包含冯维勒布兰德因子(vWF)的制剂及其相关制备方法、试剂盒和用途

摘要

本发明涉及用于制备FVIII和使用它们的方法、组合物和试剂盒。还提供了vWF多肽和编码它们的核酸分子。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求于2009年11月13日提交的美国申请号61/261,145的权利，该 美国申请号全文通过参考并入本文。

技术领域

提供了对于包含vWF的制剂的方法、组合物和试剂盒，包括此类制剂用于 制备VIII因子(FVIII)的方法、试剂盒和用途。还提供了vWF多肽和编码它们 的核酸分子。

背景技术

由哺乳动物细胞表达的FVIII常常通过与表面成分(例如蛋白聚糖)相互作 用或者通过受体介导的事件(例如与LRP受体相互作用)特异性地或者非特异性 地吸收到细胞表面上。还有可能，所表达的FVIII在培养细胞的培养基中被酶 促切割和/或降解。随着培养时间的延长，培养基中所表达的FVIII浓度降低， 除非在表达后所分泌的物质被迅速移出(例如通过灌注技术)。

在通常情况下，可以通过常规色谱方法，包括吸附至带电荷基质上或者通 过假亲和层析，从培养基中移出FVIII-vWF复合体。然后可以通过选择性洗涤 步骤从FVIII：vWF复合体纯化出FVIII，得到最低程度vWF污染的富含FVIII 分子的群体。

vWF通过组成型或者受激释放而在血管内皮细胞中形成，血管内皮细胞是 该血浆蛋白质的主要来源，但是其还少量地由巨核细胞合成。据信，翻译的初 级产物由2813个氨基酸组成。在将信号肽(22个氨基酸)切下后，发生二聚化。 在高尔基器中实现进一步加工，在切割和去除前肽(741个氨基酸)后二聚体聚 合。前肽在二聚体的进一步连接中起着重要的作用，其中前肽催化在氨基末端 上形成二硫键。因此，可以形成大小范围在从500,000道尔顿的二聚体至高达 2000万道尔顿的大多聚体的不同大小的寡聚体。除了蛋白水解过程之外，vWF 还经历其它翻译后修饰，包括糖基化和硫酸化。

发明内容

在一个方面中，本发明提供了包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和 与第一氨基酸序列异源的第二氨基酸序列的多肽，其中多肽能够结合FVIII。

在另一方面中，本发明提供了包含含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列 的多肽的组合物。

在一些方面中，本发明提供了包含多肽和FVIII的蛋白质复合体。

在其它方面中，本发明提供了包含该蛋白质复合体的组合物。

在再一方面中，本发明提供了编码包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸 序列的多肽的核苷酸序列。

在一个方面中，本发明提供了包含所述核苷酸序列的表达载体。

在另一方面中，本发明提供了表达包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸 序列的多肽的细胞。

在一些方面中，本发明提供了表达包含所述多肽和FVIII的蛋白质复合体 的细胞。

在其它方面中，本发明提供了用于制备所述蛋白质复合体的方法，方法包 括使所述多肽与FVIII接触。

在一个方面中，本发明提供了用于制备FVIII的方法，方法包括：使FVIII 与包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽接触以形成包含所述多肽 和FVIII的蛋白质复合体。

在另一方面中，本发明提供了增强FVIII的血浆药物代谢动力学特性的方 法，方法包括向受试者施用包含含有所述多肽和FVIII的蛋白质复合体的组合 物。

在一些方面中，本发明提供了包含所述蛋白质复合体和可药用载体的组合 物。

在其它方面中，本发明提供了用于治疗血液病的方法，方法包括施用包含 含有所述多肽和FVIII的蛋白质复合体的组合物，其中所述多肽包含所述第一 氨基酸序列和第二氨基酸序列。

在再一方面中，提供了试剂盒。

附图说明

图1显示表示人冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor)蛋白结构、加工和 成熟的示意图。(A)一级冯维勒布兰德因子多肽的结构域结构：SS＝信号肽； D1和D2＝前肽序列；D’-D3＝包括标称的VIII因子结合区；A1和A3＝胶 原结合结构域(和其它相互作用)；(B)在分泌和加工过程中，信号肽被去除并且 随后通过类似弗林蛋白酶的加工步骤将前肽从vWF多肽上切下，以得到正常情 况下在D’结构域连接处开始的成熟vWF多肽；(C)前肽与成熟vWF多肽的结 合促进增强的FVIII结合和多聚化；和(D)由前肽-成熟的vWFIII复合体提供的 半胱氨酸残基提供了使得分子内和分子间多聚体形成的共价结合。

图2显示表示与IgG₁Fc共价融合的人冯维勒布兰德因子结构域截断物的 示意图。(A)一级冯维勒布兰德因子多肽的结构域结构：SS＝信号肽；D1和 D2＝前肽序列；D’-D3＝包括标称的VIII因子结合区；A1和A3＝胶原结合 结构域(和其它相互作用)；(B)图解显示一级vWF截断多肽与Fc，显示信号肽 切割后的预期的结构域结构。序列包括前肽，之后是D’-D3、D’-A1或者D’-A3 结构域，每一个依次共价融合至IgG₁恒定区的铰链区处；和(C)前肽与vWF 截断多肽-Fc融合体(即D’D3-Fc、D’-A1-Fc或者D’A3-Fc)的结合促进FVIII 结合增强和多聚化，在如在成熟vWF加工中出现的那样。

图3显示表示初级翻译产物的截断vWF-Fc融合物加工、成熟和多聚化的 示意图。(A)表示信号肽切下后的前肽和截断的vWF结构域-Fc融合产物。在 该示意图中，多肽衍生自如图1所示的单个初级翻译产物；(B)示意图显示在 初级翻译产物加工以及前肽与截断的vWF结构域-Fc多肽结合以促进正确折叠 之后的前肽和vWF结构域-Fc融合单体；和(C)IgG₁Fc铰链区内包含的半胱氨 酸残基提供了分子内结合以帮助产生还以与血浆来源vWF相似的方式结合 FVIII的功能性vWF-Fc二聚体；反过来，vWF前肽促进融合多肽的多聚化。

图4显示表示来自独立编码区的两个初级翻译产物的截断vWF-Fc融合物 的加工、成熟和多聚化的示意图。(A)表示在信号肽切下后前肽和截断的vWF 结构域-Fc融合多肽的分开且独立的初级翻译产物；如在正常vWF加工中一样， 不需要弗林蛋白酶样加工。在该示意图中，多肽来源于两个独立启动子盒从一 个表达载体或者从在一个细胞内共表达的两个表达载体转录的两个独立初级翻 译产物，前一表达模式描述于例如图6中；(B)显示初级翻译产物加工以及共 表达的前肽和截断的vWF结构域-Fc多肽结合以促进正确折叠之后的前肽和 vWF结构域-Fc融合单体的示意图；和(C)IgG₁Fc铰链区内包含的半胱氨酸残 基提供了分子内结合以帮助产生还以与血浆来源vWF相似的方式结合FVIII的 功能性vWF-Fc二聚体；反过来，vWF前肽促进融合多肽的多聚化。

图5是图解说明，在一些实施方案中，质粒表达载体转染进入哺乳动物细 胞表达成熟vWF或者截断的vWF结构域-Fc融合多肽的示意图。(A)具有编码 vWF或者截断的vWF结构域-Fc融合蛋白的编码序列的表达质粒，每一个包含 作为初级翻译产物部分的信号肽序列和前肽结构域；(B)表示质粒被转染并在 选择压力下被吸收进入哺乳动物细胞内，以产生稳定的表达细胞系；(C)使用 与(A)中不同的选择标志物(新霉素)的具有VIII因子编码盒的表达质粒；和(D) 表示FVIII(C)和vWF或vWF-Fc(D)质粒共转染并且在选择压力下被吸收进入 哺乳动物细胞内以产生表达FVIII和vWF-Fc(或vWF)的稳定细胞系。

图6是图解说明，在另外的实施方案中，质粒表达载体转染进入哺乳动物 细胞，从或者在同一质粒载体上或者在不同质粒载体上的独立启动子表达成熟 的vWF或者截断的vWF结构域-Fc融合多肽和前肽序列的示意图。(A)具有来 自独立启动子的编码vWF或者截断vWF结构域-Fc融合蛋白的编码盒(不表达 前肽结构域作为其部分初级翻译产物)和vWF前肽结构域表达盒的表达质粒(每 一个具有各自的信号肽序列)；(B)表示前肽缺失vWF或vWF-Fc融合多肽和前 肽多肽质粒被转染并在选择压力下被吸收进入哺乳动物细胞内，以产生共表达 vWF或vWF-Fc蛋白质和前肽多肽两者的稳定细胞系；(C)使用与(A)中不同的 选择标志物(新霉素)的具有VIII因子编码盒的表达质粒；和(D)表示FVIII(C) 和具有前肽的vWF或vWF-Fc(D)质粒共转染并且在选择压力下被吸收进入哺 乳动物细胞内以产生表达FVIII和vWF-Fc或vWF以及独立的vWF前肽的稳 定细胞系。

图7显示直接来自表达培养基上清液的(A)或者来自对(A)的培养上清液中 所存在蛋白质进行G蛋白免疫沉淀的(B)，经还原和变性条件下4-12％双-Tris PAGE凝胶电泳的所表达蛋白质的考马斯染色蛋白质。以包含截断vWF-Fc构 建体的质粒转染的PER.C6细胞使用抗生素选择选择出稳定培养物作为库。对 于直接的上清液样品，将20微升加载在凝胶上。对于免疫沉淀，将20微升G 蛋白珠或者加入到具有D’-D3-Fc的1ml培养基中，或者加入到具有D’-A1-Fc 或D’-A3-Fc的0.2m1培养基中。两个凝胶中的泳道代表着：泳道1：分子量标 准；泳道2：D’-D3-Fc；泳道3：pro-D’-D3-Fc；泳道4：D’-A1-Fc；泳道5： pro-D’-A1-Fc；泳道6：D’-A3-Fc；泳道7：pro-D’-A3-Fc；和泳道8：作为对照 的未转染PER.C6条件培养基。在泳道3、5和8中更高的分子量条带代表着仍 然与相应vWF结构域连接的未加工的前肽。

图8显示使用vWF-Fc融合蛋白或者血浆来源vWF蛋白质回收的FVIII活 性的柱形图。虚线标示高于对照(即没有加入vWF蛋白质的BDD-FVIII)的增加 的回收。包含所表达的截断vWF-Fc融合蛋白质或全长vWF的细胞上清液与表 达重组FVIII的BDD-078细胞混合。两天后，使用显色FVIII分析法分析样品 的FVIII表达。

图9是显示pro-vWF-Fc融合蛋白质多聚化与正常血浆来源vWF多聚体相 比较的凝胶。血浆来源VIII因子(Koate-)作为多聚化的标准在变性的、但 非还原性1.6％(泳道1)和2％HGT(P)(泳道2)琼脂糖凝胶上运行，而 pro-D’-D3-Fc(泳道3)、pro-D’-A1-Fc(泳道4)和pro-D’-A3-Fc(泳道5)蛋白质样 品在1.6％凝胶上电泳以显示阶梯大小差异。括号标示vWF二聚体的三联体在 泳道1中的位置和泳道2中的相应位置。如所预期，pro-vWF-Fc多肽链大小的 增加导致产生分子量增加的多聚体条带，顺序为：pro-D’-D3-Fc＜pro-D’-A1-Fc ＜pro-D’A3-Fc。

