一种真菌菌株AS-3及其在治理重金属污染土壤中的应用

摘要

本发明涉及一种高耐受砷并提高土壤有效态砷含量的真菌菌种AS-3及其在治理重金属污染土壤中的应用，本发明的真菌菌株AS-3分类学命名为Chaetomium？globosum。本发明的真菌菌株AS-3作为微生物吸附剂，能够高耐受砷，同时对土壤有效态砷浓度具有提高作用，可以配合砷超富集植物联合使用，以达到对砷污染的土壤进行联合修复治理的效果，具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种真菌菌株及其应用，尤其涉及一种高耐受砷并提高土壤有效态砷含量的真菌菌种AS-3及其在治理重金属污染土壤中的应用。

背景技术

砷是环境中最重要的污染物之一，具有极强的生物毒性以及致癌致畸危害。世界卫生组织建议人体对砷的平均摄入量不超过0.3μg·kg^-1d^-1，同时饮用水中砷的最大允许限量值由原来的50μg/L下调至10μg/L。砷的来源主要分为自然来源(包括自然界中的水浸取、植物吸收、火山活动)和人为来源(包括金属生产、采矿、冶金、燃煤、化工等活动)，而其中人为来源是环境中主要的砷污染源。有报道称砷黄铁矿型难浸金矿的硝酸催化氧化过程中80％～95％的砷进入溶液，使氧化浸出溶液中的砷高达15～30g/L；另有报道显示湖南省石门县雄黄矿附近的农田土壤中砷含量范围为85～814mg/kg，郴州市砷污染区域的农田土壤中砷含量也高达300mg/kg左右，我国土壤中砷的背景值仅为11.2mg/kg；矿区附近的鹤山村河水含砷量达到0.5～14.5mg/L，超出国家标准规定限值上千倍。

环境中存在的砷不能像有机污染物那样被微生物降解，但却可以通过微生物对砷的氧化还原、吸附/解吸附、甲基化/去甲基化、沉淀/溶解等作用改变其生物有效态(bio-available form)含量，从而达到降低环境中的砷毒害、修复砷污染环境的目的。金属有效态含量是土壤重金属污染的重要指标，它在土壤环境中的可移动性以及生物有效性最强。砷的毒性不仅仅与其总量有关，更大程度上由其生物有效态所决定，不同形态的砷产生不同的环境效应，具有不同的迁移特性，与毒性及其在自然界的循环密切相关。

金属有效态含量是土壤重金属污染的重要指标，它在土壤环境中的可移动性以及生物有效性最强。一般而言，砷的无机化合物形态的毒性要大于有机形态，各形态的毒性大小依次为：砷化氢(AsH₃)>氧化亚砷(As₂O₃)>亚砷酸(H₃AsO₃)>砷酸(H₃AsO₄>有机砷。根据砷连续提取分离法可将土壤中的砷分为五种存在形态：易溶型砷(AE-As)、铝型砷(A1-As)、铁型砷(Fe-As)、钙型砷(Ca-As)及残渣型砷(O-As)，其中易溶型砷为生物有效态砷。

目前，砷活化(AS-mobilization，通过物理、化学手段使As稳定化状态转化为活动状态，增加质量迁移速率)的研究主要是通过抗坏血酸钠、有机物等外源物质实现的，对于砷处理也是以化学稳定法为主。中国专利CN102101123A公开了重金属污染土壤原位修复方法，其采用亚微米或纳米铁、粉煤灰、含镁制剂和膨润土按照特定比例混合制成重金属污染土壤修复药剂；中国专利CN103773375A中以硫酸亚铁为原料，通过氧化亚铁硫杆菌催化氧化，收集沉淀产物并进行改性从而制得固定剂用以处理土壤中砷；中国专利CN102764759A采用氧化剂、铁基化合物及矿物材料为原料按特定比例混合均匀制成修复药剂对土壤有效砷砷进行修复处理；中国专利CN103551378A采用微波-氧化复合修复系统对土壤有机砷污染进行修复处理。

近年来，研究人员逐渐发现土壤中的植物和微生物与土壤中的砷发生复杂的生物化学反应，是治理土壤砷污染的新思路。中国专利CN101704015A采用丛枝根真菌-蚯蚓-玉米联合修复砷污染土壤，待玉米生长季结束后连根拔起；中国专利CN101049604A采用蜈蚣草-富砷特异功能菌联合修复处理砷污染土壤。

微生物-植物联合修复砷污染正以其特有的环境友好、清洁高效性逐渐成为砷修复保领域研究的热点之一。由于采用微生物来修复污染土壤的技术成本较低，能够循化利用，不产生二次污染，因而微生物是一种环境友好型的吸附剂，因此，寻找一种具有高耐受砷并提高有效态砷含量的菌种并将其用于治理重金属污染土壤是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种真菌菌株及其应用，特别是一种高耐受砷并提高土壤有效态砷含量的真菌菌种AS-3及其在治理重金属污染土壤中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种真菌AS-3，其分类学命名为Chaetomiumglobosum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，保藏编号为CGMCC No.10029，保藏日期为2014年12月02日。

