法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-01-19
授权
授权
2015-06-10
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/03 申请日:20130918
实质审查的生效
2015-03-25
公开
公开
技术领域
本发明属生物医学技术领域,涉及基因的开发与应用,具体涉及一种抗珀斯肉瘤疱 疹病毒的SIM多肽序列作为疫苗和药物靶点的免疫治疗的用途。
背景技术
现有技术公开了卡珀斯肉瘤疱疹病毒KSHV是多种人类恶性肿瘤的主要病原体,是最 常见4种感染性肿瘤之一的主因。研究显示,KSHV感染与HIV相关艾滋病患者、器官移 植免疫抑制患者和部分免疫低下老年人等肿瘤发病和致死率密切相关。鉴于HIV感染率 上升和器官移植/自身免疫患者免疫治疗手段日渐广泛,干预KSHV致病途径已成为一种 迫切需要的应对举措。全球范围内,在撒哈拉以南非洲国家流行地区KSHV检测到高达 80%,而美国多达20%。据估计,约14%的艾滋病死亡由与KSHV相关的最常见卡珀斯 肉瘤(4%)并发癌症引起。另据统计,全世界每年约6万例的原发性渗出性淋巴瘤(PEL) 诊断中,艾滋病相关淋巴瘤约占3-4%。更重要的是,相关领域中,目前尚未建立针对 KSHV引发恶性肿瘤的治疗方法或疫苗。研究显示,由于KSHV可利用少数几个病毒基因 将病毒基因组附加到宿主的染色体和逃避宿主免疫监视系统建立长期潜伏感染,因此, 一旦被感染,患者将终身携带病毒。
与其它疱疹病毒相似,KSHV病毒具有潜伏期和裂解期两个生活周期。在潜伏感染期, KSHV病毒仅有少量几个病毒基因表达,其中包括了潜伏相关核抗原LANA。已有研究证 明LANA是负责维护KSHV病毒潜伏感染的关键蛋白。研究表明LANA是一个含1162个氨 基酸的多功能病毒蛋白,其不仅与KSHV病毒基因组的稳定持续遗传和建立潜伏感染密 切相关,而且与降解肿瘤抑制蛋白如p53和VHL等有直接作用。但是,迄今,尚未有针 对KSHV病毒感染特性而设计的治疗性疫苗。因此,研发针对KSHV病毒潜伏感染的治疗 性疫苗至关重要。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的缺陷,提供抗卡珀斯肉瘤疱疹病毒的疫苗药物靶 点SIM,具体涉及由与艾滋病相关的卡珀斯肉瘤疱疹病毒(KSHV)编码的含SUMO-2 特异结合功能结构域(SIM,SUMO-Interacting Motif)的多肽序列。
本发明的进一步目的是,提供所述的抗珀斯肉瘤疱疹病毒的SIM多肽序列及其在制 备免疫治疗疫苗和药物靶点中的用途。
本发明基于大量前期研究发现,潜伏相关核抗原LANA特有SIM功能结构域。该SIM 结构域是KSHV病毒编码潜伏期相关核抗原LANA的一个功能结构域,对卡珀斯肉瘤 疱疹病毒的基因组稳定、持续遗传等维护潜伏期感染起着重要作用。该多肽序列可以识 别包括由SUMO-2修饰KAP1和Sin3A等多种转录因子的转录沉默复合物。
本发明经实验表明,上述多肽序列缺失可影响KSHV病毒基因组的稳定遗传和潜伏 感染,SIM位点的封闭可促进卡珀斯肉瘤病毒启动裂解细胞生活周期和破坏宿主细胞的 效率。
本发明进一步实验表明阻断潜伏感染不仅可阻止随后的感染,而且可减少肿瘤的进 展,该SIM结构域可作为抗卡珀斯肉瘤疱疹病毒的候选治疗靶点。
本发明所述的与SUMO-2结合的功能结构域SIM是LANA蛋白的一个关键位点,其包 含编码SEQID No:1所示的61个氨基酸残基的全长多肽;
1)该序列cDNA片段长为183bp,编码61个氨基酸,分子量为9kDa的蛋白;
2)含有4个SUMO-2结合的亚功能结构域,存在1个IYV,1个ISI和2个SSS。
本发明还涉及所述多肽序列的出发表位的人工改造核苷酸序列、整个SIM亚功能结 构域不同组装顺序相应核苷酸序列和其编码的蛋白质产物,以及所述基因和蛋白质在制 备抗卡珀斯肉瘤疱疹病毒方面的治疗制剂中的用途。
