性，与荧光PLA-PEG-OMe纳米颗粒(◆＝S4)相 比较。

图6a图示荧光PLA-PEG-叶酸纳米颗粒(■＝S3’)和荧光PLA-PEG-OMe 纳米颗粒(◆＝S4’)对于过表达叶酸根受体的KB-3-1细胞的细胞穿透能力。

图6b图示荧光PLA-PEG-叶酸纳米颗粒(■＝S1’、S3’和S5’的平均值) 和荧光PLA-PEG-OMe纳米颗粒(◆＝S2’、S4’和S6’的平均值)对于过表达叶 酸根受体的KB-3-1细胞的细胞穿透能力。在实验前，荧光信号已相对于各 样品的荧光合理化。

实施例

以下实施例描述了本发明的一些化合物的合成。这些实施例并非意图是 限制性的而是仅用于说明本发明。实例性的化合物的数字指随后给出的表中 的那些，其说明本发明的若干化合物的化学结构和物理性质。

缩写

MTS               3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑

ACN               乙腈

N₃                叠氮化物

Bz                苄基

PyBOP             (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

CuBr              溴化铜(I)

CuSO₄             硫酸铜(II)

cHex              环己烷

Da                道尔顿

DCM               二氯甲烷

Et₂O              二乙醚

DIAD              二异丙基偶氮二羧酸酯

DMSO              二甲基亚砜

DMAP              二甲基氨基吡啶

DMF               二甲基甲酰胺

DMEM              Dulbecco氏改良Eagle氏培养基

DLS               动态光散射

EPR               增强的渗透性和保留

当量,Eq.          当量

EtOH              乙醇

AcOEt             乙酸乙酯

EDTA              乙二胺四乙酸

FBS               胎牛血清

FC                流动通道

FP-547            Fluoprobe-547

FBP               叶酸根结合蛋白

HPLC              高性能液相色谱

N₂H₄.H₂O          水合肼

HBr               氢溴酸

HCl               盐酸

IgG               免疫球蛋白G

MgSO₄             硫酸镁

MsCl              甲磺酰氯

MeOH              甲醇

Ome               甲氧基

EDC               N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐

PMDETA            N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺

DIEA              N,N-二异丙基乙胺

NP                纳米颗粒

NBS               N-溴代琥珀酰亚胺

NHS               N-羟基琥珀酰亚胺

NMR               核磁共振

Mn                数均分子量

PBS               磷酸盐缓冲盐水

PLA               聚(D,L-乳酸)

PLGA              聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)

PEG               聚(乙二醇)

PdI               多分散指数

PVA               聚(乙烯醇)

R.U.              共振单位

ROP               开环聚合

RPMI              Roswell公园纪念研究所

SEC               排阻色谱

NaN₃              叠氮化钠

NaCl              氯化钠

NaCh              胆酸钠

NaH               氢化钠

NaOH              氢氧化钠

NaI               碘化钠

Sn(Oct)₂          辛酸亚锡

SPR               表面等离子体共振

THF               四氢呋喃

Et₃N(TEA)         三乙胺

PPh₃              三苯基膦

Mw                重均分子量

实施例1：用于制备纳米颗粒的前体的制备

制备1：式(XII)的化合物的合成

1.用于合成单炔聚乙二醇的步骤(制备1A)

实验步骤：

将三甘醇(Sigma-Aldrich,5620mg,37.4mmol,1当量)溶于无水THF (50mL)中，并在干燥条件下将生成的溶液冷却至0℃。缓慢地添加氢化钠 (988mg,1.1当量)，随后滴加溴丙炔(80重量％，在甲苯中，4360μL，1.1 当量)。在惰性气氛下将反应在室温下搅拌12小时。

处理方法：

在减压下除去THF，将残留物溶于二氯甲烷(DCM)并用盐水洗涤若干 次。生成的有机层用硫酸镁(MgSO₄)干燥、过滤、在减压下浓缩、并在真空 下干燥。粗产品通过硅石柱色谱纯化(洗脱剂：环己烷(cHex)/乙酸乙酯 (AcOEt):8/2)，回收3.31g黄色油(47％产率)。

NMR表征:

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.15(d,J＝2.4Hz,2H),3.70–3.60(m, 10H),3.57–3.53(m,2H),2.70(m,1H),2.41(t,J＝2.4Hz,1H).