图10显示FVIII从包含pro-D’A3-Fc/FVIII复合体的上清液中的纯化：(A) 在不同缓冲液条件过程中洗脱峰的色谱轨迹；和(B)具有来自(A)中所示柱轨迹 的样品的考马斯染色的7.5％PAGE凝胶显示从泳道4中的pro-D’A3-Fc/FVIII 复合体特异性洗脱FVIII。泳道1-9分别表示，(1)原材料，(2)流过物，(3)0.1M CaCl₂洗脱物，(4)0.3M CaCl₂洗脱物，(5)pH 5.5柠檬酸盐洗脱物，(6)浓缩的 BDD-FVIII制备物，(7)分子量标准(右侧上为大小)，(8)来自表达pro-D’-A3-Fc 的PER.C6细胞的上清液，(9)商品化的BDD-FVIII星号显示大约 170、90和80kd的3个条带，分别对应于全长BDD-FVIII、重链和轻链(一个或 多个)。

图11显示FVIII从包含商品化重组B-结构域-缺失FVIII(Xyntha)的上清液 与包含pro-D’D3-Fc蛋白质的上清液中的纯化。在使用不同缓冲液组合物从凝 胶洗脱后，级分在7％NuPAGE还原性/变性聚丙烯酰胺凝胶上分析并用考马斯 亮蓝染色。泳道7显示在从与A蛋白结合的pro-D’-D3-Fc/FVIII复合体洗脱之 后回收的基本上纯的FVIII。泳道1-9分别表示，(1)在左侧列出分子量的多肽 分子量标准，(2)pro-D’-D3-Fc细胞上清液，(3)商品化的B-结构域-缺失FVIII (4)与pro-D’-D3上清液混合，(5)加载在A蛋白柱上的上 清液(pro-D’D3-Fc+)，(6)使用20mM Tris-HCl，pH 7.0洗涤的流过 物，(7)0.3M CaCl₂洗脱物，和(8)用于将额外的A蛋白结合蛋白质从柱上洗涤 下来的pH 3.9甘氨酸洗涤物。泳道3中的三个星号与分别对应于全长 BDD-FVIII、重链和轻链(一个或多个)的大约170、90和80kd的蛋白质条带对 齐。

具体实施方式

在一个方面中，本发明提供了包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和 与第一氨基酸序列异源的第二氨基酸序列的多肽，其中多肽能够结合FVIII。

如本文所使用，术语“能够结合”考虑了其中多肽与FVIII结合的能力被 更高级别蛋白质组装和/或一种或更多种翻译后修饰，例如诸如信号肽切割、前 肽切割、前肽结合、磷酸化、糖基化等等影响的实施方案。例如，在一些实施 方案中，多肽能够作为二聚体、三聚体、四聚体或者更高级别聚合复合体“结 合”FVIII，随后形成多肽多聚化。或者，例如，在另外的实施方案中，在前肽 与多肽结合之后的多聚化之后，多肽“能够结合”FVIII。“多聚化”和“寡聚 化”在本文中可互换使用并且指两个或者两个以上蛋白质分子通过共价(例如分 子间二硫键)和/或非共价相互作用介导的结合。因此，“一个或更多个多聚体” 和“一个或更多个寡聚体”在本文中也可以互换使用。

本发明考虑了人和非人(例如灵长类、狗、猫、马、猪、小鼠、大鼠、豚鼠、 兔、牛、其他脊椎动物)来源的vWF和FVIII多肽，包括天然的、人工合成的 和重组的蛋白质。对应于野生型蛋白质或者其突变体、变异体和/或截断变体的 vWF和FVIII多肽也处于本发明的范围内。例如，在一些实施方案中，第一氨 基酸序列对应于人来源的vWF多肽片段，其中异源性的第二氨基酸序列包含在 人或其他来源的任何vWF蛋白质中不存在的序列或者由其组成。FVIII和/或 vWF包括天然蛋白质，及其衍生物，例如通过缺失、替代或插入突变的蛋白质、 或者其化学衍生物或片段。

I.第一氨基酸序列

在一个实施方案中，第一氨基酸序列定义为与能够特异性结合包含FVIII 结合结构域的VWF多肽区域的单克隆抗-vWF抗体反应的结构或者结构域。在 一个实施方案中，单克隆抗体是例如Foster等，JBC，262：8443(1987)和Fulcher 等，J.Clin.Invest.，76：117(1985)中描述的单克隆抗体C3，该两篇参考文献关 于单克隆抗体C3和制备单克隆抗体，特别是单克隆抗体C3的方法的教导通过 参考并入本文。

vWF氨基酸序列和编码vWF的核酸序列或其部分的非限定性实例公开于 例如GenBank登录号：NP_000543、NM_000552、AAE20723、AAB59512、 P04275、EAW88815、ACP57027、EAW88816和AAD04919；美国专利号 5，260，274；Titani等，Biochemistry，25：3171-84(1986)；和Sadler等，PNAS， 82：6391-6398(1985)，每一篇参考文献关于对应于vWF的氨基酸和核酸序列的 教导通过参考并入本文。

本领域普通技术人员已知，典型的preprop-vWF是2813个氨基酸的多肽， 具有22个氨基酸的信号肽和重复性的功能结构域A、B、C、D和CK，从氨基 末端开始以“D1”、“D2”、“D’”、“D3”、“A1”、“A2”、“A3”、 “D4”、“B1”、“B2”、“B3(后三个总称为“B”)”、“C1”、“C2” 和“CK”的顺序分布。“成熟的”vWF亚基由从N-末端至C-末端的顺序的结 构域D’-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK组成。

示例性的全长人vWF的氨基酸序列示于SEQ ID NO：29中，其由SEQ ID  NO：30的核苷酸251-8689编码。关于SEQ ID NO：29，vWF的“信号肽”部分 横跨氨基酸位置1至Cys-22，“前肽”部分(D1-D2)横跨氨基酸位置23至Arg-763， 并且“成熟的”vWF部分横跨氨基酸位置764至2813。各个结构域大致定位为 D’：764-865；D3：866-1242；A1：1260-1479；A2：1480-1672；A3：1673 -1874；D4：1947-2298；B：2296-2399；C1：2400-2516；C2：2544-2663； 以及CK：2720-2813。EXPASY  蛋白质数据库规范 (worldwideweb.uniprot.org/uniprot/P04275)还使用另一种vWF结构域定位和命名 系统，其为D1：34-240；D2：387-598；D’：776-827；D3：866-1074； A1：1277-1453；A2：1498-1665；A3：1691-1871；D4：1949-2153；B： 2255-2328(其在EXPASY中命名为C1)；C1：2429-2495(在EXPASY中命 名为C2)；C2：2580-2645(在EXPASY中命名为C3)；以及CK：2724-2812。

FVIII氨基酸和核酸序列的非限定性实例公开于例如GenBank登录号 1012296A、AAA52420.1、CAA25619.1、AAA52484.1、1012298A、FAW72647.1、 EAW72646.1、XP_001498954.1、ACK44290.1、AC095359.1、NP_001138980.1、 ABZ10503.1、NP_032003.2、美国专利号6,307,032以及Wood等，Nature， 312：330-7(1984)中，每一篇参考文献关于FVIII序列的教导通过参考并入本文。 FVIII的变异体、衍生物、修饰形式和复合体也是本领域已知的，并包括在本发 明之中。例如，如美国专利号5,668,108中描述的VIII因子的变异体公开了其 中位置1241上的天冬氨酸被谷氨酸替换的FVIII变异体以及相应的核酸改变； 美国专利号5，149,637描述了包含或者糖基化或者非糖基化的C-末端部分的 FVIII变异体；以及美国专利号5,661,008描述了包含通过3个氨基酸残基与氨 基酸1649至2332相连的氨基酸1-740的FVIII变异体；每一篇参考文献关于 FVIII变异体序列的每一教导通过参考并入本文。

在一个实施方案中，FVIII是血浆或者血清来源的FVIII。在另一实施方案 中，FVIII是重组体FVIII，例如在培养的来自重组DNA克隆的哺乳动物细胞 中表达的活性人FVIII。用于产生VIII因子的表达系统是本领域已知的，并且 包括如通过美国专利号5,633,150、5,804,420和5,422,250所例证的原核和真核 细胞，每一篇参考文献关于产生FVIII的教导整合入本文中。

本领域普通技术人员已知多肽结合FVIII的能力可以通过多种方式确定。 具体而言，可以使用本文所述的技术和/或本领域已知的适宜技术测定本发明的 多肽结合FVIII的能力。例如，为了分析/确定结合，可以采用免疫测定法，包 括但不限于，使用技术例如western印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸 附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反 应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定 等的竞争和非竞争性测定系统(参见例如Ausubel等，编者，1994，Current  Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York， 该文献全部内容通过参考并入本文)。

例如，包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽可以在适宜缓冲 液例如TBS中于偶联至Sepharose的单克隆抗体存在条件下与FVIII接触。抗 体可以针对这样的多肽区域，即抗体与多肽的结合不干扰多肽与FVIII的结合 (例如抗体可以针对第二氨基酸序列或者多肽中也存在的vWF的“A1”或“A2” 或“A3”重复区。在接触之后，可以通过例如离心分离与多肽/抗体结合的FVIII 和非结合的FVIII，并且FVIII可以使用例如显色底物测定法测量(Factor VIII  Coatest；Chromogenix，默恩达尔，瑞典)。

在优选的实施方案中，本发明的多肽的第一氨基酸序列是截断的vWF多 肽。例如，在一些实施方案中，截断形式的vWF包括(i)缺乏“前肽”序列的截 断的vWF多肽；和(ii)缺乏成熟序列“A1”、“A2”、“A3”、“D4”、“B” (也称作“B1”、“B2”和“B3”)、“C1”、“C2”和/或“CK”结构域的截 断vVF多肽。还考虑了其它截断的或者其它修饰形式的vWF。

在一个实施方案中，第一氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ  ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID  NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID  NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、或 SEQ ID NO：35中所述。

II.第二氨基酸序列

在另外的实施方案中，多肽的第二氨基酸序列提供对结合配偶体具有亲和 性的结构或者结构域。

第二氨基酸序列与第一氨基酸序列是异源性的。在一个实施方案中，异源 性的第二氨基酸序列包含在任何vWF蛋白质中不存在的序列或者由其组成。在 一个实施方案中，异源性第二氨基酸序列的至少一部分(例如连续的部分)对应 于任何vWF多肽中不存在的序列。

优选地，在一些实施方案中，第二氨基酸序列对应于抗体Fc多肽例如，例 如人IgG1Fc区。例如，第二氨基酸序列可以对应于从N-末端铰链区延伸至天 然C-末端的氨基酸残基，即基本上全长抗体Fc区。还可以采用Fc区的片段， 例如在C-末端截断的那些。在一些实施方案中，片段优选包含一个或更多个半 胱氨酸残基(至少铰链区的半胱氨酸残基)以使得在本发明两个单独多肽的Fc多 肽部分间形成链间二硫键，从而形成二聚体。

其它抗体Fc区可以被人IgG1Fc区替代。例如，其它适宜的Fc区是可以 亲和性结合A蛋白或G蛋白或者其它相似Fc-结合性基质的那些，并且包括鼠 IgG、IgA、IgE、IgD、IgM的Fc区或者人IgG、IgA、IgE、IgD、IgM Fc区的 片段，例如包含至少铰链区的片段以致于可以形成链间二硫键。