如在实验中所证明的,本发明的SIM多肽蛋白能与大量的转录沉默子识别,该位点 的缺失能有效地破坏LANA维护病毒基因组稳定遗传的能力。
此外,本发明SIM位点缺失的LANA突变体丧失了阻遏裂解期调控蛋白RTA基因转录 表达,并可在细胞内有效地裂解破坏肿瘤细胞。
本发明所述的SIM多肽疫苗药物靶点具有抗KSHV病毒潜伏感染的高特异性、有效性, 以及所产生抗体或小分子药物对抗KSHV病毒感染具有很高的潜在抑制效率。
本发明所述的SIM多肽蛋白可作为抗原产生中和抗体以及作为结合靶点筛选获得的 小分子化学药物,进一步制备用于预防和治疗KSHV病毒相关疾病的免疫制剂,如,抗 卡珀斯肉瘤病毒潜伏期感染的疫苗。
为了便于理解,以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特 别指出的是,具体实例和附图仅是为了说明,显然本领域的普通技术人员可以根据本文 说明,在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变,这些修正和改变也纳入 本发明的范围内。
附图说明:
图1示出卡珀斯肉瘤疱疹病毒编码LANA中含SIM位点的61个氨基酸多肽序列(即SEQ ID NO:1)及其蛋白编码所对应的183个碱基序列(即SEQ ID NO:2)。
图2示出含SIM位点多肽的61个氨基酸序列(即SEQ ID NO:1)中两个大亚SIM(SIM1 和SIM2)及附近酸性氨基酸区段(AD)空间结构上的分布情况。
图3为与SIM结构域特异结合的细胞内转录因子复合物,
上图:SDS-PAGE检测原核表达蛋白GST和GST-SIM结合293细胞中蛋白复合物的考 马斯亮蓝染色结果;下图:上图中与SIM结构域特异结合b1、b2、b3和b4蛋白的质谱 测序结果。
图4为SIM缺失降低LANA与KAP1和Sin3A蛋白结合能力,
其中,原核表达蛋白GST和GST融合野生型(WT)或SIM缺失(ΔSIM)LANA(下图 为考马斯亮蓝染色结果)与KAP1、Sin3A或DNA-PKc结合能力(上图为免疫印迹结果) 的差别。
图5为SIM缺失降低LANA介导TR稳定传代特性,
其中,
A:染色体共沉淀检测SIM位点和酸性区段AD缺失对LANA结合TR能力的影响;B: 嘌呤酶素处理含不同LANA突变体和TR-PuroR的293细胞14天后的细胞菌落分析结果。
图6显示SIM缺失导致LANA对裂解期调节关键蛋白RTA基因转录抑制能力的丧失, 荧光报告基因分析正常供氧和低氧条件下不同LANA突变体对Rta基因启动子转录能 力的影响。
图7显示了SIM缺失突变体显性负效应激活KSHV病毒DNA复制,
其中,含SIM缺失的不同LANA突变体对携带野生型KSHV病毒的293细胞的激活作用。
具体实施方式
实施例1:LANA中与SUMO-2特异结合SIM结构域的确定与序列分析
1.与SUMO-2特异结合的LANA SIM位点的确定
选用带myc标签的不同区段LANA突变体与带FLAG标签的SUMO-1或SUMO-2在人 胚肾293细胞内共表达,然后免疫共沉淀确定与SUMO-2特异高水平结合位点为LANA 中第233至340个氨基酸区段。采用缺失和点突变方法确定为两个大亚SIM(即4个小 亚SIM)结合结构域,分别为244-IYVGSSS-250和264-ISIGSSS-270(如图1SEQ ID NO:1所 示),所对应核苷酸序列(如图1SEQ ID NO:2所示)。
2.含SIM位点功能多肽的空间结合域和序列分析
针对含SIM位点的LANA第233至340氨基酸序列进行空间结合域和序列比对分析, 结果显示其第240至300个氨基酸(SEQ ID NO:2)形成一个相对独立的“马鞍式”空 间结构域,其附近86%QDE含量的酸性氨基酸区段为“环抱式”邻近SIM结构域,如图 2所示。
实施例2:SIM多肽蛋白的分离纯化及其细胞内结合蛋白复合物的鉴定
1.GST融合SIM多肽蛋白基因工程菌的构建与其编码蛋白的表达纯化