2.已使用两种不同的途径，通过一步或经过甲磺酸根中间产物的两步， 进行邻苯二甲酰亚胺-炔三乙二醇化合物的合成。

2a)合成邻苯二甲酰亚胺-炔三乙二醇的一步步骤(制备1B)

实验步骤：

制备1A(2000mg,10.6mmol,1当量)，在干燥条件下将邻苯二甲酰亚胺 (2345mg,1.5equiv)和三苯基膦(4179mg,1.5equiv)溶于无水THF(50mL)。 缓慢地添加二异丙基偶氮二羧酸酯(DIAD)(3.14mL,1.5当量)并在室温下 在惰性气氛下将反应搅拌48小时。

处理方法：

在减压下除去THF，将残留物溶于DCM并用盐水洗涤若干次。生成的 有机层用MgSO₄干燥，过滤，再减压下浓缩并在真空下干燥。粗产品通过 硅石柱色谱纯化(洗脱剂：cHex/AcOEt:8/2)，回收3.37g黄色油(60％产率)。

NMR表征:

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.76(dd,J＝5.4,3.1Hz,2H),7.64(dd,J＝ 5.4,3.1Hz,2H),4.08(d,J＝2.4Hz,2H),3.74(dt,J＝11.4,6.0Hz,4H),3.60– 3.50(m,8H),2.38(t,J＝2.4Hz,1H).

2b)对于邻苯二甲酰亚胺-炔三乙二醇的两步合成，首先如下合成甲磺酸 根：

甲磺酰基-炔三乙二醇的合成步骤(制备1C)

实验步骤：

在惰性气氛下，向炔三乙二醇(制备1A,4g,212mmol,1当量)在DCM (60mL)中的溶液中滴加催化量的DMAP、甲磺酰氯(3.3mL,2当量)、和三 乙胺(5.9mL,2当量)。在室温下将反应搅拌4小时。

处理方法：

溶液用盐水洗涤(50mL，三次)，随后用DCM(50mL)提取水相，合并的 有机层用MgSO₄干燥，过滤，并在减压下浓缩。

最终产物直接用于(不经表征)以下步骤。

2c)合成邻苯二甲酰亚胺-炔三乙二醇的步骤(制备1D)

实验步骤：

向甲磺酰基-炔三乙二醇(制备1C,5.1g,19.2mmol,1当量)在DMF(100 mL)中的溶液中添加邻苯二甲酸钾(7.87g,2.2当量)和催化量的碘化钠(少于 一当量，例如抹刀尖)。将溶液在80℃下搅拌过夜，并且在减压下除去溶剂。

处理方法：

生成的残留物通过硅石柱色谱纯化(洗脱剂：cHex/AcOEt:2/8至4/6)。 回收5.7g黄色油(94％收率)。

NMR表征:

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.81(dd,J＝5.5,3.0Hz,2H),7.69(dd,J＝ 5.5,3.0Hz,2H),4.13(d,J＝2.4Hz,2H),3.80(dt,J＝11.4,6.0Hz,4H),3.65– 3.56(m,8H),2.40(t,J＝2.4Hz,1H).

3)合成氨基-炔三乙二醇的步骤(制备1E)

实验步骤：

将制备1B(2034mg,6.4mmol,1当量)溶于乙醇(EtOH)(200mL)并添加 水合肼(3.1mL,10equiv)。将反应混合物在回流条件下搅拌过夜。

处理方法：

将反应冷却至室温，并将8mL浓盐酸添加至反应(pH～2-3)。通过过滤 除去沉淀物，并使用NaOH(2M)将pH升高至大于10。含水相使用DCM 提取三次。生成的有机层用MgSO₄干燥，过滤，在减压下浓缩，并在真空 下干燥。回收911mg黄色油(76％产率)。

NMR表征:

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.13(d,J＝2.4Hz,2H),3.69–3.50(m,8H), 3.43(t,J＝5.2Hz,2H),2.79(t,J＝5.2Hz,2H),2.38(t,J＝2.4Hz,1H),1.33(s, 2H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ79.64,74.53,73.47,70.59,70.40,70.25, 69.09,58.37,41.80.