IgG₁Fc区公开于例如GenBank登录号X70421中，其全部内容通过参考并 入本文。

在一个实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：16中所述序列。

在一些实施方案中，第二氨基酸序列优选位于第一氨基酸序列的C-末端。 包含与另一氨基酸序列不同部分融合的异源性氨基酸序列的融合多肽的制备由 例如Ashkenazi等，PNAS，88：10535(1991)和Byrn等，Nature 344：677(1990) 描述，每一篇参考文献的全部内容通过参考并入本文。例如，可以将编码包含 所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的基因融合序列插入到适宜表达 载体中。使所表达的融合蛋白装配，由此在多肽之间形成链间二硫键，得到二 聚体。在另外的实施方案中，可以表达具有或者不具有间隔氨基酸连接基团的 本发明的融合聚合物。例如，在一些实施方案中，本发明的多肽还包含位于第 一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的连接体，其中连接体包含一个或者更多 个氨基酸残基，以将第一序列和第二序列分隔开。

在另一实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、 SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：36、 SEQ ID NO：38、或SEQ ID NO：39中所述的氨基酸序列。

在一个实施方案中，多肽由具有SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID  NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ  ID NO：42、或SEQ ID NO：43中所述核苷酸序列的核酸编码。

本文所公开的序列的变异体也处于本发明的范围内。多肽变异体指一个或 更多个氨基酸被改变的氨基酸序列。变异体可以具有“保守”改变，其中取代 的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如以异亮氨酸取代亮氨酸。备选地， 变异体可以具有“非保守”改变，例如以色氨酸取代甘氨酸。类似的较少改变 还可包括氨基酸缺失或者插入，或者两者。特定形式的“变异体”多肽是“功 能等效的”多肽，即表现出与本发明的多肽实例具有基本相似的体内或体外活 性和/或结合的多肽。可以使用本领域众所周知的计算机程序，例如DNASTAR 软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)找到确定哪些氨基酸残基可以被替代、 插入或缺失而不丧失生物学或免疫学活性的指导。此外，在下面提供特定的指 导，包括在所引用参考文献内提供那些，所述参考文献通过参考并入本文。

在另外的实施方案中，所命名残基的特定位置可以稍微变化而仍然存在于 多肽的结构和功能类似位置上(参见Chang，Y.，等，Biochemistry37：3258-3271 (1998))。

此外，本发明的特定实施方案可以在功能上表征为在FVIII结合能力方面 与vWF多肽或其片段相关。在一些实施方案中，本发明的多肽表现出对FVIII 的结合能力小于、大约等于或者大于能够结合FVIII蛋白质(例如野生型内源 FVIII)的参照vWF蛋白质(例如野生型内源vWF)或其片段的结合能力。

因此，本发明包括本文所公开多肽的此类改变。此类改变包括缺失、插入、 倒转、重复和替代。关于氨基酸改变有可能是表现型沉默的更多的指导可以在 Bowie，J.U.，等，“Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to  Amino Acid Substitutions，”Science 247：1306-1310(1990)中找到。

因此，本发明多肽的片段、衍生物或类似物包括具有这样序列的片段、衍 生物或类似物，即所述序列与本发明的多肽相比，具有(i)一个或更多个以保守 或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)替代的氨基酸残基(例如1、3、5、8、 10、15或20个残基)。此类替代的氨基酸残基可以是或者可以不是由遗传密码 编码的氨基酸残基；或者(ii)一个或更多个包括取代基的氨基酸残基(例如1、3、 5、8、10、15或20个残基)。在另外的实施方案中，本发明多肽的片段、衍生 物或类似物包括例如与另一化合物(例如，聚乙二醇)偶联以提高多肽半衰期的 本发明的多肽，或者其中多肽与额外氨基酸融合的本发明的多肽。根据本文的 教导，此类片段、衍生物和类似物被认为处于本领域技术人员的范围内。

如所标明，优选性质较小的改变，例如没有明显影响折叠或者FVIII结合 能力的保守性氨基酸替代。当然，技术人员将做出的氨基酸替代的数量依赖于 许多因素，包括上面描述的那些。在一些实施方案中，对于任何给定多肽的取 代的数量将不会超过50、40、30、25、20、15、10、5、3、2或1。

对于与FVIII结合必需的(本发明多肽的)氨基酸残基可以通过本领域已知 的方法鉴定，例如位点定向突变或者丙氨酸扫描突变(Cunningham和Wells， Science 244：1081-1085(1989))。后一个过程在分子的每一个残基位置上引入一 个丙氨酸突变。然后测试所得到的突变体分子结合FVIII的能力，例如如本文 所述。对于结合FVIII至关重要的位点也可以通过结构分析确定，例如结晶作 用、核磁共振或者光亲和标记(Smith，等，J.Mol.Biol.224：399-904(1992)和de Vos，等Science 255：306-312(1992))。

在一个实施方案中，重组多肽具有与本文所述氨基酸序列中的任何一个具 有至少70％、80％、90％、95％、98％或者更大同一性的氨基酸序列。

在另一实施方案中，第一氨基酸序列存在于包含SEQ ID NO：29中所述氨 基酸序列或其变异体或片段的vWF多肽中。

在另外的实施方案中，第一氨基酸序列存在于由SEQ ID NO：30所述核酸 序列或其变异体或片段编码的vWF多肽中。

在其它方面中，本发明提供了重组的vWF-Fc融合蛋白，其中融合蛋白的 vWF部分是缺少成熟全长vWF多肽的至少一个结构域的截断vWF，其中融合 蛋白能够形成能够结合FVIII蛋白质的多聚体。在一个实施方案中，截断的vWF 具有结构域D’和D3，但是截断的vWF缺乏结构域A1、A2、A3、D4、B1、 B2、B3、C1、C2、CK或其组合。在另一实施方案中，截断的vWF具有结构 域D’、D3和A1，但是截断的vWF缺乏结构域A2、A3、D4、B1、B2、B3、 C1、C2和CK。在一些实施方案中，截断的vWF具有结构域D’、D3、A1和 A2，但是截断的vWF缺乏结构域A3、D4、B1、B2、B3、C1、C2和CK。在 另外的实施方案中，截断的vWF具有结构域D’、D3、A1、A2和A3，但是截 断的vWF缺乏结构域D4、B1、B2、B3、C1、C2和CK。在再一实施方案中， 截断的vWF缺乏结构域D4、B1、B2、B3、C1、C2和CK。

III.核酸、载体和表达系统

在其它方面中，本发明提供了用于表达包含所述第一氨基酸序列和第二氨 基酸序列的多肽的重组表达载体，以及以表达载体转化的宿主细胞。可以采用 任何适宜的表达系统。载体包含与适宜转录或翻译调节性核苷酸序列例如来源 于哺乳动物、微生物、病毒或者昆虫基因的那些有效连接的、分别编码第一氨 基酸序列和第二氨基酸序列的第一DNA序列和第二DNA序列。调节序列的实 例包括转录启动子、操纵子或增强子、mRNA核糖体结合位点、和控制转录和 翻译起始和终止的合适序列。当调节序列与编码DNA序列功能性相关时则核 苷酸序列有效连接。因此，如果启动子核苷酸序列控制编码DNA序列的转录， 则启动子核苷酸序列与编码DNA序列有效连接。通常由复制起点赋予的在所 希望宿主细胞中复制的能力和用于鉴定转化体的选择基因可以额外整合入表达 载体中。

在再一实施方案中，编码相对第一氨基酸序列而言天然或者非天然的适宜 信号肽的DNA序列可以整合入表达载体中。例如，可以与第一序列在同一读 码框内提供信号肽(分泌前导序列)的DNA序列，以致于所表达的多肽最初翻译 成为包含信号肽的融合蛋白质。在预期宿主细胞内具有功能的信号肽增强了包 含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽的细胞外分泌。在一些实施方 案中，当多肽从细胞中分泌时，信号肽从多肽上切下。在另外的实施方案中， 相对第一氨基酸序列而言非天然的适宜信号肽可以作为天然信号序列的替代物 提供或者除了天然信号序列之外额外提供。

在一些实施方案中，信号肽具有如SEQ ID NO：40所示氨基酸序列。

用于表达本发明多肽的适宜宿主细胞包括原核、酵母、丝状真菌或高等真 核细胞。与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适宜克隆和表达 载体描述于，例如，Pouwels等Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier， New York，(1985)中。还可采用无细胞翻译系统以使用来源于DNA构建体的 RNA产生本发明的多肽。

原核生物包括革兰氏阴性或者革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌(枯草芽孢 杆菌)。用于转化的适宜的原核宿主细胞包括，例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属 (Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的多个 其他种。

在原核宿主细胞中使用的表达载体通常包含一个或更多个表型选择标记基 因。表型选择标记基因为例如编码赋予抗生素抗性的蛋白质的基因或者提供自 养需求的基因。优选用于细菌的载体当中包括例如可从Novagen，Madison得 到的pET24b或pET22b、WI(pET-24b(+)和pET-22b(+)，分别为pET表达系统 24b(目录号69750)和22b(目录号70765)，EMD Biosciences，Inc.，Novagen Brand， Madison，WI；关于载体pET-24b和pET-22b的详细信息见 http://worldwideweb.emdbiosciences.com产品信息部分)、可从Qiagen Inc.， Valencia，CA得到的pQE70、pQE60和pQE-9；可从Stratagene，LaJolla，CA 得到的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、 pNH46A；以及可从Pharmacia(now Pfizer，Inc.，New York，NY)得到的ptrc99a、 pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。当中优选的真核载体是可从Stratagene 得到的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；和可从Pharmacia得到 的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它适宜的载体对本领域技术人员而言是 显而易见的。

适宜在本发明中使用的细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3 和T7启动子、gpt启动子、lambda PR和PL启动子以及trp启动子。适宜的真 核启动子包括CMV立刻早期启动子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶启动子、早期和 晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR启动子，例如劳氏肉瘤病毒(RSV)的那些 启动子、以及金属硫蛋白启动子，例如小鼠金属硫蛋白-I启动子。例如，用于 重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括，但不限于，β-内酰胺酶(青霉素 酶)启动子、乳糖启动子、色氨酸(trp)启动子系统、和tac启动子(Maniatis， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。 特别有用的原核宿主细胞表达系统采用噬菌体λPL启动子和cI857ts不耐热阻 抑物序列。可从美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection) 获得的整合有λPL启动子衍生物的质粒载体包括质粒pHUB2(居于大肠杆菌 JMB9株中(ATCC 37092))和pPLc28(居于大肠杆菌RR1株中(ATCC 53082))。

本发明的多肽还可以在酵母宿主细胞，优选来自酵母菌属(Saccharomyces) 的酵母(例如啤酒酵母(S.cerevisiae))宿主细胞中表达。其它酵母属，例如毕赤酵 母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)也可采用。酵母载体常常包含来自 2μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区、多腺苷化序列、 转录终止序列、和选择标记基因。用于酵母载体的适宜启动子序列尤其包括金 属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或者其它糖酵解酶如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢 酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸 甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激 酶的启动子。用于酵母表达的其它适宜载体和启动子包括葡萄糖抑制性ADH2 启动子。可在酵母和大肠杆菌中复制的穿梭载体可以通过向酵母载体中插入用 于选择和在大肠杆菌中复制的pBR322的DNA序列(Ampr基因和复制起点)构 建。

在一些实施方案中，可以采用酵母α-因子前导序列以指导多肽的分泌。α- 因子前导序列可以插入到启动子序列和结构基因序列之间。适于促进重组多肽 从酵母宿主分泌的其它前导序列是本领域技术人员已知的。前导序列可以在接 近其3′末端被修饰成包含一个或更多个限制位点。这将促进前导序列与结构基 因的融合。

