一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法

摘要

本发明公开了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，其步骤：1）提取待测鳜鱼（翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代）样品的基因组DNA；2）以提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）扩增出DNA目的片段，用于PCR的一对微卫星引物序列为：引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’，引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’；3）PCR产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行银染色，拍照记录电泳结果；4）与标准酶切片段的图谱进行比对，读出待测鳜鱼样品的目的条带所处的位置，分别鉴定为翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代。方法易行，操作简便，弥补了形态学鉴定的不足，解决了水产养殖中杂交鳜（翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代）鉴定难和种质混杂的问题。

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖中鱼种鉴定技术领域，具体涉及一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子 一代的分子鉴定方法。

背景技术

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi Basilewsky)和斑鳜(Siniperca scherzeri Steindachner)同隶属于 鲈形目、鳜亚科、鳜属，鳜亚科自然仅分布于东亚（中国、朝鲜、韩国、日本、越南（红河）） 和俄罗斯远东地区。翘嘴鳜和斑鳜肉味鲜美、营养丰富、无肌间刺，且市场价格高，出口需 求大，是我国传统的淡水养殖名贵鱼类。翘嘴鳜体型大、生长快，但抗病力较弱；斑鳜易驯 食、抗逆性强，但生长慢、养殖周期长。通过杂交获得翘嘴鳜和斑鳜的杂交子代，杂交子代 表现出较好的养殖性能及生长性能，在杂交子代的基础上继续进行人工选择、定向交配，培 育出生长快、易驯食、抗逆性强的优良品种。翘嘴鳜、斑鳜和杂交子代形态相似，在育种过 程中特别是育苗阶段和亲本选择阶段，传统的形态学鉴别方法很难准确辨别纯种和杂交种， 因此容易造成种质混杂。

微卫星又称为简单重复序列，均匀分布于真核生物的基因组中，由2-6个核苷酸的串联 重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星 具有等位基因数目多、重复性好、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于物种鉴定和基因定位 等方面的研究。目前在翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的鉴别方面，学者们已经开发了能鉴别 翘嘴鳜与斑鳜的微卫星引物序列，但是目前还没有采用微卫星分子鉴定法进行翘嘴鳜、斑鳜 及其杂交子一代鉴定的相关报道。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，方法 易行，弥补了形态学鉴定的不足，解决了水产养殖中杂交鳜（翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代） 鉴定难和种质混杂的问题。操作简便，能快速、准确鉴别翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代，在 鳜类种质鉴定和保护、遗传育种和养殖生产中有极大的应用价值。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，包括以下步骤：

1）基因组DNA的提取：采集待测鳜鱼（翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代）样品（采样 后立即保存在无水乙醇中，以保证DNA不降解，鳜鱼已死亡）的鳍条或者肌肉组织，提取 基因组DNA并测定其纯度和浓度，该步骤中测得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.80-1.95；

2）DNA目的片段的扩增：以步骤1）提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合 酶链式反应（PCR）扩增出DNA目的片段，用于PCR的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’;

3）PCR产物的电泳及银染色鉴定：对PCR产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电 泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果，该步骤中采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶。

4）与标准图谱进行对比：与标准酶切片段比对，读出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的 目的条带所处的位置。样品在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带， 则鉴定为翘嘴鳜；样品在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴 定为斑鳜；样品在靠近标准酶切片段的105bp位置和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条 带，则鉴定为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。

所述2）步骤中测得DNA的浓度范围为579.3-3122.9ng/μl。

所述2）步骤中PCR反应体系为：

所述2）步骤中PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃ 变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后再72℃延伸10min，反应结束后于4℃中 保存。

本发明还提供了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定试剂盒，包括一对微 卫星引物和标准图谱，其中用于PCR的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’.

本发明提供了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法。其特征是分子鉴 定方法包括以下步骤：基因组DNA的提取、DNA目的片段的扩增、PCR产物的电泳及银 染色鉴定。方法中还包括一对特异微卫星引物和标准图谱。本发明的分子鉴定法能快速、有 效地鉴别出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代，具有客观、快速、准确、经济的优点，而且对于 种质鉴定、种质资源保护、遗传育种和亲缘鉴定有着重要意义。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明采用微卫星标记技术对翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代进行鉴别，其反应稳定，重 复性好，具有广泛的适用性，与传统的形态学鉴定相比具有检测准确性高的优点。本发明通 过一个微卫星位点、进行一次PCR鉴别出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代，减少了检测时间 和降低了检测成本。有较高的产业化前景，实际操作性强，简便、准确，价格适中。

附图说明

图1为一种扩增的翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的微卫星带谱。

M为DNA分子量标记，翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代扩增出三种不同的DNA带型： 第一种带型为翘嘴鳜，在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带；第二 种带型为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代，在靠近标准酶切片段的105bp位置和120bp位置各扩 增出1条特异性DNA条带；第三种带型为斑鳜，在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1 条特异性DNA条带。根据DNA带型的不同即可鉴别出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代。