制备2：式(XI)化合物的合成

1)合成茴香酰胺-炔三乙二醇的步骤(制备2A)

实验步骤：

在惰性气氛下，向制备1E(200mg,1.07mmol,1当量)在DCM(20mL) 中的溶液添加PyBOP(780mg,1.4当量)、p-甲氧基苯甲酸(229mg,1.4当 量)和DIEA(260μL,1.4当量)。将反应在室温下搅拌过夜。

处理方法：

溶液用盐水洗涤(20mL，三次)，随后用DCM(20mL)提取水相，合并的 有机层用硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩。粗产物通过硅石柱色谱纯化 (洗脱剂：cHex/AcOEt:5/5至7/3)，回收300mg黄色油(90％产率)。

NMR表征:

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.74(d,J＝8.8Hz,2H),6.87(d,J＝8.9Hz, 2H),6.84(宽,1H),4.14(d,J＝2.4Hz,2H),3.81(s,3H),3.71–3.53(m,12H), 2.42(t,J＝2.4Hz,1H).

2)合成叶酸-炔三乙二醇的步骤(制备2B)

实验步骤：

在惰性气氛下，向制备1E(319mg,1.70mmol,1当量)在DMF(70mL) 中的溶液添加EDC(393mg,1.2当量)、NHS(236mg,1.2当量)和少数几滴 三乙胺(Et₃N)。将反应在50℃下加热并将叶酸(Sigma-Aldrich,754mg,1当 量)添加至反应混合物。随后将反应在50℃下搅拌过夜。

处理方法：

将溶液在减压下浓缩。残留物在DCM和丙酮中沉淀，过滤，并在真空 下干燥。

将获得的产物在反向柱(C18,Kromasil 10μm,4.6x250mm)上分析，例如 在乙酸铵缓冲液(调节至pH 5)中使用5-95％乙腈梯度，20mM，20分钟，随 后使用95％乙腈，持续5分钟。

将产物溶解于20％DMF在洗脱剂中的溶液中。在100mm柱中装填的 Kromasil C1810μm(1.5kg相)上进行纯化，并在85％乙酸铵缓冲液(pH 5, 20mM)和15％乙腈中洗脱。

与DMF进样峰同时洗脱出200mg粗产物。

纯化方法(化合物B):

通过将200mg粗产物溶解，使用具有反相柱Waters XBridge C18(30x100 mm),5μm的制备色谱完成最终纯化。

首先将产物溶于DMSO(5mL)和5mL缓冲溶液(10mM碳酸铵，用28％ 氨的水溶液调节至pH9.3)。

在12分钟内，以30mL/分的速率，使用95：5(缓冲溶液(碳酸铵)/乙腈) 至5：95的梯度完成1ml的10次进样。

NMR表征(化合物B):

¹H NMR(400MHz,DMSO,d₆)δ12.0-11.0(宽s,1H),8.61(s,1H),8.29 (宽s,1H),7.8(t,J＝6.1Hz,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.03(宽s,2H),6.85 (宽t,J＝6.3Hz,1H),6.62(d,J＝8.2Hz,2H),4.44(d,J＝6.5Hz,2H),4.31(m, 1H),4.12(d,J＝2.2Hz,2H),3.57–3.36(m,11H),3.35–3.1(m,2H),2.23(t,J ＝7.2Hz,2H),1,91(m,2H)LCMS表征:

611[M+H]⁺

3)合成FP547-炔三乙二醇的步骤(制备2C)

实验步骤：

向FP-547-NHS(Interchim,2.5mg,2.55μmol,1当量)在DMSO(356μL) 中的溶液添加含EDC(0.49mg,1当量)、NHS(0.29,1当量)、TEA(0.35μL, 1当量)和制备1E(1.07mg,2.2当量)的DMSO(92μL)溶液。