本发明分离得到的真菌AS-3，经ITS序列鉴定，该真菌属于球毛壳菌(Chaetomium globosum)。

本发明的真菌可以耐受浓度为15mg/L以下的砷离子，例如砷离子浓度可以是1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L，优选砷离子浓度为5-10mg/L。

第二方面，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包含如第一方面所述的真菌AS-3。

第三方面，本发明还提供了如第二方面所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：

a)培养皿培养：将如第一方面所述真菌AS-3的菌种在无菌条件下接种于固体培养基上，于20-30℃，优选28℃下培养4-6天，优选5天；所述固体培养基由以下组分组成：酵母提取物0.1-0.2g/L；无水醋酸钠0.2-0.3g/L；琼脂12-18g/L；链霉素20-28mg/L；

b)一级种子培养：将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，于20-30℃，优选28℃下培养3-7天，优选5天，制得一级种子；所述液体培养基由以下组分组成：蛋白胨8-12g/L，优选10g/L；葡萄糖15-25g/L，优选20g/L；氯霉素0.25mg/L；

c)二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-15％，优选8-12％的接种量，将所述一级种子接种到5L发酵罐中，曝气，培养5-7天，优选5.5-6.5天，制得二级种子；

d)混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10-20％，优选12-18％的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。

本发明的培养皿培养中，培养温度可以为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃；培养时间可以为4天、4.5天、5天、5.5天、6天。

本发明的一级种子培养中，培养温度可以为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃；培养时间可以为3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天或7天；所用的液体培养基中蛋白胨可以为8g/L、8.2g/L、8.5g/L、8.7g/L、8.9g/L、9g/L、9.3g/L、9.5g/L、9.7g/L、10g/L、10.2g/L、10.5g/L、10.7g/L、11g/L、11.2g/L、11.5g/L、11.7g/L或12g/L，葡萄糖可以为15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L或25g/L。

本发明的二级种子培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％；发酵罐容积可以为1L、1.5L、2L、2.5L、3L、3.5L、4L、4.5L或5L；培养时间可以为5天、5.5天、6天、6.5天或7天。

本发明的混合发酵培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

第四方面，本发明还提供了一种砷离子处理剂，所述砷离子处理剂包含如第一方面所述的真菌AS-3。

第五方面，本发明还提供了一种治理重金属污染土壤的方法，所述方法包括：

将如第一方面所述的真菌AS-3、如第二方面所述的菌剂或如第四方面所述的砷离子处理剂与重金属污染土壤接触。

本发明中，所述的重金属污染土壤为砷污染土壤。

本发明中，所述真菌AS-3的用量为0.2-0.8g菌体/g土样，例如可以是0.2g菌体/g土样、0.3g菌体/g土样、0.4g菌体/g土样、0.5g菌体/g土样、0.6g菌体/g土样、0.7g菌体/g土样、0.8g菌体/g土样，优选为0.8g菌体/g土样。

本发明中，所述真菌AS-3的处理时间为15天以上，例如可以是15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天，优选为15-30天，进一步优选为30天。

在本发明中，其中的“有效态金属”是指重金属离子进入土壤后，大部分与其中的无机、有机组分发生吸附、络合、沉淀等作用，形成碳酸盐、磷酸盐、铁锰氧化物结合态、有机质硫化物结合态等形式，只有少部分以水溶态和离子交换态存在，后者可有效地影响土壤微生物的代谢活性而被称为有效态金属。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

a)本发明提供的真菌菌株AS-3可以耐受高浓度的砷离子，最高可耐受浓度为15mg/L的砷离子；并且该菌株可对土壤砷进行活化，提高有效砷含量，进而通过种植砷超积累植物对有效砷进行吸收修复，可以从根本上降低土壤砷含量；

b)本发明筛选该真菌菌株AS-3所用培养基容易得到，而且吸附剂能够循环使用，和传统方法相比，大大降低了成本；

c)本发明处理含砷污染土壤的方法比较环保，不会产生二次污染，是一种环境友好型的处理方法。

附图说明

图1是AS-3系统发育树；

图2是AS-3在不同浓度As⁵⁺条件下的生长速率；

图3是AS-3在不同处理时间下土壤生物有效态砷含量；

图4是AS-3在不同投菌量下土壤生物有效态砷含量。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1 真菌菌株AS-3的分离和鉴定