图2为翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代、翘嘴鳜子代和斑鳜子代的微卫星扩增带谱。

M为DNA分子量标记，读带标准同图1。图2中左边的带型为斑鳜，中间的带型为翘嘴 鳜，右边的带型为杂交子一代、翘嘴鳜子代和斑鳜子代。由读带标准对图2样本进行判断： 在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带的样本是1、7，判断为斑鳜子 代；在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带的样本是5、6、9、10、 11，判断为翘嘴鳜子代；在靠近标准酶切片段的105bp位置和120bp位置各扩增出1条特异性 DNA条带的样本是2、3、4、8、12，判断为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。

具体实施方式

现结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，其步骤是：

1.基因组DNA的提取：

从每尾鱼剪取鳍条组织约0.5mg，按照天根生化科技(北京)有限公司生产的血液、细胞、 组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）所示方法和步骤提取基因组DNA，并用紫外分 光光度计检测DNA浓度，浓度为1.5%的琼脂糖凝胶检测DNA纯度。

2.DNA目的片段的扩增：

即进行PCR。

1）用于PCR反应的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’.

2）PCR反应体系如下：

混匀后短暂离心。

3）PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s， 55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后再72℃延伸10min，反应结束后于4℃中保存。

3.PCR产物的电泳及银染色鉴定：

1）制胶：8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶。

2）电泳：每个产物上样3ul（含1ul上样缓冲液、2ul PCR反应产物），同时点上标准酶 切片段作为标准图谱以便比对。用1×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳约1h40min至蓝色染 料到达凝胶底端时终止。

3）银染色鉴定：染色过程如下：拆板后将凝胶放于双蒸水中水洗两次，然后用浓度为 0.1%的硝酸银（AgNO₃）染色10min，再用双蒸水漂洗两次，每次约15s，接着用浓度为2% 的氢氧化钠（NaOH）、浓度为0.04%的无水碳酸钠（Na₂CO₃）和体积比为0.4%的无水甲醛混 合配成的显影液显影约10min，实际以刚能看到黑色条带就停止显影，自来水终止显影以防 显影过分造成凝胶全部变黑影响读带，最后在凝胶成像系统中进行成像拍照并保存电泳结果。

4）电泳图谱显示:与标准酶切片段比对，分别读出翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代的目的条 带所处的位置。如样品在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴 定为翘嘴鳜；如样品在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定 为斑鳜；如样品在靠近标准酶切片段的105bp和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带， 则鉴定为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。

相关结果请见图1。

实施例2：

一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法的验证实例，其步骤是：

1.样本来源和基因组DNA的提取：

鳜鱼33尾（翘嘴鳜亲本11尾，斑鳜亲本10尾，翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代、翘嘴鳜子代、 斑鳜子代共计12尾）从广东清远宇顺农牧渔业科技服务有限公司渔场采得。从每尾鱼剪取鳍 条组织约0.5mg，按照天根生化科技(北京)有限公司生产的血液、细胞、组织基因组DNA提 取试剂盒（离心柱型）所示方法和步骤提取基因组DNA，并用紫外分光光度计检测DNA 浓度，浓度为1.5%的琼脂糖凝胶检测DNA纯度。

2.DNA目的片段的扩增：

即进行PCR。

1）用于PCR反应的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’.

2）PCR反应体系如下：

混匀后短暂离心。

3）PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s， 55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后再72℃延伸10min，反应结束后于4℃中保存。

3.PCR产物的电泳及银染色鉴定：

1）制胶：8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶。

2）电泳：每个产物上样3ul（含1ul上样缓冲液、2ul PCR反应产物），同时点上标准酶 切片段作为标准图谱以便比对。用1×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳约1h40min至蓝色染 料到达凝胶底端时终止。

3）银染色鉴定：染色过程如下：拆板后将凝胶放于双蒸水中水洗两次，然后用浓度为 0.1%的硝酸银（AgNO₃）染色10min，再用双蒸水漂洗两次，每次约15s，接着用浓度为2% 的氢氧化钠（NaOH）、浓度为0.04%的无水碳酸钠（Na₂CO₃）和体积比为0.4%的无水甲醛混 合配成的显影液显影约10min，实际以刚能看到黑色条带就停止显影，自来水终止显影以防 显影过分造成凝胶全部变黑影响读带，最后在凝胶成像系统中进行成像拍照并保存电泳结果。

4）电泳图谱显示:与标准酶切片段比对，分别读出翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代的目的条 带所处的位置。如样品在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴 定为翘嘴鳜；如样品在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定 为斑鳜；如样品在靠近标准酶切片段的105bp和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带， 则鉴定为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。由图2可知：样本1、7为斑鳜子代；样本5、6、9、10、 11为翘嘴鳜子代；样本2、3、4、8、12为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。

相关结果请见图2。

结合附图和具体实施例可知：

传统的形态学鉴定很难将翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代一一鉴别出来，现有微卫星技术只能 鉴别出翘嘴鳜和斑鳜，而采用本发明的检测试剂盒和鉴别技术，只需要通过一次PCR鉴别 反应就能对翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代进行鉴别，并且反应稳定、重复性好、检测准确性 高，并且检测时间减少了40％以上。检测成本降低了50％以上。