一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法

摘要

本发明公开了一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法。包括先将菌株活化，初级培养，次级培养，再将发酵液抽滤，菌丝体干燥，研磨，有机溶剂浸泡，旋蒸得浸膏，少量有机溶剂溶解浸膏上200～300目硅胶柱，以石油醚:丙酮体积比=50:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=20:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿洗出，自然挥干，甲醇重结晶得赭色小莫勒菌中的杜斯塔宁。本发明原料取材简单；提取步骤简单，成本低；制得的化合物纯度高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法。 

 背景技术

      赭色小莫勒菌（Moelleriella ochracea）为子囊菌门、分菌纲、肉座菌目、麦角菌科、莫勒菌属，它是粉虱的重要病原真菌，以往充分利用其对粉虱的自然控制作用，在生物防治方面取得了显著效果，随着对该菌研究的全面深入，人们已从其代谢产物中分离、纯化出一些有活性的物质，如杜斯塔宁，其分子式C₃₀H₅₀O₂，分子量444，是三萜类五元碳环物质，具有抗结核杆菌的作用，IC₅₀=12.5ug/ml，可见，莫勒菌在医学上具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的是公开一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法，以促进其药理学的进一步研究和临床上更好的开发和应用。 

本发明采取的技术方案如下： 

一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法，包括以下步骤：

1）赭色小莫勒菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在120～160r/min、20～28℃条件下连续培养5～10天即初级培养，按8％～10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120～160r/min、20～28℃条件下连续培养25～30天即次级培养；

2）将菌液和菌丝体分离，菌丝体在28-35℃下干燥后研磨成粉状，加1～2倍体积的乙酸乙酯浸泡10～14小时，超声20～40分钟，浸泡液旋蒸得菌丝体浸膏，回收乙酸乙酯；菌液用乙酸乙酯萃取，萃取液旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯；

3）将菌丝体浸膏和菌液浸膏合并，上200～300目硅胶柱，以石油醚和丙酮梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=20:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿溶解，溶解液自然挥干，再经甲醇重结晶得杜斯塔宁。

所述菌液用乙酸乙酯萃取具体操作为：将菌液与乙酸乙酯按体积比1：1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取20～40min，静止12～24小时，萃取1-3次。 

所述超声的功率为300～500W，频率为30～40KHz。 

所述PDB培养基的制备为：200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。 

本发明的显著优点： 

1）            原料取材简单；

2）            提取步骤简单，成本低；

3）            制得的化合物纯度高。

附图说明

图1为提取的杜斯塔宁的纯度验证图。 

具体实施方式

实施例1

1） 取赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）为材料，无菌条件下挑取长宽约为1cm的菌块到PDB培养基（200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121℃高压下灭菌25min）中，在160r/min、25℃条件下连续培养8天即初级培养，按9％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养；

2)          将菌液和菌丝体分开，菌丝体在室温下干燥之后研磨成粉状，加2倍体积（w/v）的乙酸乙酯浸泡12小时，超声30分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积1：1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取30min，静止16小时，倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯。

3)            合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，上200目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=50-10:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=20:1部分洗脱液。旋蒸浓缩，氯仿溶解洗出，自然挥干，甲醇重结晶得赭色小莫勒菌中的杜斯塔宁。 

4)                      杜斯塔宁的纯度通过点硅胶板来验证，如图1所示。展开剂为甲醇：二氯甲烷体积比=1:20，R_f=0.43，据文献（Isaka M, Hywel-Jones NL, Sappan M, Mongkolsamrit S, Saidaengkham S. Hopane triterpenes as chemotaxonomic markers for the scale insect pathogens Hypocrella s. lat. and Aschersonia. Mycological Research, 2009,113(4):491-497）可以确定得到的纯度为99%的杜斯塔宁。 

提取率：3.23%（提取率%=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量×100%）。 

实施例2

1） 取赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）为材料，无菌条件下挑取长宽约为1cm的菌块到PDB培养基（200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121℃高压下灭菌25min）中，在120r/min、20℃条件下连续培养5天即初级培养，按8％％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120r/min、20℃条件下连续培养25天即次级培养；

5)          将菌液和菌丝体分开，菌丝体在室温下干燥之后研磨成粉状，加1倍体积（w/v）的乙酸乙酯浸泡10小时，超声20分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积1：1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取20min，静止12小时，倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯。

6)            合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，上200目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=50-10:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=20:1部分洗脱液。旋蒸浓缩，氯仿溶解洗出，自然挥干，甲醇重结晶得赭色小莫勒菌中的杜斯塔宁。 

7)                      得到纯度为99%的杜斯塔宁。 

提取率：3. 01%（提取率%=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量×100%）。 

实施例3

1） 取赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）为材料，无菌条件下挑取长宽约为1cm的菌块到PDB培养基（200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121℃高压下灭菌25min）中，在160r/min、28℃条件下连续培养10天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、28℃条件下连续培养30天即次级培养；

8)          将菌液和菌丝体分开，菌丝体在室温下干燥之后研磨成粉状，加2倍体积（w/v）的乙酸乙酯浸泡14小时，超声40分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积1：1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取40min，静止24小时，倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯。

9)            合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，上300目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=50-1:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=20:1部分洗脱液。旋蒸浓缩，氯仿溶解洗出，自然挥干，甲醇重结晶得赭色小莫勒菌中的杜斯塔宁。 

10)                  得到纯度为99%的杜斯塔宁。 

提取率：3.14%（提取率%=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量×100%）。 

对比实施例1

  培养基用沙氏培养基，其配方：蛋白胨 10.0 g，葡萄糖 40.0 g，混匀后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100 ml，在121℃高压下灭菌20 min，其它步骤同实施例1。

提取率：1.52%（提取率%=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量×100%）。 

    对比实施例2

  培养基用M102培养基，其配方：蔗糖 30g，麦芽提取物 20 g，蛋白胨 2.0 g，酵母提取物 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO₄ 0.5 g，KH₂PO₄ 0.5 g，混匀后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121℃高压下灭菌20min，其它步骤同实施例1。

提取率：1.78%（提取率%=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量×100%）。