将含SIM多肽序列(240-300个氨基酸)的PCR扩增产物经Bgl II和EcoRI酶切后, 连接到大肠杆菌表达载体pGEX-2TK,感受态转化大肠杆菌BL21株,在终浓度为100μg/ml 氨苄青霉素抗性的培养基筛选后,获得含重组质粒GST-SIM原核表达工程菌 GST-SIM/BL21。该重组工程菌株已以甘油保藏方式,在中国科学院微生物保藏中心保藏 备份(北京)。该重组工程菌株经30℃IPTG诱导6小时,得到GST-SIM的融合重组蛋 白(与GST蛋白融合),经特异吸附的谷胱甘肽亲和纯化融合蛋白(图3上图)。
具体步骤如下:
1)重组蛋白样品准备:
a)在5ml LB培养基中接种含有表达目的蛋白的大肠杆菌工程菌,37℃活化过夜。
b)1/100接种量转接到新鲜LB37℃培养到接近对数生长期,加终浓度为1mM IPTG 在30℃诱导6小时。
c)收集菌液4℃,5000rpm×5min。
d)加一定体积的预冷的1×STE重悬菌液,4℃,5000rpm×5min,去上清。
e)加1.5ml含蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液和75μl1M DTT/1ml STE重悬菌液,冰 上进行超声波(40%强度,10秒,间隔10秒,50次)。
f)4℃,10,000rpm×10min,上清转入一新50ml离心管,加1.5ml含10% Triton-X100的STE和100μl谷胱甘肽亲和珠子,4℃旋转2hr。
g)样品转移至2ml离心管,收集珠子4℃,3000rpm×5min。
h)含蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液洗5遍,每次1ml。
i)NETN缓冲液重悬,放4℃保存备用。
2)试剂准备:
STE缓冲液:100mM NaCl,10mM Tris,1mM EDTA,pH=7.5
NETN缓冲液:0.5%NP40,20mM Tris pH=8.0,1mM EDTA,100mM NaCl
RIPA缓冲液:1%NP40,10mM Tris pH=7.5,2mM EDTA,150mM NaCl
2.与SIM多肽结合胞内蛋白的质谱测序分析
108个人胚肾293细胞核的RIPA裂解物(NE)与100μl上述纯化获得的GST和GST-SIM 蛋白4℃旋转孵育过夜后,用1ml含蛋白酶抑制剂TBS缓冲液洗5遍,每次4℃,3000rpm ×5min。然后加SDS上样缓冲液100℃5min变性,4%-15%梯度胶浓度SDS-PAGE电泳 分离(如图3上图所示);将与GST-SIM结合的细胞核裂解物中特有的明显4条蛋白带 b1,b2,b3和b4切割回收,转移至离心管后5%冰醋酸缓冲液送MALDI-TOF质谱分析; 结果表明,b1带中高丰度蛋白为DNA-PKc;b2带中高丰度蛋白为CBP和p300;b3带中 高丰度蛋白为Sin3A;b4带中高丰度蛋白为KAP1(如图3下图所示);
3.KAP1和Sin3A是SIM多肽结合复合物中的关键蛋白
为确定质谱测定与SIM多肽结合复合物中5种蛋白中哪一个或几个是关键蛋白,如 步骤1纯化获得的GST、GST-LANA1-329WT和GST-LANA1-329ΔSIM融合蛋白分别与106个人胚肾293细胞RIPA裂解物4℃旋转孵育过夜后,用1ml含蛋白酶抑制剂TBS缓冲液 洗5遍,每次4℃,3000rpm×5min;然后加SDS上样缓冲液100℃5min变性,6%梯 度胶浓度SDS-PAGE电泳分离后,分别进行抗DNA-PKc、CBP、p300、Sin3A和KAP1的蛋 白免疫印迹检测,结果显示,KAP1和Sin3A是SIM多肽结合复合物中的关键蛋白(如 图4上图所示)。
GST免疫共沉淀实验步骤:
1)用RIPA细胞裂解液调节总蛋白量为1mg体积为1ml,加入50μl的GST或GST融合蛋
白悬液,4℃缓慢滚动1-3小时;
2)4℃,3,000rpm离心5分钟,去上清;