在室温下，将溶液在黑暗中搅拌12小时。

处理方法：

将反应在减压下浓缩，溶于DCM，且用盐水提取。获得粉色油。

紫外/可见光(UV/Vis)和荧光光谱表征:

获得的谱图与荧光团化合物的商业来源提供的谱图相似。

制备3：式(II)的化合物的合成

1)合成苄氧基-叠氮化物PEG2500的步骤(制备3A)

实验步骤：

在20分钟内向PEG2500-苄基(Polymer Source,M_n＝2572g.mol^-1,2.43g, 0.94mmol,1当量)、DMAP(58mg,0.5当量)和TEA(747μL,5.6当量)在 DCM(65mL)中的溶液(冷却至0℃)缓慢地添加MsCl(326μL,4.4当量)。将 反应在室温下搅拌过夜，并在减压下浓缩。将残留物溶解于DMF(20mL) 中，并将叠氮化钠(330mg,5.3当量)添加至溶液。将反应在50℃下搅拌24 小时。

处理方法：

将反应在减压下浓缩，将残留物溶于DCM(50mL)，并用盐水洗涤 (50mL，三次)。有机层用MgSO₄干燥，过滤，并在减压下浓缩至尽可能小 体积的DCM。将后者在二乙醚中沉淀。获得2.16g白色粉末。

NMR表征:

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.30–7.05(m,5H),4.43(s,2H),3.93–3.03 (m,222H),3.27(t,2H).

2)合成叠氮PEG2500的方法(制备3B)

实验步骤：

将制备3A(2.16g,0.83mmol,1当量)溶于浓HCl(20mL)，并在室温下 搅拌2天。

处理方法：

使用浓NaOH溶液将溶液碱化至pH 1。含水相用DCM提取(50mL，四 次)，将合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩至尽可能小体 积的DCM。将后者在二乙醚中沉淀。获得1.89g白色粉末。

NMR表征:

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ3.73–3.33(m,222H),3.27(t,J＝5.0Hz, 2H),2.75(s,1H).

3)合成苄氧基-溴PEG2100的步骤(制备3C)

实验步骤：

向根据Nicolas等Macromol 2008,41,8418制备的PEG2100-苄基(M_n＝ 2176g.mol^-1,500mg,0.23mmol,1当量)和NBS(50mg,1.2当量)的混合物 中添加三苯基膦(PPh3)(75mg,1.2当量)在DCM(50mL)中的冷溶液。随后 将反应在室温下搅拌过夜。

处理方法：

在减压下将反应浓缩至25mL并用己烷(100mL)稀释。通过过滤除去沉 淀(三苯基氧化膦)，并在二乙醚(200mL)中将聚合物沉淀两次。

NMR表征:

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.30–7.16(m,5H),4.50(s,2H),3.85–3.15 (m,188H)

4)合成溴PEG2100的步骤(制备3D)

实验步骤：

将制备3C(500mg,0.22mmol,1当量)溶于浓HBr(20mL)，并在室温下 搅拌2天。

处理方法：

使用浓NaOH溶液将溶液碱化至pH1。含水相用DCM提取(50mL，四 次)，将合并的有机层用MgSO₄干燥，过滤，并在减压下浓缩至尽可能小体 积的DCM。将后者在二乙醚中沉淀以获得粉末形式。

NMR表征:

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.82–3.13(m,188H),2.79(s,1H)

制备4：式(I)化合物的合成

已使用2种不同的途径合成式(I)的化合物。第一种(4A)为通过一步合 成且第二种(4B)为通过两步合成。

制备4A:通过开环聚合(ROP)合成嵌段共聚物PLA-PEG-N₃

m为PLA单元的数目

实验步骤：

在干燥条件下，向叠氮基-聚(乙二醇)(3B,M_n＝2507g.mol^-1,293mg, 0.12mmol)和D,L-丙交酯(7,01g,48.62mmol)的混合物添加Sn(Oct)₂(18.7mg, 46.1μmol)在无水甲苯(11.2mL)中的溶液。通过鼓泡氩气，持续20分钟，将 反应混合物脱气，随后在惰性气氛下在120℃下在预加热的油浴中搅拌90 分钟。在约55％转化时停止反应。