酵母转化方案是本领域技术人员已知的。一个此种方案描述于Hinnen等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929，1978中。Hinnen等的方案在选择培养基中 选择Trp⁺转化体，其中选择培养基包含0.67％酵母氮源、0.5％酪蛋白氨基酸、 2％葡萄糖、10μ/mi腺嘌呤和20μg/ml尿嘧啶。被包含ADH2启动子序列的载 体转化的酵母宿主细胞可以在丰富培养基中生长用于诱导表达。丰富培养基的 一个实例是包含1％酵母提取物、2％蛋白胨和1％葡萄糖并补充有80μg/ml腺 嘌呤和80μg/ml尿嘧啶的一种培养基。当培养基中葡萄糖耗尽时发生ADH2启 动子的去阻抑。

还可以采用哺乳动物或者昆虫宿主细胞培养系统以表达重组多肽。用于在 昆虫细胞中产生异源性蛋白质的杆状病毒系统综述于Luckow等， Bio/Technology 6：47(1988)中。还可使用建立的哺乳动物来源细胞系。适宜的哺 乳动物宿主细胞系实例包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)、L细胞、 C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞 和BHK(ATCC CRL 10)细胞系、以及从非洲绿猴肾细胞系CVI衍生的 CV-1/EBNA-1细胞系(ATCC CCL 70)，如McMahan等，EMBO J.10：2821(1991) 中所述。

其它适宜的细胞系包括，但不限于，HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴 肾细胞(COS-1)、人肝癌细胞(例如Hep G2)、人腺病毒转化的293细胞、小鼠 L-929细胞、HaK仓鼠细胞系、从Swiss，Balb-c或者NIH小鼠衍生的鼠3T3 细胞以及许多其它细胞系。另一种适宜的哺乳动物细胞系是CV-1细胞系。正 常的二倍体细胞、从原代组织体外培养衍生的细胞株、以及原代外植体也是适 合的。候选细胞基因型可以是选择基因缺陷型的，或者候选细胞包含优势的活 性选择基因。

在一些实施方案中，载体构建体引入到培养的宿主细胞中可以通过磷酸钙 转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感 染或其它方法实现。此类方法描述于许多标准实验室手册中，例如Davis等， Basic Methods In Molecular Biology，第2版(1995)。

例如，宿主细胞可以以携带DNA的一个或更多个载体通过本领域已知的 方法转化，所述DNA包含编码本发明多肽的核苷酸序列，然后可以根据需要 在适宜条件下培养，其中一个或者两个所引入基因扩增。然后通过本领域技术 人员已知的方法将所表达的多肽从培养基(或者从细胞中，例如当在细胞内表达 时)中回收并纯化。在一些实施方案中，所表达的多肽可以作为蛋白质复合体制 备，例如作为通过在两个包含或不包含FVIII的单独多肽之间的一个或更多个 链间二硫键结合的异二聚体。

用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列可以衍生自病毒基 因组。通常使用的启动子序列和增强子序列衍生自多瘤病毒、腺病毒2、猿猴 病毒40(SV40)和巨细胞病毒(CMV)。从SV40病毒基因组衍生的DNA序列，例 如，SV40复制起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接位点和多腺苷化位点可 用于提供用于在哺乳动物宿主细胞中表达结构基因序列的其它遗传元件。病毒 早期和晚期启动子是特别有用的，因为两者均可以容易地从病毒基因组中作为 也包含病毒复制起点的片段得到。

适宜在哺乳动物细胞中复制的载体可以包括病毒复制子，或者保证编码多 肽的序列整合入宿主基因组中的序列。适宜的载体可以包括，例如，衍生自猿 猴病毒SV40、反转录病毒、牛乳头瘤病毒、痘苗病毒和腺病毒的那些。载体的 构成元件，例如复制子、选择基因、增强子、启动子等等可以从天然来源得到 或者通过已知方法合成。

例如，适宜的载体可以是衍生自痘苗病毒的载体。在该种情况下，异源性 DNA插入到牛痘基因组中。用于将外源DNA插入到痘苗病毒基因组中的技术 是本领域已知的，并且利用例如同源重组。通常将异源DNA插入到在性质上 为非必需的基因中，例如，胸腺嘧啶核苷激酶基因(tk)，其也提供了可选择标记。

因此，哺乳动物表达载体可以包含一个或更多个能够在哺乳动物细胞中表 达的真核转录单位。例如，转录单位可以包含至少启动子元件以介导外源DNA 序列的转录。在一些实施方案中，用于哺乳动物细胞的启动子包括病毒启动子， 例如来自SV40、CMV、劳氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和牛乳头瘤病毒(BPV) 的启动子。

转录单位还可以包含与编码多肽的序列有效连接的终止序列和聚(A)添加 序列。转录单位还可以包含用于增强表达的增强子序列。

任选地，还可包括使基因扩增的序列，如编码选择标记的序列可使基因扩 增。用于哺乳动物细胞的选择标记是本领域已知的，并且包括例如，胸腺嘧啶 核苷激酶、二氢叶酸还原酶(与甲氨蝶呤一起作为DHFR扩增子)、氨基糖苷磷 酸转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、天冬酰胺合成酶、腺苷脱氨酶、金属硫蛋白 以及抗生素抗性基因例如新霉素。或者，例如，载体DNA可以包含全部或者 部分的牛乳头瘤病毒基因组，并且可以在细胞系例如C127小鼠细胞中作为稳 定的附加型元件携带。

用于在哺乳动物宿主细胞中使用的表达载体和系统的非限定性实例可以如 Okayama等，Mol.Cell.Biol.3：280(1983)，Cosman等，Mol.Immunol.23：935 (1986)(用于在C127鼠乳腺上皮细胞中稳定高水平表达DNA的系统)，Cosman 等，Nature 312：768(1984)(表达载体PMLSV N1/N4；ATCC 39890)， EP-A-0367566以及美国专利号5,350,683等所公开来构建，每一篇参考文献关 于表达载体和/或系统的教导通过参考并入本文。载体可以衍生自反转录病毒。 在一些实施方案中，可以包括异源性信号序列代替天然信号序列，例如美国专 利号4,965，195中描述的白细胞介素-7(IL-7)的信号序列；例如Cosman等， Nature 312：768(1984)中描述的白细胞介素-2受体的信号序列；例如EP 367,566 中所述的白细胞介素-4信号肽；例如美国专利号4,968,607中所述的I型白细 胞介素-1受体信号肽；以及EP 460,846中所述的II型白细胞介素-1受体信号肽， 每一参考文献关于信号序列的教导通过参考并入本文。 在一个实施方案中，重组多肽可以使用技术(Crucell，Holland， 荷兰)制备。重组蛋白的表达公开于例如美国专利号6,855,544中，该参考文献 关于用于在人细胞系中产生重组蛋白质的方法和组合物的教导通过参考并入本 文。

还考虑了本发明的多肽可以通过固相合成方法制备。见Houghten，R.A.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135(1985)；以及Houghten等(1986)的美国 专利号4,631,211。

在另外的实施方案中，本发明还包括包含所述第一氨基酸序列和第二氨基 酸序列的重组多肽，其中多肽在翻译过程中或者翻译后被差异性修饰，例如通 过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/封闭基的衍生化、蛋白 水解切割、与抗体分子或其他细胞配体连接等。可以通过已知技术实现众多的 化学修饰，包括但不限于，通过溴化氢进行的特异性化学断裂、胰蛋白酶、糜 蛋白酶、木瓜蛋白酶、金黄色葡萄球菌(S.aureus)V8蛋白酶、NaBH4；乙酰化、 脱酰胺作用、甲酰化、甲基化、氧化、还原；在衣霉素存在下的代谢合成等。 本发明包括的额外的翻译后修饰包括例如，N-连接或O-连接糖链、N-末端或 C-末端的加工、化学部分与氨基酸主链的连接、N-连接或O-连接糖链的化学修 饰以及N-末端甲硫氨酸残基的加入，结果产生适合于表达重组多肽，例如用于 在培养的原核宿主细胞中表达的载体和构建体。

在一些实施方案中，其中不溶解的多肽从宿主细胞分离(例如原核宿主细 胞)，宿主细胞可置于适宜离子强度的缓冲液中以溶解大多数的宿主蛋白质，但 是凝集的目的多肽在其中基本上不溶解，并将细胞破裂以致于释放包涵体，并 使得它们可以通过例如离心回收。该技术是本领域普通技术人员已知的，并且 一种改变形式的技术描述于例如美国专利号4,511,503中，该参考文献关于使从 重组宿主细胞培养物以不溶解的折射形式产生的异源蛋白质增溶的方法教导通 过参考并入本文。不希望被特定理论所束缚，据信重组蛋白质在例如大肠杆菌 中的表达会导致重组蛋白以称作包涵体的不溶解聚集物形式在细胞内沉积。重 组蛋白在包涵体内的沉积是有利的，这是因为包涵体积累高度纯化的重组蛋白 和因为隐藏在包涵体内的蛋白质免受细菌蛋白酶的作用。

通常，宿主细胞(例如大肠杆菌细胞)在适宜量生长之后收获，并且在使用 技术例如机械方法(例如音波振荡器)或者通过化学或酶学方法裂解破坏之前悬 浮于适宜缓冲液中。化学或酶学方法破坏细胞的实例包括原生质球化，其包括 使用溶菌酶裂解细胞壁，和渗透压休克，其包括以高张力溶液处理活细胞和用 低张力冷水洗涤以释放多肽。

在宿主细胞破坏后，有代表性地将悬浮液离心以将包涵体沉淀。所得到的 沉淀包含基本上所有不溶解的多肽部分，但是如果细胞破坏过程不完全，则可 能还包含完整的细胞或者破碎的细胞碎片。细胞破坏的完全性可以通过将沉淀 重悬于小量相同缓冲溶液中并用相差显微镜检查悬浮液来鉴定。破碎细胞碎片 或完整细胞的存在表明需要额外破坏以去除碎片或者细胞和相结合的非折射性 多肽。在此种进一步的破坏之后，根据需要，可将悬浮液开始离心并将沉淀物 回收、重悬浮并分析。该过程可以重复直到肉眼观察显示沉淀物中缺乏破碎的 细胞碎片，或者直到进一步的处理不能减少所得到沉淀物的大小。一旦从增溶 的包涵体得到多肽或者在纯化后期阶段时，多肽可以在适宜的重折叠缓冲液， 例如本领域已知的那些缓冲液中适当地重折叠。任何解折叠的程度可以通过层 析，包括反向高效液相层析(RP-HPLC)确定。

如果重组表达的本发明多肽在它们重折叠之前不是可溶解形式，则可以通 过在包含基本上溶解多肽所需量的离液剂(例如尿素、胍)和还原剂(例如谷胱甘 肽、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸)的增溶缓冲液中孵育以增溶。在允许多肽增 溶发生的多肽浓度、孵育时间和孵育温度条件下开展该孵育过程。增溶程度的 测量可以通过浊度测定、通过在还原性SDS凝胶上离心后分析多肽在上清液和 沉淀物之间的分级分离、通过蛋白质测定(例如Bio-Rad蛋白质测定试剂盒)、或 者通过高效液相层析(HPLC)进行。

增溶缓冲液的pH可以是碱性的，优选至少大约pH 7.5，其中优选范围为 大约pH 7.5至大约pH 11。本发明的多肽在用于增溶的缓冲溶液中的浓度必须 这样的，以致于多肽将基本上溶解并部分或完全地还原并变性。备选地，重组 多肽可以是最初不溶性的。所使用的确切量将取决于例如缓冲溶液中其它成分 的浓度和类型，特别是还原剂的类型和数量、离液剂的类型和数量、和缓冲液 的pH。例如，如果重组多肽的浓度增加，则还原剂例如谷胱甘肽的浓度同时增 加。

