评估大气细颗粒物暴露对生物体毒性作用的标志物和方法

摘要

本发明涉及一种评估大气细颗粒物暴露对生物体毒性作用的标志物及方法，所述标志物包括二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇、硬脂酰磷脂酰胆碱、亚麻酰基甘油基-3-磷酸胆碱、亚麻酰基甘油基-4-磷酸胆碱、棕榈酰胺、缬氨酸、胞嘧啶中的一种或几种，本发明能够更全面、综合地体现大气细颗粒物暴露引起生物体代谢产物的变化状况，适用于大气细颗粒物暴露毒性作用的评估。

说明书

技术领域

本发明涉及评估大气细颗粒物暴露对生物体毒性作用的标志物及方法， 属于大气细颗粒物毒性的检测领域。

背景技术

在我国，大气细颗粒物(PM2.5)污染是排名第4的健康危险因素，前3 位分别是高血压、吸烟和不良饮食习惯。细颗粒物PM2.5是指大气中空气动 力学直径小于2.5μm的悬浮颗粒物，与较粗的大气颗粒物相比，PM2.5粒 径小，比表面积大，吸附有更多有害物质，且在大气中停留时间长、输送距 离远，更易进入肺泡并留存在肺部深处不易被人体排出，因而对大气环境质 量和人体健康的影响更大。据美国国家航空暨太空总署在2010年9月公布 的全球PM2.5污染浓度地图显示，我国尤其是华北、华东和华中地区是污染 的重灾区。

PM2.5影响呼吸和心血管系统的相关研究已被广泛报道，其对内分泌系 统的干扰是当前新的研究热点。最近的流行病学研究表明，长期的PM2.5暴 露是肥胖和糖尿病高发的重要贡献因子。PM2.5颗粒表面附着重金属、多环 芳烃、挥发性有机物等有害物质，其中很多组分都具有内分泌和代谢干扰 效应。PM2.5暴露导致人体内分泌和代谢紊乱，这种紊乱可能诱发肥胖和糖 尿病等疾病。PM2.5附着的细菌、病毒、重金属、酸性氧化物和有机污染物 对人体的损伤程度有很大差异，依照目前的通行方法，无法准确评价PM2.5 对人体的有害程度。

大量证据证明了大气颗粒物确实会对内分泌系统产生干扰作用，而对这 种干扰效应进行评估具有重要的意义。内分泌系统的紊乱会导致代谢异常， 从而诱发多种内分泌代谢性疾病。内分泌和代谢控制过程存在复杂的交叉路 径，这需要发展更加高通量、准确而有效的手段来评价污染物的干扰效应。 而且，PM2.5细颗粒除了含有重金属、多环芳烃、发挥性有机物等成分外， 还含有有机碳、元素碳等成分，因此PM2.5的干扰效应不同于单一污染物， 对生物体代谢系统的影响非常复杂，现有的生物理论和方法在分析通量方面 暴露出较大的局限性。

环境污染物暴露引起的生物体的基因组和表观基因的改变，必然会影响 蛋白质的表达，最终在终端代谢物的层面进一步放大。代谢组学是新兴的组 学技术，通过对生物体在特定毒物刺激下所有代谢物同时进行定性和定量测 定，对整体代谢轮廓进行模式识别，从而进行毒性效应评价，以及揭示毒性 作用的靶器官和组织、毒性作用过程。高通量的代谢组学技术可以从整体水 平上发现PM2.5暴露后代谢物的变化规律，从而对其干扰效应进行研究，并 且可以筛选出特征代谢物作为暴露效应标志物用于健康风险评估。与基因和 蛋白质相比，代谢物简单易得，与传统的毒理学效应的终点紧密联系，作为 暴露效应标志物具有得天独厚的优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供评估大气细颗粒物暴露对生物体毒 性作用的标志物及方法，本发明能够更全面、综合地体现大气细颗粒物暴露 引起生物体代谢产物的变化状况，适用于大气细颗粒物暴露毒性作用程度的 评估。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：评估大气细颗粒物暴露对生 物体毒性作用的标志物，所述标志物包括二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇、硬脂酰 磷脂酰胆碱、亚麻酰基甘油基-3-磷酸胆碱、亚麻酰基甘油基-4-磷酸胆碱、 棕榈酰胺、缬氨酸、胞嘧啶中的一种或几种。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：评估大气细颗粒物暴露对生 物体毒性作用的方法，包括：