处理方法：

在减压下除去甲苯，并将获得的产物溶解于尽可能小量的DCM，并进 一步用二乙醚沉淀。随后将沉淀溶解于尽可能小量的THF，并且进一步在水 中沉淀，并随后冷冻干燥整夜以获得白色粉末。

NMR表征:

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.41–4.83(m,456H),4.38–4.15(m,3H), 3.84–3.40(m,220H),3.36(t,J＝4.8Hz,2H),1.82–1.21(m,1372H).

表1:

Mn＝通过NMR测定的数均分子量

理论:100％转化时

NB:已合成和使用不同批次的制备4A聚合物

各批次的m值不同。m通常在180和250之间。

制备4B(1):通过开环聚合(ROP)合成嵌段共聚物PLA-PEG-Br

m为PLA单元的数目

实验步骤：

在干燥的条件下，向溴-聚(乙二醇)(3D,M_n＝2149g.mol^-1,49mg,22.8 μmol)和D,L-丙交酯(0.72g,4.97mmol)的混合物添加Sn(Oct)₂(1mg,2.5 μmol)。反应混合物用氩脱气20分钟，并随后在惰性气氛下在120℃下在 预加热的油浴中在本体条件下搅拌20小时。完全转化时停止反应。

处理方法：

将获得的产物溶解于尽可能小量的DCM，并进一步在二乙醚中沉淀。 随后将沉淀溶解于尽可能小量的THF，并且进一步在水中沉淀，并随后冷冻 干燥整夜，以获得白色粉末。

表2:

Mn＝通过NMR测定的数均分子量

理论：100％转化时

m＝(通过NMR测定的实验Mn–PEG-Br的Mn)/丙交酯单体的MW＝ (34120-2100)/144＝222

NB:各批次的m值不同。m通常在100和300之间，更特别地在180 和250之间。

制备4B(2):合成叠氮化物-PEG2100-PLA的步骤

m如上表中所定义。

实验步骤：

在惰性条件下，向制备4B(1)(200mg,5.9μmol,1当量)在DMF(10mL) 中的溶液添加叠氮化钠(20mg,54当量)。随后在惰性气氛下将反应在50℃ 下搅拌3天。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.42–4.83(m,440H),4.38–4.11(m,3H), 3.83–3.40(m,192H),3.35(t,J＝4.8Hz,2H),1.73–1.31(m,1320H).

处理方法：

将溶液在减压下浓缩，并将残留物溶解于尽可能小量的THF。随后将后 者在水中沉淀。

制备5：式(A)化合物的合成

用于有机条件下的Huisgen反应的典型步骤

m为PLA单元的数目，各批次不同。

最优化的实验步骤的实例：

使用注射器，向先前脱气的根据制备4A所述的方法制备的式(I) PLA-PEG-N₃的化合物(200mg，摩尔量取决于批次，在代表性的情况中：6.7 μmol,1当量)和式(XI)的炔衍生物(0,12mmol,18当量)在无水DMF(2.5mL) 中的溶液添加脱气的CuBr(5.8mg,6.1当量)和PMDETA(16.8μL,17.8当 量)在无水DMF(400μL)中的溶液。在惰性气氛下，在50℃下，将反应混合 物搅拌15小时。将相同的方法学用于所有制备。

最优化的处理方法的实例：

将溶液在减压下浓缩，并将残留物溶于尽可能少量的THF，并且进一步 在水中沉淀。将沉淀冷冻干燥，再次溶解于尽可能少量的THF中，并且进 一步在水中沉淀。将沉淀冷冻干燥以获得白色粉末。