在再一实施方案中，本发明提供了包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸 序列的同质的或者基本上同质的多肽。在一个实施方案中，本发明提供了包含 在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和与第一氨基酸序列异源的第二氨基酸 序列的分离多肽，其中多肽能够结合FVIII。在另外的实施方案中，多肽被纯化 至基本上同质性，如通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析时呈现单 一蛋白质带所表明。

如本领域技术人员将意识到的那样，纯化重组蛋白的过程将根据诸如所采 用的宿主细胞类型和蛋白质是否分泌到培养基中的因素而变化。例如，当采用 分泌重组蛋白的表达系统时，首先使用商业上可得到的蛋白质浓缩过滤器，例 如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元将培养基浓缩。在浓缩步骤之后，将浓 缩液应用到纯化基质上，例如凝胶过滤介质。备选地，可以采用阴离子交换树 脂，例如具有悬垂二乙基氨基乙基(DEAE)的基质或物质。基质可以是丙烯酰胺、 琼脂糖、葡聚糖、纤维素或者通常在蛋白质纯化中采用的其它类型。备选地， 可以采用阳离子交换步骤。适宜的阳离子交换剂包括多种包含磺丙基或羧基甲 基的不溶性基质。磺丙基是优选的。最后，可以采用使用疏水RP-HPLC基质(例 如具有悬垂甲基或其它脂肪族基的硅胶)的一个或更多个反相高效液相层析 (RP-HPLC)步骤，以进一步纯化重组表达的多肽。可以以多种组合使用上述纯 化步骤的一些步骤或者全部步骤以提供基本上同质的重组蛋白。

在一些实施方案中，采用包含由第二氨基酸序列所限定结构或者结构域的 结合配偶体的亲和柱，以亲和纯化所表达的重组多肽或包含它们的蛋白质复合 体。例如，其中第二氨基酸序列对应于抗体Fc多肽时，可使用包含A蛋白或G 蛋白的亲和柱用于亲和纯化多肽或者包含它们的蛋白质复合体。在一些实施方 案中，结合的多肽和/或复合体从高盐洗脱缓冲液中的亲和柱上去除，然后透析 进入低盐缓冲液中以便使用。在另一实例中，亲和柱包含结合多肽或者结合包 含多肽的蛋白质复合体的抗体，例如针对由第一或第二氨基酸序列确定的结构 或者结构域的抗体。

在其它方面中，提供了编码本发明多肽的核苷酸序列，其中多肽包含在 vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和与第一氨基酸序列异源的第二氨基酸序 列，其中多肽能够结合FVIII。在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID  NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ  ID NO：28、37、42和43中所述核苷酸序列的分离的核酸分子。

本发明的多核苷酸可以包括涉及具有一个或更多个核苷酸的替代、缺失和/ 或添加的变异体。变异体可以在编码区、非编码区或者两者中发生改变。编码 区内的改变可以产生保守性或非保守性氨基酸替代、缺失或添加。当中特别优 选的是不改变本发明多肽特性和FVIII结合能力的沉默替代、添加和缺失。

本发明的更多的实施方案包括包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具 有与(a)编码具有本文所述氨基酸序列的多肽的核苷酸序列和(b)与上面(a)中任 意核苷酸序列互补的核苷酸序列具有至少90％同一性、并且更优选至少95％、 96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

与编码多肽的参照核苷酸序列具有至少例如95％“同一性”的核苷酸序列 的多核苷酸旨在指，除了在多核苷酸序列中可以每100个编码多肽的参照核苷 酸序列中包括高达5个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是相同 的。换句话说，为了得到具有与参照核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列 的多核苷酸，在参照序列中高达5％的核苷酸可以缺失或者用另一核苷酸替代， 或者高达参照序列总核苷酸5％数量的核苷酸可以插入到参照序列中。参照序列 中的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5’或者3’末端位置或者这些末端位 置之间的任何地方，可以在参照序列中的核苷酸当中各自散开或者在参照序列 内的一个或更多个连续组群中。

两个或者更多个多核苷酸序列可以通过确定它们的同一性百分数来比较。 同样，两个或更多个氨基酸序列可以通过确定它们的同一性百分数来比较。两 个序列，不管是核酸序列还是肽序列的同一性百分数一般描述为，两个对齐序 列之间确切配对的数量除以较短序列的长度并乘以100。通过Smith和 Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法 提供核酸序列的近似排列。使用由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and  Structure，M.O.Dayhoff ed.，5suppl.3：353-358，National Biomedical Research  Foundation，Washington，D.C.，USA开发的并由Gribskov，Nucl.Acids Res. 14(6)：6745-6763(1986)标准化的评分矩阵，可将该算法扩展应用至肽序列。通 过Genetics Computer Group(Madison，Wis.)在他们的BestFit实用应用程序中提 供对核酸和肽序列实施该算法。对于该方法的默认参数描述于Wisconsin序列 分析包程序手册第8版(1995)(可从Genetics Computer Group，Madison，Wis. 得到)中。

例如，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将认识到，具有与本 文所述任何一个核酸序利具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一 性的序列的许多核酸分子可以编码多肽。

实际上，由于这些核苷酸序列的简并变异体均编码同一多肽，甚至无需开 展本文所述的任何功能分析或者测定，这对技术人员而言是显而易见的。在本 领域中将进一步地认识到，对于不是简并变异体的此类核酸分子，有相当的数 量也将编码具有FVIII结合能力的多肽。这是因为，技术人员完全知晓较少可 能或者不可能显著影响蛋白质结合(例如以第二脂肪族氨基酸代替一脂肪族氨 基酸)的氨基酸替代。

最近，在合成性产生较长多核苷酸序列方面的进展已经使得无需使用传统 的克隆技术可以合成性产生编码明显更长多肽的核酸。此类服务的商业提供商 包括Blue Heron，Inc.，Bothell，WA(http://worldwideweb.blueheronbio.com)。 Blue Heron，Inc.采用的技术描述于美国专利号6,664,112；6,623,928；6,613,508； 6,444,422；6,312,893；4,652,639；美国公布的专利申请号20020119456A1； 20020077471A1；和公布的国际专利申请(公布号)WO03054232A3； WO0194366A1；WO9727331A2；和WO9905322A1中，所有参考文献通过参 考并入本文。

当然，传统的分子生物学、微生物学、和重组核酸技术也可用于产生本发 明的多核苷酸。这些技术是众所周知的并且解释于，例如，Current Protocols in  Molecular Biology，F.M.Ausebel编，第I，II和III卷(1997)；Sambrook等， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory  Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；DNA Cloning：A Practical Approach， D.N.Glover编，第I和II卷(1985)；Oligonucleotide Synthesis，M.L Gait编， (1984)；Nucleic Acid Hybridization，Hames和Higgins编，(1985)；Transcription and Translation，Hames和Higgins编，(1984)；Animal Cell Culture，R.I.Freshney  编，(1986)；Immobilized Cells and Enzymes，IRL Press(1986)；Perbal，“A Practical  Guide to Molecular Cloning”；系列，Methods in Enzymology，Academic Press， Inc.(1984)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，J.H.Miller和M.P.Calos 编，Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；以及Methods in Enzymology，分别 为Wu和Grossman和Wu编，第154和155卷中，所有参考文献通过参考并入 本文。

在其它方面中还提供了包含编码本发明多肽的核酸分子的表达载体。还提 供了表达本发明多肽的宿主细胞。在一个实施方案中，本发明提供了表达包含 在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和与第一氨基酸序列异源的第二氨基酸 序列的多肽的细胞，其中多肽能够结合FVIII，其中细胞还表达FVIII。在另一 实施方案中，FVIII是重组FVIII。

IV.蛋白质复合体

在另一方面中，本发明提供了包含多肽和FVIII的蛋白质复合体，其中多 肽包含在vWF多肽中存在的第一氨基酸序列和与第一氨基酸序列异源的第二 氨基酸序列，其中多肽能够结合FVIII。在一个实施方案中，复合体包含与FVIII 复合的二聚体形式的两个单独的多肽链。

在另一实施方案中，本发明提供了包含两个本发明多肽链的同二聚体蛋白 质复合体，其中在链间形成一个或更多个二硫键。在一个实施方案中，在两个 单独链的第一氨基酸序列之间形成一个或更多个二硫键由此产生二聚体。在另 一实施方案中，在两个单独链的Fc区之间形成一个或更多个二硫键，由此产生 二聚体。在一些实施方案中，同二聚体复合体由或者基本上由两个本发明的多 肽链构成。在再一实施方案中，异二聚体也处于本发明的范围内。

在另一实施方案中，本发明提供了寡聚体，例如通过将二聚体进一步连接。 在一些实施方案中，提供了优选地在本发明多肽氨基末端形成二硫键的不同大 小的寡聚体。因此，在另外的实施方案中，提供了大小范围从至少大约100,000、 250,000、500,000道尔顿或者更大的二聚体到包括大约5,000,000、10,000,000、 20,000,000、30,000,000、40,000,000或50,000,000道尔顿或者更大的大多聚体 的不同大小的寡聚体。

在再一实施方案中，寡聚体是同寡聚体或者异寡聚体。在另一实施方案中， 二聚体是异二聚体。

在另外的实施方案中，从表达多肽和FVIII的细胞或者组织培养表达系统 制备蛋白质复合体。在一个实施方案中，多肽和FVIII在同一细胞中共表达。

在一个实施方案中，本发明提供了包含与Fc多肽N-末端融合的第一氨基 酸序列的可溶性融合蛋白质，其中第一氨基酸序列存在于vWF多肽中，其中多 肽能够结合FVIII。在一些实施方案中，多肽作为包含通过二硫键连接的两个可 溶性融合蛋白质的二聚体能够结合FVIII。

在另一实施方案中，本发明提供了包含通过二硫键连接的两个可溶性融合 蛋白质的二聚体，其中每一蛋白质包含与Fc多肽N-末端融合的第一氨基酸序 列，其中第一氨基酸序列存在于vWF多肽中，其中二聚体能够结合FVIII。

在其它方面中，本发明提供了包含含有两个或者更多个具有所述第一氨基 酸序列和第二氨基酸序列的多肽的二硫键连接的多聚体的蛋白质复合体。

在一个实施方案中，通过将所述多肽与vWF前肽片段接触，由此vWF前 肽片段以“反式”起作用指导所述二硫键连接的多聚体装配，来制备二硫键连 接的多聚体。

在一些实施方案中，vWF前肽片段包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列 或其变异体。

在另一实施方案中，接触包括共表达多肽与vWF前肽片段。

例如，在一个实施方案中，本发明提供了包含二硫键连接的多聚体的蛋白 质复合体，所述二硫键连接多聚体包含两个或更多个具有所述第一氨基酸序列 和所述第二氨基酸序列的多肽，其中所述第一氨基酸序列描述于SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：7中。在另外的实施方案中，第一氨基酸序列描 述于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：9中。在一些实施方案中， 第一氨基酸序列描述于SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、或SEQ ID NO：19中。 在另一实施方案中，通过使用重组表达系统共表达多肽与包含SEQ ID NO：31 中所述氨基酸序列的vWF前肽片段，由此所述片段以“反式”起作用以指导包 含所述多肽的二硫键连接的多聚体装配，来制备蛋白质复合体。

V.方法

在再一方面中，本发明提供了制备本发明蛋白质复合体的方法。在一些实 施方案中，使用包含由所述第二氨基酸序列所确定结构或结构域的结合配偶体 的亲和柱亲和纯化复合体。例如，其中第二氨基酸序列对应于抗体Fc多肽，包 含A蛋白或G蛋白的亲和柱可用于亲和纯化复合体。在一些实施方案中，结合 配偶体被固定化。备选地，亲和柱包含结合多肽Fc部分的抗体，或者结合由多 肽第一氨基酸序列所确定结构或结构域的抗体。在一些实施方案中，待制备的 复合体包含含有通过二硫键连接的两个可溶性融合蛋白的二聚体，其中每一蛋 白质包含与Fc多肽N-末端融合的第一氨基酸序列，其中第一氨基酸序列存在 于vWF多肽中，其中二聚体能够结合FVIII。