取200μL受试者血清，加入3倍体积的纯甲醇，剧烈震荡5分钟，静 置5分钟，离心15分钟，将清液转移到离心管中，对其浓缩至全干，加入 200μL纯甲醇溶解，通过液相色谱-质谱联用技术，检测受试者血清的总指 纹图谱，计算出受试者血清中至少一种标志物的归一化面积，将结果与所对 应的标志物的参考水平比较，差异指示大气细颗粒物暴露是否对受试者产生 毒性作用，

其中，所述标志物包括二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇、硬脂酰磷脂酰胆碱(又 名溶血卵磷脂(18:0))、亚麻酰基甘油基-3-磷酸胆碱(又名溶血卵磷脂 (18:3))、亚麻酰基甘油基-4-磷酸胆碱(又名溶血卵磷脂(18:4))、棕榈 酰胺、缬氨酸、胞嘧啶中的一种或几种，

所述参考水平指未暴露于PM2.5的受试者血清中的标志物在血清总指纹 谱图中的归一化面积，二氢鞘氨醇参考水平为0.5-1％，植物鞘氨醇参考水平 为1-1.4％，硬脂酰磷脂酰胆碱参考水平为1-2％，亚麻酰基甘油基-3-磷酸胆 碱参考水平为0.2-0.3％，亚麻酰基甘油基-4-磷酸胆碱参考水平为0.5-1％， 棕榈酰胺参考水平为0.8-1.1％，缬氨酸参考水平为0.5-0.9％，胞嘧啶参考 水平为0.3-0.5％。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述受试者为哺乳动物。

进一步，所述离心力为12000g。

本发明还公开了一种筛选评估大气细颗粒物对生物体毒性作用的标志 物的方法，包括：

(a)通过液相色谱-质谱联用技术测定大气细颗粒物暴露人群血清样品 中所有检测到的代谢物的相对浓度水平，作为检测组；

通过液相色谱-质谱联用技术测定未暴露于大气细颗粒物的人群血清中 所有检测到的代谢物的相对浓度水平，作为对照组；

(b)结合化学计量学方法筛选合适的表征毒性的标志物：具体流程为 利用正交偏最小方差判别分析法针对训练集样本建立模型，采用变量的VIP 得分作为筛选潜在标志物的扩展集的一个重要因素，VIP得分大于1.5的变 量在此步骤中被选中，然后，采用非参数检验作为最终程序，排除p值大于 0.05的变量。

(c)将检测组和对照组血清样品中的所有检测到的代谢物的相对浓度水 平一一对应进行比较，显示差异的代谢物被鉴定为指示大气细颗粒物暴露毒 性作用的标志物。

本发明公开了评估大气细颗粒物暴露对生物体毒性作用的方法，涉及血 清样品的分析性测试。在一些方面中，包含了用于评估大气细颗粒物暴露毒 性作用的标志物，包含用于鉴定和检测标志物的方法。

本发明作为一种评估手段，实现对大气细颗粒物暴露毒性作用的简单和 准确判断。具体有益效果如下：

(1)检测所需样品为血清，获取方便，避免了机体损伤、射线成像等 有害复杂的过程；

(2)作为一种新型的评估方法，准确反映大气细颗粒物暴露对机体造 成的实际毒性作用。

(3)本发明实现更全面、综合地体现大气细颗粒物暴露引起生物体代 谢产物的变化状况，适用于大气细颗粒物暴露毒性作用程度评估。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。