3)加入1ml洗液NETN,重悬蛋白珠,4℃缓慢滚动20分钟;
4)重复上述两步五次;
5)收集蛋白珠,尽量移走痕迹量的洗液;
6)加入25μl的上样缓冲液;100℃变性3分钟,
7)12,000g离心20秒;
8)上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;
9)PVDF膜在甲醇中浸泡1min,与两层滤纸、海绵垫放入转膜缓冲液中浸润至转膜;
10)将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵按程序叠放,100v转膜60min;
11)5%脱脂奶粉(PBS配制)封闭,室温,30min;
12)TBST洗涤三次,5min/次,用一级兔源抗体(1:5000,PBS稀释,杭州华安),4 ℃孵育过夜;
13)TBST洗涤三次,5min/次,用HRP标记的羊抗兔抗体室温孵育1h;(1:5000, PBS稀释,艾比马特)TBST洗涤三次,5min/次;
14)ECL试剂盒显影。
实施例3:SIM缺失导致LANA维护KSHV病毒基因组稳定遗传功能的丧失
1.染色体免疫共沉淀检测SIM位点缺失对LANA DNA结合能力的影响
针对实施例1中所确定的SIM位点和酸性氨基酸区段AD,构建SIM位点和/或AD 区段或仅C末端的带myc标签的LANA突变体后,分别与携带KSHV病毒基因组TR(末 端重复序列)和嘌呤酶素抗性的重组质粒pBS-Puro-TR共转染293细胞,48小时后, 按下述方法将转染细胞的核提取物分别进行染色体免疫共沉淀分析,结果如图5A所示, 表明SIM位点缺失对LANA的DNA结合能力无显著影响。
将转染细胞的核提取物分别进行染色体免疫共沉淀分析:
10xHEPES-NaOH缓冲液:
1M Hepes pH=7.8
11%甲醇溶液(approx)
交联时工作液浓度为1X
此溶液为10X母液,实验时现用现配,工作液浓度为1X;
ChIP溶细胞缓冲液:
50mM Tris-Cl pH8.0
10mM EDTA
1%SDS
+蛋白酶抑制剂;
RIPA缓冲液(1X):
10mM Tris-Cl pH8.0
1mM EDTA
0.5mM EGTA
140mM NaCl
1%Triton X100
0.1%脱氧胆酸钠
0.1%SDS
+蛋白酶抑制剂;
Digesting缓冲液:
mM Tris-Cl pH8.0
1mM EDTA
100mM NaCl
0.5%SDS
(加入100ug/mL K蛋白酶)。
实验步骤:
1)将2x107转染后细胞加入新配的HEPES/甲醛溶液,至终浓度为1%甲醛(加入 0.5ml 11%的HEPES-NaOH-甲醛溶液;在实验前现用现配),
2)室温孵育10分钟,
3)消化细胞后,4℃,2000rpm离心5分钟,
4)PBS缓冲液洗涤材料,离心,重复两次,
5)加入含蛋白酶抑制剂的CHIP溶菌缓冲液(1mL每10mg总蛋白),将样品分装至 两个eppendorf离心管中,每个约500uL,
6)将样品进行超声波破碎,以获得长度约为500-1200bp的染色质,超声波破碎 过程全部在冰上进行(参考程序:超声波处理2秒,暂停10秒,6个循环),
7)高速离心超声波破碎产物,合并每个样品的两个离心管中的产物,
8)取5uL样品,在1%琼脂糖胶中电泳检测大小,若条带大小约为3kb,则进行下 面的步骤(通常未解交联的染色质电泳的条带大于3kb),
9)取一部分样品作为PCR的input对照(5-20%),,,,,,,,
10)预纯化染色质:使用树脂,如Protein A,在免疫沉淀反应后得到免疫复合物, 每管40uL分装的预洗涤Protein A琼脂柱并加入0.5X RIPA缓冲液+蛋白酶抑 制剂稀释样品,根据电泳结果,加入约100-200uL超声波破碎产物,预纯化混 合物总体积为1ml,4℃,翻转摇床孵育1小时以上,去除能结合在树脂上的非 特异杂质;本发明中优选将一个样品平均分至多管预纯化,以取得将一个样品 预纯化后再分装至多管的更好的效果;短暂离心(2000rpm,1min),上清转移 至新的离心管中,加入适当的抗体(约3ug,取决于抗体浓度),4℃,翻转摇 床孵育3小时或过夜;