在另一实施方案中，复合体还包含结合至二聚体的FVIII。FVIII可以从复 合体去除/解离，并且任选地进行一个或更多个额外的纯化步骤以得到部分纯 的、基本上纯的或者纯的FVIII。

在一个方面中，本发明提供了制备FVIII的方法，方法包括：使FVIII与多 肽接触以形成包含FVIII和多肽的蛋白质复合体，其中多肽包含在vWF多肽中 存在的第一氨基酸序列和与第一氨基酸序列异源的第二氨基酸序列，其中多肽 能够结合FVIII以形成蛋白质复合体。

在一个实施方案中，方法还包括将复合体选择性地附着至分离介质上，所 述分离介质包含对由第二氨基酸序列所确定区域或者结构域具有亲和性的结合 配偶体。在另一实施方案中，第二氨基酸序列对应于免疫球蛋白Fc区。在另外 的实施方案中，结合配偶体是A蛋白或G蛋白。在一个实施方案中，结合配偶 体是抗体。在一些实施方案中，结合配偶体是针对免疫球蛋白Fc区的抗体。在 再一实施方案中，复合体包含二聚体形式的两个多肽链，其中二聚体亲和性地 结合至FVIII。

对于结合配偶体的固定化，可以使用任何的不同固体支持物。例如，固体 支持材料可以由多糖例如纤维素、淀粉、葡聚糖、琼脂或琼脂糖、或者亲水的 合成的聚合物例如取代或非取代聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、 聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯亲水聚合物、聚苯乙烯、聚砜等组成。可以用作固体 支持材料的其它适宜材料包括多孔矿物材料，例如硅石、氧化铝、氧化钛、氧 化锆和其它陶瓷结构。备选地，复合材料可以用作固体支持材料。此类复合材 料可以通过两种或者更多种上述实体的共聚合或者互穿网络形成。适宜的复合 材料的实例包括多糖-合成聚合物和/或多糖-矿物结构和/或合成聚合物-矿物结 构，此类材料描述于美国专利号5,268,097、5,234,991和5,075,371中，每一篇 参考文献关于复合材料的教导通过参考并入本文。

本发明的固体支持材料可以是直径大小范围从大约0.1mm至1000mm的 珠或不规则的颗粒、任何大小的纤维(中空或者其他)、膜、厚度范围从大约0.1 mm至1mm的扁平表面、和具有直径从1μm至数mm的孔的海绵样材料。

优选地，通过在例如结合配偶体的巯基与固体支持物上存在的反应基之间 形成的共价键将结合配偶体化学固定在固体支持物上。能够与本发明的配体的 巯基反应的活性基包括环氧基、甲苯磺酸基、三氟乙基磺酸单甲氧基、卤化物 和乙烯基。由于许多上述固体支持材料不包括上述反应基之一，可以使用既能 够与固体支持材料反应又能够提供必需的反应基的双功能活化剂。适宜的活化 剂实例包括表氯醇、表溴醇、二溴丙醇和二氯丙醇、二溴丁烷、乙二醇二缩水 甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯砜等等。

有代表性的适宜支持物实例是Sepharose^TM、琼脂糖、来自Pharmacia(瑞典) 的活化的-CH Sepharose^TM 4B(包含N-羟基琥珀酰亚胺的琼脂糖)树脂、NHS- 活化的Sepharose^TM 4Fast Flow树脂(以6-氨基己酸活化以形成活化的N-羟基琥 珀酰亚胺酯；Amersham Biosciences)、CNBr-活化的Sepahrose^TM Fast Flow树脂 (以溴化氰活化的；Amersham Biosciences)、PROTEIN PAK^TM环氧-活化的亲和 树脂(Waters，美国)、EUPERGIT^TM C30N树脂(Rohm & Haas，德国)、UltraLink  Biosupport Medium(Pierce)、Trisacryl GF-2000(Pierce)、或者来自BioRad(美国) 的AFFI-GEL^TM。优选地，用于亲和层析的支持物以环氧基预活化用于直接偶 联肽和蛋白质。

用于实施本发明方法的亲和层析树脂包括，但不限于，上述配体或化合物 与任何上述支持物的任意组合。特异性亲和层析树脂的非限定性实例是A蛋白 -Sepharose^TM、A蛋白-琼脂糖、A蛋白-琼脂糖CL-4B、G蛋白-Sepharose^TM、G 蛋白-琼脂糖、G蛋白-琼脂糖CL-4B、A/G蛋白琼脂糖(上面所有树脂的不同形 式的树脂可以从多个生产商获得，例如Sigma-Aldrich、Amersham和Pierce)、 A蛋白Ultraflow^TM(Sterogene)、A蛋白Cellthru^TM 300(Sterogene)、QuickMab (Sterogene)、QuickProtein A^TM(Sterogene)、Thruput^TM和Thruput Plus(Sterogene)、 PROSEP-A或PROSEP-G(Millipore)、以及上面的任何变体。

用于亲和层析的方法至少部分地依赖于所使用的特定试剂，并且有代表性 地由生产商提供或者是本领域中已知的。例如，亲和层析试剂可以包装在以能 够促进蛋白质复合体与结合配偶体之间相互作用的缓冲液平衡的层析柱内，然 后与包含复合体的混合物接触。然后将柱用能够洗脱杂质而不干扰复合物与亲 和性配体之间相互作用的至少一种溶液洗涤。然后，包含多肽和FVIII的整个 复合体可以使用合适的洗脱液洗脱以得到复合体。备选地，FVIII可以从复合体 上解离下来，由此复合体仍然结合至结合配偶体上。

例如，在制备包含多肽(例如多肽二聚体)和与其结合的FVIII或者无FVIII 的蛋白质复合体的方法中，包含复合体的混合物可以与具有A蛋白作为配体的 至少一种亲和层析树脂，在允许复合体与树脂结合的条件下接触。希望的是， A蛋白是天然存在的或者重组形式的A蛋白。然后可以用一系列具有渐增酸度 (例如pH 7.0、6.5、6.0、5.8、5.5、5.2、5.0、4.8、4.6、4.5、4.4或4.0)的洗涤 缓冲液洗涤层析树脂，以致于洗涤导致非复合体物质从树脂上解离但是复合体 基本上不解离。可以用洗涤缓冲液洗涤树脂至少一次，优选至少2次，并且最 优选至少3次，其中第一次的洗涤缓冲液具有大约5.0至6.0的pH，优选大约 5.2，并且随后每一次的洗涤缓冲液具有比先前的洗涤缓冲液酸性更大的pH。 在优选的实施方案中，洗涤缓冲液将不会使超过80％、70％、60％、50％、40％、 30％、20％、10％或者5％的复合体从树脂上解离。

在一些实施方案中，在洗涤树脂之后，使用具有大约2.5至3.5(例如pH 2.5、 3.0、3.5)的酸性pH并且比任何洗涤缓冲液酸性更强的洗脱液，将复合体从层析 树脂上洗脱下来。洗脱物包含纯化的、部分纯化的、或者基本上纯化的复合体， 优选纯度至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或者95％或更高。

在另外的实施方案中，其中待制备的蛋白质复合体包含结合至二聚体形式 的多肽的FVIII，树脂结合和洗涤在如此条件下开展以致于FVIII仍然亲和结合 至二聚体，并且二聚体仍然结合至树脂。然后，从树脂-结合的二聚体分离FVIII 以提供包含FVIII的组合物，其中组合物是部分的、基本上、或者完全没有二 聚体。

因此，在一些实施方案中，包含所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的 多肽可以用于根据它们结合FVIII以形成包含多肽与FVIII的蛋白质复合体的能 力来制备FVIII。在一些实施方案中，此种蛋白质复合体可进行亲和层析以制备 复合体和/或与其结合的任何FVIII。

在其它方面中，本发明提供了包含FVIII的组合物，其中FVIII根据本文所 述方法制备。还提供了包含蛋白质复合体和结合至复合体多肽的FVIII或者不 含FVIII的组合物，所述蛋白质复合体包含具有所述第一氨基酸序列和所述第 二氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，组合物包含与FVIII结合的含有二 聚体(例如同二聚体或异二聚体)形式的两个多肽的蛋白质复合体。

因此，在一些方面中，本发明提供了组合物(例如截断的重组vWF融合蛋 白)，和用于通过保护所表达的重组FVIII不被去除和/或降解而增强哺乳动物细 胞表达重组FVIII，以及通过使用整合入本发明重组vWF多肽内的融合蛋白柄 (例如第二氨基酸序列)快速层析纯化所得到的FVIII：重组vWF复合体的方法。

因此，在多个实施方案中，提供了使用与免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G1)Fc 部分偶联的截断形式vWF的强大且简单的方法，以与完整vWF分子类似的方 式在表达和生产过程中与FVIII复合并保护FVIII。本文所述的独特方法是更有 效的，至少因为本发明的vWF融合多肽更小且表达更容易，和/或(2)可以通过 融合蛋白上的Fc区可快速纯化FVIII：vWF融合复合体，由此选择性地富集所希 望的FVIII分子而同时来自其他蛋白质以及来自vWF的污染较少。此外，Fc 区的高亲和性结合提供了，FVIII：vWF融合复合体也可以通过内联A蛋白柱原 位去除，以便例如增加产量和纯度。

在一个实施方案中，本发明提供了在灌注过程中使用内联纯化，以便通过 选择性地将vWF融合Fc区亲和附着于A蛋白(或者其他相似)基质上来连续纯 化FVIII：重组vWF融合复合体的方法。

在一些实施方案中，本发明利用了两个观察结果产生了用于FVIII纯化的 优良方法：(a)使用重组的vWF多肽，具体而言是仍然结合FVIII但显著小于 全长分子的重组的截断vWF多肽，和(b)产生具有以高亲和性结合配体A蛋白 的免疫球蛋白(例如IgG1)Fc区的融合蛋白。该组合提供了在哺乳动物细胞系统 中强大表达，而同时可以快速收集FVIII：recvWF复合体，而无需考虑表达上清 液中的培养基和其它成分以及与离子强度相关的问题等等。其还使得可以使用 多种试剂/溶液去除FVIII而同时保留完全活性的且具有优良回收率的产物。Fc 部分与A蛋白(或高亲和性抗体)柱的高亲和性结合不干扰FVIII：vWF相互作用， 因为它是分开的且独立的分子实体。

在再一方面中，本发明提供了用于重组制备本发明多肽的方法。在一些实 施方案中，方法包括：(a)通过以编码本发明多肽的表达载体转化细胞系产生哺 乳动物细胞系；(b)使细胞系在足以表达多肽的条件下生长；和(c)从步骤(b) 纯化所表达的蛋白质以得到vWF-Fc融合蛋白，其中融合蛋白的vWF部分是缺 少成熟全长vWF多肽的至少一个结构域的截断vWF，其中融合蛋白能够形成 能够结合FVIII蛋白质的多聚体。在一个实施方案中，截断的vWF具有结构域 D’和D3，但截断vWF缺乏结构域A1、A2、A3、D4、B、C1、C2、CK或其 组合。在另一实施方案中，截断的vWF具有结构域D’、D3和A1，但是截断 的vWF缺乏结构域A2、A3、D4、B、C1、C2和CK。在一些实施方案中，截 断的vWF具有结构域D’、D3、A1和A2，但是截断的vWF缺乏结构域A3、 D4、B、C1、C2和CK。在另外的实施方案中，截断的vWF具有结构域D’、 D3、A1、A2和A3，但是截断的vWF缺乏结构域D4、B、C1、C2和CK。在 再一实施方案中，截断的vWF缺乏结构域D4、B、C1、C2和CK。在另外的 实施方案中，方法还包括共表达重组前肽，其中vWF-Fc融合蛋白作为还缺乏 前肽序列的重组融合蛋白表达，其中重组前肽与重组vWF-Fc融合蛋白在重组 表达之后结合形成前肽/vWF-Fc复合体。