实施例

样品收集

本申请收集了两类人群的血清样本，第一类人群(n＝230)生活在pm2.5 严重污染的地区(每年有240天pm2.5浓度>150μg/m³)，第二类人群(n＝210) 生活在pm2.5污染较低(每年有10天pm2.5浓度>25μg/m³)的地区。每个 人群中80％的随机样本(第一类人群n＝184；第二类人群n＝168)建立统计学 模型，剩余的20％样本(第一类人群n＝46；第二类人群n＝42)作为验证样本。

UPLC-oa-TOF-MS条件

血清代谢图谱通过Ultimate-3000液相色谱仪与MicrOTOF-Q II-四级 杆飞行时间质谱联用系统获得。反相分离使用的是填料孔径为2.1×100mm 1.7μm的Phenomenex C18色谱柱，柱温维持在35℃，进样体积为5μL。 流动相为(A)0.1％的甲酸水溶液和(B)0.1％的甲酸乙腈溶液的混合液，洗 脱梯度如下：在1-16分钟内，流动相B体积分数由5％上升到100％，在16-20 分钟时流动相B为100％并保持4分钟，再在0.1分钟内下降至5％，最终流 动相B体积分数在5％维持3分钟。流动相流速为400μL/min。质谱仪在 正离子，ESI扫描模式下运行，扫描范围为50到1000m/z。数据在centroid 模式下收集。毛细管电压和端板偏移电位分别设置为4500V和-500V。喷 雾气压设置为0.6bar，干气流量为6L/min，温度为200℃。利用二级质谱 实验进一步潜在的标志物。碰撞气为氩气，对于每一个标志物，碰撞能均为 30eV。

数据分析

对所有采集到的色谱图进行峰对齐、背景噪音去除和保留时间-分子量 离子对的提取。20％变量缺失的样品舍弃，然后导入SIMCA-P v12软件经过 归一化和Pareto模式化后，进行多元数据分析。利用正交偏最小方差判别 分析法针对训练集样本建立模型，对大气细颗粒物暴露组和对照组进行区别 并筛选标志物，并用非参数检验法进一步证实，P值小于0.05则认为具有统 计学上的差异显著性。

标志物鉴定

使用DataAnalysis 4.0软件拟合标志物的可能分子式，并将结构信息 提交Human Urine Metabolome Database(HMDB)数据库检索，对候选标志物 进行二级质谱分析，最终通过与商品化的标准品进行比较，以最终确认标志 物。

统计分析

使用SPSS Statistics 18软件(SPSS Inc.)进行统计分析。采用 Kruskal-Wallis检验法删选代谢物在三个剂量组中有显著变化的潜在标志 物。采用Wilcoxon符号秩检验法比较大气细颗粒物暴露组和对照组之间的 标志物水平，p值小于0.05指示差异显著性。

标志物的筛选

采用有监督的OPLS-DA最大化病例组和对照组之间的代谢图谱差异。选 择对两组之间的分类贡献最大的变量作为潜在的标志物。首先，采用变量的 VIP得分作为筛选潜在标志物的扩展集的一个重要因素。VIP得分大于1.5 的变量在此步骤中被选中。然后，采用非参数检验作为最终程序，排除p值 大于0.05的变量。

进一步应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic  curve，简称ROC曲线)进行对这些标志物在临床上的诊断性能进行了评估。 曲线下面积(area under curve)是ROC模型中的重要参数，该指标表征标志 物的诊断性能，一般而言，AUC>0.75表示该指标具有良好的诊断能力。如表 1所示，所有的标志物的AUC值均高于0.75，表示它们都对大气颗粒物暴露 的健康效应具有良好的评价性能。

表1 标志物

^a VIP来自于OPLS-DA模型，阈值为1.5。

^b P值通过非参数检验计算得到。

^c变化倍数大于1指示该标志物在病例组中的浓度相对较高，而小于1指示该标志物浓度 相对较低于对照组。

^d曲线下面积(area under curve)。

模型的验证

我们使用验证样本(第一类人群n＝46；第二类人群n＝42)对所建立的 模型和标志物进行验证，发现90％以上的样本均能够获得正确的区分。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。