如果炔衍生物不溶于水，则可以通过将第一冷冻干燥的沉淀溶于尽可能 少量的DCM并进一步在二乙醚中沉淀而增加中间步骤。

最后的步骤应为THF在水中析出。此外，如果之后一些起始原料残余， 则可以增加纯化步骤。在制备式(A)的化合物中，所有的制备使用相同的方 法学(参见下表3)。

表3：

(*)在制备2B的化合物A和B的混合物上进行的反应

Mn*：通过NMR测定的数均分子量

Copo：PLA-PEG-N₃

Eq:当量

PLA-PEG-三唑-PEG′-茴香酰胺的NMR表征

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.31(m大,1H),8.02(s,1H),7.81(d,J＝ 8.1Hz,2H),6.98(d,J＝8.1Hz,2H),4.97–5.48(m,389H),4.50(s大,4H), 4.10–4.26(m,3H),3.80(s大,5H),3.30–3.67(m,198H),1.28–1.62(m, 1164H)

产率:90％

制备6：式(I’)化合物的合成

通过开环聚合(ROP)合成嵌段共聚物PLA-PEG-OMe的步骤

m为PLA单元的数目

实验步骤：

在干燥的条件下，向甲氧基聚(乙二醇)(Sigma-Aldrich,M_n＝2012g.mol^-1, 245mg,0.12mmol)和D,L-丙交酯(7,01g,48.62mmol)的混合物添加Sn(Oct)₂(18.7mg,46.1μmol)在无水甲苯(11.2mL)中的溶液。通过鼓泡氩气，持续20 分钟，将反应混合物脱气，随后在惰性气氛下，在120℃下，在预加热的油 浴中搅拌30分钟。在约54.2％转化时停止反应。

处理方法：

在减压下除去甲苯，将获得的产物溶于尽可能小量的DCM，并进一步 在二乙醚中沉淀。随后将沉淀溶于尽可能小量的THF，并进一步在水中沉淀， 并随后冷冻干燥过夜以获得白色粉末。

NMR表征:

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.34–4.85(m,434H),4.40–4.17(m,3H), 3.86–3.41(m,178H),3.36(s,3H),1.77–1.19(m,1302H).

表4:

Mn＝通过NMR测定的数均分子量

理论：100％转化时

实施例2：纳米颗粒形成

根据以下方案并通过使用下表中列举的组分和量制备纳米颗粒。

通用方案

1-将共聚物或共聚物的混合物溶于有机溶剂(最终的含水聚合物的浓 度在1-40mg/mL之间变化)。

2-将有机相与含稳定剂(浓度在0.1％-1％w/v之间变化)的含水相混合 (含水相/有机相体积比例在2.5至5之间变化)。对于使用乳化和体积减小技 术的纳米颗粒的制备，使用涡旋振荡器将混合物剧烈振荡1分钟以获得乳 液。将所述乳液超声(使用探针，时间在1-10分钟变化)。

3-通过蒸发除去有机相(在减压或气流下)。

4-将纳米颗粒在30000g下超速离心30分钟。

5-将纳米颗粒再悬浮于含水介质中。

6-将纳米颗粒用1μm玻璃滤片(Acrodisc)过滤。

7-在使用前将纳米颗粒在4℃下储存。

作为实例，使用以下方案，其中将1,2ml AcOEt用作有机溶剂(参见下表6中最后3个实例)

1-将共聚物或共聚物的混合物(总质量：30mg)溶解于AcOEt(1.2mL) 中。

2-将有机相添加至3.3mL含1％Pluronic F68的含水相。

3-使用涡旋振荡器将混合物剧烈振荡1分钟。

4-将乳液超声(使用探针)3分钟。

5-使用旋转蒸发器在减压下除去有机相。

6-将纳米颗粒在30000g下超速离心30分钟。

7-将纳米颗粒再悬浮于3mL pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

8-将纳米颗粒用1μm玻璃滤片(Acrodisc)过滤。

9-在使用前将纳米颗粒在4℃下储存。

纳米颗粒使用DLS(动态光散射)和获自Malvern的仪器(Zetasizer Nano  ZS)表征。下表中提及的各共聚物具有30000Da和35000Da之间的平均分子 量。