本实施例的分离方法具体包含以下步骤：

(1)土壤样品采集：供试土壤样品采自广西省河池市某处砷污染地区表层土壤0-10cm；

(2)菌种筛选：土壤样品采集后用采样袋密封保存带回实验室；将10g新鲜土样装入含有90mL无菌水的三角瓶中，用玻璃珠打散，搅匀，制成土壤悬液；将悬液涂布在含有40mg/L的As⁵⁺的固体AY培养基(无水醋酸钠0.2461g/L，酵母提取物0.15g/L，琼脂15g/L，25mg/L的链霉素(细菌抑制剂)，pH7.0)上，室温条件下培养，观察真菌菌落的生长情况；然后挑选单个真菌菌丝接入新鲜的AY固体培养基上培养，纯化5代，得到单一纯菌种；

(3)一级种子培养：将步骤(2)中培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，25℃下培养5天，制得一级种子；液体培养基具有以下组成：蛋白胨10g/L；葡萄糖25g/L；氯霉素0.25mg/L；

(4)菌种鉴定：

将分离的菌体于固体扩大培养基平板上接种(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15g/L，NaCl 0.2g/L，CaCl₂0.1g/L，KCl 0.1g/L，MgSO₄0.25g/L，FeSO₄0.005g/L)，恒温培养箱中27℃培养10天，进行菌种鉴定。

采用三博远志真菌基因组提取试剂盒提取菌株的DNA基因组，利用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行ITS rRNA基因(ITS：internal transcribedspacer，共有ITS1和ITS2两个片段，分别位于18S和5.8rRNA、5.8S和28SrRNA之间)的PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增；温度程序为：95℃预加热3min，然后在95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，重复30个循环；PCR产物直接用于碱基序列测定。利用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)网站(www.ncbi.nlm.gov)的BLAST进行碱基序列的比对，构建系统发育树(图1)，确定菌株的系统分类。

系统发育树结果表明AS-3和Chaetomium globosum JQ964802的亲缘关系最近，和Chaetomium subaffine JN209929处于同一分支，距离其他种较远。

实施例2 菌剂的制备

本发明中菌剂的制备方法具体包含以下步骤：

a)Petri Dishes培养：将已经纯化的原始菌种AS-3在无菌条件下分别接种于固体培养基上，室温(25℃)条件下培养5天；固体培养基具有以下组成：酵母提取物0.15g/L，无水醋酸钠0.2461g/L，琼脂15g/L，链霉素25mg/L；

b)一级种子培养：将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，室温(25℃)条件下培养6天，制得一级种子悬液；液体培养基具有以下组成：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，氯霉素0.25mg/L；

c)二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种到5L发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为3.5L，曝气，培养6天，制得二级种子；

d)混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种到10L的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为7L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。

实施例3 不同浓度砷离子(As⁵⁺)条件下真菌菌株AS-3的生长速率

配制含砷终浓度为5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、100mg/L的AY液体培养基，接种，静置培养10d，离心收集菌体，40℃干燥12h，采用差重法测量菌体质量。

由图2可以看出，该菌株对低浓度范围5-10mg/L的As⁵⁺具有很好的适应性，并且该浓度范围内As⁵⁺对菌体生长均呈现出一定的促进作用，菌体质量增重明显；在5mg/L时，菌体质量较对照增加了0.012mg/mL，AS-3增重率达到了20.7％；表明低浓度外源砷对AS-3的生长有刺激促进作用。

实施例4 真菌菌株AS-3在不同处理时间下的土壤生物有效态砷含量

浸提剂配置：将5.7mL冰醋酸加入到500mL蒸馏水中，再加入64.3mL 1mol/LNaOH，用蒸馏水定容至1L，调节pH至4.88～4.98。

将土壤样品风干、磨细、过1mm孔径筛，浸提剂的用量(体积)与土样(质量)比为20:1，在常温下振荡(18±2)h，静置后离心，上清液用0.45μm的滤膜进行过滤，ICP检测过滤后溶液的砷浓度。

称取5g过筛土壤样品投加2g菌体，分别修复5、10、15、20、30d，期间适时均匀搅拌并保持土壤湿度，分别测定土壤中生物有效态砷浓度。

由图3可以看出，与对照相比，该菌株对于有效砷含量有明显的活化作用。由于真菌对土壤砷的固定需要一定的时间，15d以内的活化作用并不突出，但随着时间的延长，活化作用越明显；15d～20d期间，生物有效态砷含量从0.04mg/g上升至0.49mg/g，至第30天，已达到1.10mg/g，砷活化率为对照(即不添加菌株AS-3)的137.2倍。

实施例5 真菌菌株AS-3在不同投菌量下的有效砷含量

称取5g土壤样品，分别投加1g、2g、3g、4g菌体，修复15d，期间适时均匀搅拌并保持土壤湿度，分别测定土壤中生物有效态砷浓度。

图4表明，随着AS-3菌体投加量的增加，土壤生物有效态砷含量均出现明显增加；当菌体投加量为4g时，土壤生物有效态砷的含量增加了8.5倍；趋势回归线为y＝0.0163x+0.0057，R²＝0.9844，说明土壤生物有效态砷的含量随AS-3投加量呈现正相关。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。