11)将免疫沉淀下的DNA-蛋白复合物加入新的预洗涤过的琼脂柱,4℃孵育1.5小 时;
12)短暂离心(2000rpm,1min)复合物,用800ul,0.5X RIPA缓冲液洗涤沉淀, 重复3次,(加入缓冲液,振荡离心管混匀,短暂离心,去除上清,重复洗涤);
13)加入300ul digesting缓冲液,65℃孵育4小时-过夜,解除交联;
14)每管加入等体积酚/氯仿/isoamylalchohol,涡旋振荡,并4℃高速离心10分 钟,转移液态上清至新的离心管,乙醇沉淀DNA,由于得到的DNA量很少,本发 明中采用糖原或pellet paint作为载体;
15)4℃,最高速离心30分钟,去除上清,干燥沉淀,用20ul水重悬沉淀,用此 作为PCR的模板,每个反应用2ul。
2.细胞菌落实验分析SIM位点缺失对LANA介导KSHV病毒基因组稳定遗传的影响
用实施例3中所得的转染细胞加入嘌呤酶素进行稳定遗传的细胞菌落分析,经14 天处理后,结果显示了,SIM位点缺失后显著地降低了LANA介导KSHV病毒基因组稳定 遗传的能力(如图5B所示)。
实施例4SIM位点对LANA抑制KSHV病毒裂解期感染起关键作用
1.荧光素酶报告基因分析检测SIM位点缺失对LANA抑制裂解期激活蛋白RTA基因 转录能力的影响
采用实施例3中相似方法将表达不同SIM位点和/或AD区段且带myc标签的LANA 突变体和裂解期激活蛋白RTA启动子驱动荧光素酶报告基因pRta-luc共转染293细胞, 转染24小时后分别对转染细胞进行正常氧和低氧浓度处理,24小时处理后,分别用 200μl报告裂解缓冲液(Catalog#K801-200Promega公司)细胞,40μl细胞裂解上清 与25μl荧光素分析底物反应,用OpticompI Luminometer(MGM Instruments,Inc.) 检测荧光强度,以β-半乳糖苷酶降解ONPG底物的450nm吸光值活性为对照内参,以相 对于报告基因载体本身的倍数作为相对荧光值(RLU),所得结果为三次实验重复;结果 显示,正常供氧条件下,SIM位点缺失后显著地降低了LANA介导裂解期激活蛋白RTA 转录抑制能力,而缺氧条件下未见显著差异(如图6所示)。
2.SIM位点缺失的LANA突变体显性负调节激活KSHV病毒的基因组复制
采用实施例3中相似方法将不同剂量的SIM位点和/或AD区段且带myc标签的LANA 突变体表达质粒转染至携带KSHV病毒的293稳定细胞系(293/Bac36),转染48小时后, 分别用裂解缓冲液【10mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl,10mM EDTA,1%SDS】和蛋白 酶K对转染细胞进行裂解提取病毒基因组DNA。所得病毒DNA以特异基因引物K8: 5’-CAAGCTCGCTGTTGTCAACC-3’;5’-GTCCTCTTGGTGGTGTGTGA-3’;TR:5’- GGGGCGCGGGGTGTTCACGTAGT-3’;5’-GGGGGCGCCCTCTCTCTACT-3’进行定量PCR,以 GAPDH:5’-ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3’;5’-GGTCTACATGGCAACTGTGA-3’为内参;结 果显示,SIM位点缺失显著地提高KSHV病毒基因组的拷贝数,而AD区段缺失可进一步 促进SIM位点缺失导致的KSHV病毒基因组的复制拷贝数上升(如图7所示)。
机译: 防卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒疫苗
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