VI.其它组合物和方法

在其它方面中，本发明提供了用于具有延长的血浆半衰期的FVIII的方法 和组合物。例如，在一些实施方案中，本发明的重组vWF-Fc融合多肽可以用 作重组或者血浆来源FVIII的添加剂促进延长FVIII和/或组合复合体的半衰 期。根据本发明，在一些实施方案中，Fc区融合至截断的vWF部分以提供FVIII 结合并且Fc区还提供给复合物以额外的半衰期。例如，在一个实施方案中，重 组FVIII：重组vWF-Fc融合复合体可以直接从表达的培养基中纯化，然后作为 药物制剂，例如与或不与过量重组vWF-Fc融合蛋白(即本发明的多肽)一起注射 (例如静脉内)进入患者内。在一些实施方案中，以过量vWF-Fc融合蛋白(以摩 尔浓度计例如2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多)补充复合体以便增加血 浆中的融合多肽浓度，并且当在血浆中解离时提供FVIII以再结合至vWF-Fc 融合蛋白。

在再一实施方案中，本发明的融合多肽可以以高浓度与FVIII配制，通过 静脉内或者其它途径施用至人或者非人受试者，由此使得FVIII在其循环过程 中和被凝血酶切割之前与vWF融合蛋白结合，在损伤部位释放。

因此，在一些实施方案中，本发明的多肽和/或包含它们的蛋白质复合体， 可以配制成用于治疗。例如，本发明的多肽和/或蛋白质复合体可以根据已知方 法配制以制备优选在混合物中与可药用载剂混合的可药用组合物。适宜的载剂 和其制剂，包括其他人蛋白质例如人血清白蛋白，描述于例如E.W.Hartin编 的Remington′s Pharmaceutical Sciences中，该参考文献通过参考并入本文。在 一个实施方案中，此类组合物将包含有效量的与重组vWF多肽复合的FVIII蛋 白质，以及适宜量的载剂以制备适宜向受试者有效施用的可药用组合物，例如 肠胃外施用至患有例如血友病A的受试者。

用于治疗血友病患者的当前平均剂量随着出血发作的严重性而变。例如， 静脉内施用的平均剂量可以在如下范围：对于术前适应证大约40单位FVIII/kg， 对于少量出血大约15至大约20单位/kg，并且对于维持剂量大约20至大约40 单位/kg施用大约8-小时的时间段施用。其它剂量和方案可以容易地由血友病 治疗领域普通技术人员确定。

VII.试剂盒

在再一方面中，还提供了包含本发明多肽、核酸序列、蛋白质复合体和/ 或组合物的试剂盒。试剂盒可以具有单一容器，或者可以对于每一目的成分具 有不同的容器。还考虑了包含对于制备重组多肽和/或衍生自重组多肽的蛋白质 复合体所必需试剂的试剂盒，例如试剂例如，但不限于，表达载体、包含表达 载体的重组宿主细胞、和纯化试剂。此外，其中试剂盒中的成分在一个或更多 个液体溶液中提供，液体溶液是水性溶液，其中特别优选无菌水性溶液。然而， 试剂盒的成分可以作为一种或多种干燥粉末提供。当试剂或者成分作为干燥粉 末提供时，可通过加入适宜的溶剂将粉末重构。考虑了还可提供溶剂。

给出下列实施例仅仅为了说明本发明方法而不是限制本发明。本领域技术 人员知道给出的实施例仅仅说明什么是要求专利保护的并且本发明在范围上仅 由后附权利要求书限定。

实施例

实施例1

用于截断vWF-Fc融合多肽的表达质粒的构建

商业性合成(GENEART AG，Regensburg，德国)6个DNA分子，每一个具 有编码截断vWF-Fc融合多肽的核苷酸序列。对于DNA分子的核苷酸序列和相 应的编码氨基酸序列的序列标识符示于表1中。

表1：截断vWF-Fc多肽的核苷酸和氨基酸序列

  多肽名称   核苷酸序列   氨基酸序列   D’-D3-Fc   SEQ ID NO：37   SEQ ID NO：36   Pro-D’-D3-Fc   SEQ ID NO：24   SEQ ID NO：20   D’-A1-Fc   SEQ ID NO：42   SEQ ID NO：38   Pro-D’-A1-Fc   SEQ ID NO：28   SEQ ID NO：21   D’-A3-Fc   SEQ ID NO：43   SEQ ID NO：39

  Pro-D’-A3-Fc   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：22

对于每一DNA分子，编码截断vWF区的分子的核苷酸序列部分使用针对 密码子选择、二级结构、抑制序列等等的算法进行密码子优化。每一分子的Fc DNA区，其对应于SEQ ID NO：16中所示氨基酸序列并衍生自IgG1，不进行序 列优化。此外，每一DNA分子包含编码如SEQ ID NO：40所示信号肽序列的核 苷酸序列。SEQ ID NO：20-22额外包括如SEQ ID NO：41所示前肽氨基酸序列。

在合成基因内的限制性位点被切割并重新克隆至质粒表达载体 pcDNA3002Neo(Crucell，荷兰)的相应限制性位点内。通过SDS-碱裂解方法根 据通常已知的方案，例如如Sambrook等，(1989)Molecular Cloning：A  Laboratory Manual，CSH；Jones(1995)Gel Electrophoresis：Nucleic Acids Essential  Techniques，Wiley中所述的方案，从克隆中制备重组DNA。限制酶消化的DNA 在1％琼脂糖凝胶上分离以确定大小和身份。通过使用荧光脱氧核糖核苷酸引物 (Applied Biosystems，Carlsbad，CA)自动DNA测序验证质粒克隆序列。通过将 所制备的每一种编码不同截断vWF-Fc构建体的质粒表达载体DNA在沉淀后用 70％乙醇洗涤而灭菌，并重悬于无菌水中至大约0.2至大约1.0微克每微升的 终浓度。

实施例2

表达质粒电穿孔进入PER.C6哺乳动物细胞中

PER.C6细胞和表达B-结构域-缺失FVIII(BDD-FVIII)的PER.C6细胞系的 克隆系078细胞(BDD-078细胞)每一种通过在PER-MAb培养基(Hyclone， Logan，UT)中常规传代(4天)维持连续培养。在电穿孔前48小时，通过将细胞 以1×10⁶个细胞/ml接种到新鲜的PER-MAb培养基中而将细胞恢复。在电穿孔 当天，将5×10⁶个细胞重悬于100μl的Amaxa试剂盒V溶液中 (Lonza Walkersville Inc.，Walkersville，MD)。

对于每一电穿孔，细胞悬浮液与大约2至大约5μg表达质粒DNA混合， 用于表达表1中所述的多肽。然后将细胞混合物转移至Amaxa装 置(Lonza Walkersville Inc.，Walkersville，MD)的电穿孔杯中；并且使用预设定 的程序X-001将DNA电穿孔进入细胞。电穿孔之后，将细胞悬浮液立即转移 至6-孔塑料微孔板的孔中的预温的(37℃)Mab培养基(SAFC Biosciences， Lenexa，Kansas)中。在不摇动的情况下将细胞在设定至37℃，5％CO₂和95％ 湿度的增湿孵育箱中孵育。

在培养大约48小时后，将每一电穿孔反应从6-孔微孔板移入到125培养瓶 中，培养瓶中具有20ml包含合适的一种或多种抗生素的新鲜MAb培养基 (SAFC Bioscience，Lenexa，Kansas)：Geneticin/G418或者Zeocin分别以125 或者100μg/ml的终浓度使用；潮霉素以50μg/ml的终浓度使用)。然后将细胞 在不摇动情况下于37℃、5％CO₂和95％湿度下培养。7-10天后，将细胞适应 于在摇动情况下在PER-MAb培养基中生长并常规传代以制备转染细胞的多克 隆混合物。备选地，如例如Harlow，E and Lane，D.(1988).Antibodies：A  Laboratory Manual，第116-117页和第222-223页，Cold Spring Harbor Laboratory  Press，Cold Spring Harbor，NY中所述用选择的细胞制备有限稀释克隆。定期 检查克隆细胞的生长并最终移入到摇瓶中用于在PER-MAb培养基(Hyclone， Logan，UT)中作为悬浮细胞扩大和生长。

实施例3

测定法

FVIII：商品化的BDD-FVIII(a/k/a抗血友病因子(重组体))(Wyeth (现在为Pfizer Inc.的子公司，New York，NY))蛋白质用于标准物，用于开发使 用酶联免疫吸附测定(ELISA)的强大的线性测定法。结合至微孔板孔上的捕获抗 体是商品化的鼠单克隆抗体，即克隆GMA-012(R8B12)(Green Mountain  Antibodies，Inc.，Burlington，VT)，针对人FVIII的A2结构域；并且检测抗 体是商品化的生物素标记的绵羊多克隆抗体，即识别人FVIII的 SAF8C-APBIO(Affinity Biologicals，Ontario，加拿大)。在加入抗体之间对微孔 的洗涤在Tris-缓冲盐(TBS)，pH 7.5存在下进行。在405nm下通过比色法测定 通过链亲和素-碱性磷酸酶介导的pNpp底物分解。备选地，比色法FVIII单位 活性确定使用Beckman ACL Coagulation Analyzer根据生产商的说明书并使用 内部血浆校准对照或者通过Chromogenix Coatest SP4FVIII试剂盒(Diapharma  Group，Columbus，OH)使用BDD-FVIII标准开展。

vWF：研究级血浆来源vWF(Haemtech，Essex Junction，VT)用作ELISA测 定蛋白质含量的抗原标准。所使用的捕获抗体是商品化的抗人vWF蛋白质的鼠 单克隆抗体；对于检测使用HRP-缀合的山羊抗人vWF抗体。通过与酶底物四 甲基联苯胺孵育在450nm下开展比色测定。

对于重组的vWF-Fc融合蛋白质，使用相似的ELISA形式，例如通过固定 在微孔板上的A蛋白或者抗人Fc抗体捕获Fc区，然后取决于表达构建体，使 用结合vWF的D’D3、D’-A1或者D’-A3结构域的鼠抗人vWF多克隆抗体检 测。

实施例3

截断vWF-Fc多肽的表征

通过将0.2-1ml细胞上清液与20μl G蛋白珠孵育，免疫沉淀在PER.C6细 胞中表达的对应于截断vWF-Fc蛋白质(即D’D3-Fc、Pro-D’-D3-Fc、D’-A1-Fc、 Pro-D’-A1-Fc、D’-A3-Fc、Pro-D’-A3-Fc；表1)的重组多肽。通过离心收集珠子， 然后用Tris缓冲液洗涤。离心后的珠子悬浮于25μl Laemmli缓冲液中，并在加 载至4-12％梯度Bis-Tris PAGE凝胶上之前95℃加热10分钟。通过考马斯亮 蓝染色/脱色观察条带。

对于涉及共表达BDD-FVIII和pro-D’-A3-Fc融合蛋白或者将商品化的 BDD-FVIII，(Wyeth)与表达pro-D’-D3-Fc的PER.C6细胞上清液混合 的实验，从亲和柱上洗脱的样品在还原性变性7％NuPAGE Tris-乙酸盐聚丙烯 酰胺凝胶上电泳分离，用考马斯蓝染料染色，脱色并拍照用于与在同一凝胶上 运行的已知分子量标准比较。

序列分析

重组多肽通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离并印迹在PVDF膜上；通过 快速丽春红S染色和脱色显示蛋白质条带，从膜上切下以进行Edman降解 (AIBioTech，Richmond VA)得到N-末端序列信息。所得到的氨基末端序列与来 自成熟vWF N-末端的序列或者来自条带中所出现预期代表不完全加工vWF产 物的N-末端前肽序列的序列对齐。

BDD-FVIII和截断vWF-Fc蛋白质的体外结合

一旦选择并扩增表达D’-D3-Fc、Pro-D’-D3-Fc、D’-A1-Fc、Pro-D’-A1-Fc、 D’-A3-Fc和Pro-D’-A3-Fc蛋白质的细胞，将细胞上清液样品净化并加入至活跃 生长的BDD-078细胞中(表达B-结构域-缺失FVIII的哺乳动物细胞克隆)。 BDD-078细胞以12.5×10⁶个细胞/ml与来自以用于表达截断的vWF-Fc融合蛋 白(即D’-D3-Fc、Pro-D’-D3-Fc、D’-A1-Fc、Pro-D’-A1-Fc、D’-A3-Fc、Pro-D’-A3-Fc) 的质粒构建体转染的细胞的PER.C6细胞上清液一起接种。对于“BDD对照”， 条件培养基被替换。如所述，将细胞于37℃下摇动生长2天。在该点时，取出 等分试样，离心并测试上清液的FVIII活性以及FVIII和vWF抗原。仅FVIII 活性示于图8中。虚线表示比未加入vWF-Fc蛋白质的对照BDD-FVIII的增加。

在正常条件下，从BDD-078细胞表达的BDD-FVIII表现出被细胞分解代 谢或者隔离(Kalind等，J.Biotechnology，147：198-204(2010))。然而，加入血 浆来源的vWF蛋白质，或者表达截断vWF-Fc融合蛋白质之一的细胞上清液， 导致更高地恢复FVIII活性，表明对保护FVIII不被生长细胞吸收或代谢具有保 护性作用。该结果表明，截断的vWF-Fc融合蛋白可以起作用以增加培养基中 的FVIII产率。在与所表达的FVIII于37℃培养2天后，取出等分试样并评价 FVIII活性的积累。观察到恢复的FVIII活性相当大的增加(图8)。

多聚体分析

通过在非还原性1.6或2％高熔点温度(HGT-P)琼脂糖凝胶上进行电泳分析， 来评价血浆来源vWF(pd-vWF)和重组多肽形成高分子量复合体的能力(根据 Raines等，Thrombosis Res.，60：201-212(1990)修改)。血浆来源FVIII (Koate-)用作评价vWF-Fc多聚体的电泳标准。在iBlot装置上(Invitrogen  Corp.，Rockville，MD)通过半干印迹方法将蛋白质转移至硝酸纤维素纸上并使 用SuperBlock溶液(Pierce，Rockford，IL)封闭。样品与兔抗人vWF多克隆抗 体(Abcam目录号ab6994)孵育，然后与碱性磷酸酶-缀合的山羊抗兔IgG F(ab′)2 片段(目录号A3937；Sigma)孵育；通过与Western Blue溶液(Invitrogen Corp.， Carlsbad，CA)孵育检测条带。在蒸馏水中洗涤以终止反应；并在BioRad分子 显像仪上使用ChemiDoc XRS+显像系统(Bio-Rad Laboratories Hercules，CA)将 条带显色。结果示于图9中。

在A蛋白上的蛋白质纯化和层析

通过以2,500×g 7分钟，然后2,500×g 11分钟的三联离心和分离从表达 BDD-FVIII和pro-D’-A3-Fc蛋白质的细胞培养物制备清亮上清液。然后将上清 液通过Sartobran 150厚度过滤器(0.45μm)过滤，然后通过0.2μm醋酸纤维素过 滤器(#5231307-H4-00)(Sartorius Stedim Stedim Biotech S.A.，Aubagne，法国)过 滤。预先使用泵将过滤器用100-200ml的20mM Tris，pH 7.0浸湿，然后加入 细胞上清液，最后加满大约25ml的20mM Tris，pH 7.0。最终的滤液是两倍稀 释的细胞上清液并且是用于柱层析的物质。滤过的上清液应用至AKTA  Explorer层析系统(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上的5或10ml Protein  A-HiTrap柱上(part 17-1403-01)(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。系统管道用 20mM Tris，pH 7.0预冲洗，并且A蛋白柱用5倍柱体积的20mM Tris，pH 7.0 洗涤以保证在向柱子应用样品前具有稳定的基线。滤过的样品以5ml/分钟通过 柱并收集洗脱物作为“流过液”。一旦加载了所有物质，用5倍柱体积的20mM Tris，pH 7.0额外洗涤A蛋白-HiTrap柱直到达到稳定的基线。在该点时，用4 倍柱体积的包含0.1M CaCl₂的20mM Tris，pH 7.0洗涤柱并收集洗脱的物质。 然后用包含0.3M CaCl₂的20mM Tris，pH 7.0洗脱与截断vWF-Fc融合蛋白结 合的VIII因子直到级分被洗脱(大约3倍柱体积)。然后用额外5倍柱体积的 20mM Tris，pH 7.0洗涤柱。通过加入250mM甘氨酸，150mM NaCl，pH 3.9 将仍然与A蛋白结合的截断vWF-Fc蛋白质从柱上洗下来。备选的洗脱方法描 述于例如Arakawa等，Prot.Expr.Purif.，63：158-163(2009)中。将从A蛋白 -HiTrap柱收集的所有样品保存，使用显色和/或凝集分析法(上述)测试VIII因 子活性并且制备等分试样用于SDS-PAGE电泳。在一些情况下，例如检测到 FVIII峰活性时，蛋白质加载在用25ml的目的FVIII储存缓冲液预洗涤的PDl0 柱上(GE Healthcare 45000148)。然后将2.5ml的洗脱的BDD-FVIII应用在每一 柱上并且用3.5ml FVIII储存缓冲液洗脱经脱盐的BDD-FVIII。然后将蛋白质置 于-80℃下长期储存；并且在一些情况下加入血清白蛋白至10mg/ml。

从pro-D’-A3-Fc/FVIII结合复合体纯化FVIII

为了确定截断的vWF-Fc多肽是否能够结合FVIII，将共表达BDD-FVIII 和pro-D’-A3-Fc的细胞在具有125μg/ml新霉素和125μg/ml博来霉素的 PER-MAb培养基中生长5天。基本上如上所述制备上清液并进行色谱分析。在 洗脱过程中的不同时间点，保存样品并进行电泳(图10)。在图10A中，显示了 在将10ml的BDD-FVIII/proD’A3-Fc PER.C6细胞上清液加载在5ml HiTrap A 蛋白柱上之后，用不同缓冲液条件洗脱的色谱迹线峰(峰5是洗涤步骤，峰6是 0.1M CaCl₂之后的洗脱物，峰7是0.3M CaCl₂洗涤后的FVIII洗脱物，峰8是 l M CaCl₂洗涤后的洗脱物，峰9是低盐洗涤，并且峰10是用柠檬酸盐，pH 5.5 从柱上洗脱下来的洗脱物)。图10B显示洗脱样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳道 1-9分别表示，(1)原材料，(2)流过物，(3)0.1M CaCl₂洗脱物，(4)0.3M CaCl₂洗脱物，(5)pH 5.5柠檬酸盐洗脱物，(6)浓缩的BDD-FVIII制备物，(7)分子 量标准(大小在右侧)，(8)来自表达pro-D’-A3-Fc的PER.C6细胞的细胞上清 液，(9)商品化的BDD-FVIII星号显示170、90和80kd的三条带， 分别对应于全长BDD-FVIII、重链和轻链(一个或多个)。

靠近泳道5和8中条带的点显示对于包含前肽的proD’-A3-Fc和成熟 proD’-A3-Fc蛋白质的预期迁移大小(分别是较高和较低分子量)。

在A蛋白基质上捕获与pro-D’A3-Fc结合的基本上纯的BDD-FVIII部分。 在0.3M CaCl₂洗脱步骤从vWF-Fc基质分离和洗脱前，复合体对洗涤条件是稳 定性的(图10A，峰7；和图10B，泳道4)。pro-D’-A3-Fc蛋白质本身仅通过在 包括酸性pH 3.9在内的更加苛刻的洗涤条件下从基质上洗脱可见(图10A，峰 10；和图10B，泳道5)。通过pH 3.9洗涤洗脱的蛋白质与先前制备并鉴定为真 正的截断pro-D’-A3-Fc分子的一组蛋白质共迁移(图10B，泳道8)。

从D’-D3-Fc结合复合体纯化FVIII

将10ml包含所表达的pro-D’-D3-Fc蛋白质的PER.C6细胞上清液溶液(图 11，泳道2)加入至250单位商品化的BDD-FVIII(泳道3)中并于37 ℃孵育4小时(泳道4和5)。混合物用20mM Tris-HCl，pH 7.0进行两倍稀释并 应用在1ml A蛋白-HiTrap柱上，基本上如上面对于从pro-D’-A3-Fc复合体纯 化FVIII所述和图10中所示。用20mM Tris-HCl，pH 7.0将未结合的蛋白质从 柱上洗涤下来(泳道6)。很明显保留了与pro-D’-D3蛋白质复合的FVIII，如在 图11，泳道6中观察到缺乏FVIII和/或vWF-Fc多肽(与泳道7相比)，然后是 用0.3M CaCl₂对FVIII的大量洗脱(泳道7)；这与从FVIII/pro-D’-A3-Fc复合体 洗脱的FVIII(图10B，泳道4)相比很好。代表着截断vWF-Fc的保留的多肽用 低pH缓冲液，0.1M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 3.9洗脱(图11，泳道8)。泳 道3中与大约170、90和80kd的蛋白质条带对齐的3个星号分别对应于全长 BDD-FVIII、重链和轻链(一个或多个)。来自pro-D’D3-Fc/FVIII纯化的结果表 明加入pro-D’D3-Fc与FVIII导致捕获、保留和随后特异性洗脱FVIII，结果实 际上与图10中看到的那些结果相同。

药物代谢动力学

结合至FVIII或者作为天然蛋白质的纯化的重组vWF-Fc融合蛋白，在磷 酸盐缓冲盐中以大约5μg/小鼠的量与稳定剂如白蛋白一起，静脉内注射入小鼠 尾静脉内。作为对照品，同样地注射含/不含vWF的FVIII并评价动物中的清除 率。5至8只动物(或者是野生型的，或者由于FVIII或vWF或者两者的遗传缺 陷而具有血友病)用于检查失血。在注射后的不同时间点(例如0分钟、3分钟、 15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时)，处死 动物，经下腔静脉抽取血液，并且制备血浆并冷冻。然后取决于动物的遗传背 景，分别通过ELISA和/或显色或凝集分析法评价血浆样品的抗原和/或功能活 性。通过对抗原和/或活性相对于时间进行药物代谢动力学分析(例如由Mordenti 等，Toxicol.Appl.Pharmacol.，137：75-78(1996)和Lenting等，J.Biol.Chem.， 279：12102-12109(2004)所述，每一参考文献关于药物代谢动力学分析的教导整 合入本文中)，并且通过与对照品进行比较确定血浆清除率。