法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-07-30
授权
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2013-01-30
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K38/16 申请日:20110401
实质审查的生效
2012-12-12
公开
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相关申请的交叉引用
本申请是基于2011年4月1日递交的PCT/KR2011/002300按 照35U.S.C 371美国国家阶段申请，并要求2010年4月1日递交的 韩国专利申请No.10-2010-0030004的优先权，其内容以引用的方式 全部并入本文中。
发明背景
1.技术领域
本发明涉及含有TIP41表达或活性抑制剂的用于增强TRAIL敏 感性的组合物。
2.背景技术
癌症是对人类社会威胁最大的疾病；其由细胞系突变产生，细 胞系突变导致这些细胞失控、无限分裂和永生。癌症的原因包括外 部或环境因素如化学品、病毒、细菌和电离辐射，以及内部因素如 先天性基因突变(Klaunig & Kamendulis,药理学与毒理学年评 (Annu Rev Pharmacol Toxicol.),44:239-267,2004)。
早期发现癌症有可能通过手术、放射疗法和化学疗法治愈；但 是它们的副作用也大大显现出来，晚期癌症和转移性癌症患者最后 身患任何特别治疗都无法治愈的终期病患而结束生命。随之也发展 出各种与癌症及其治疗有关的生化机理，至今还没有彻底治愈癌症 的办法。
TRAIL(TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TNF Related apoptosis Inducing Ligand))是与TNF(肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor)) 家族有关的细胞因子，其通过激活死亡受体途径作为诱导细胞凋亡 的配体起作用。TRAIL有4种受体。其中已知DR 4/5(死亡受体4/5) 在癌细胞系中过表达，据报道DcR 1/2(诱捕受体1/2)存在于正常细 胞系中。与其他受体不同，诱捕受体的c-末端没有死亡域，因此， 死亡信号未传导到细胞内。因此，使用TRAIL进行癌症治疗被认为 是对正常细胞无副作用的下一代抗癌剂。
迄今为止研发的许多抗癌剂和抑癌剂已报道有副作用，如由于 其非特异性而对正常细胞的临界细胞毒性，以及由于高突变率癌细 胞系产生的获得性抵抗力。然而，由于1997年已报道TRAIL可诱 导癌细胞而非正常细胞的细胞凋亡，TRAIL被认为是新抗癌药，其 对癌细胞系具有特异性，也对其他对于癌症药物有抗性的癌细胞有 特异性。但是，一些癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、肺癌、 肝癌和脑瘤表现出TRAIL抗性性，也有报道连续使用TRAIL处理 癌细胞系导致癌细胞对TRAIL产生获得性抵抗力，甚至对于那些对 TRAIL敏感的细胞来说，也是如此。
TRAIL抗性机制可能是由于细胞内细胞凋亡信号转导的抑制而 产生的，而由于诱捕受体的过表达，DR 4/5、DcR 1和DcR 2，尤其 是由于细胞内信号系统变化导致的抵抗力获得被认为是更加合理的 解释。已知信号转导变化的主要原因是抗凋亡蛋白的过表达，这抑 制了促凋亡蛋白的作用。因此，当前亟需的研究领域是开发通过克 服TRAIL抗性来增加癌细胞系特异性细胞凋亡的TRAIL敏化剂。
已报道TRAIL-介导的细胞死亡途径在如下疾病中起着重要的 作用，包括风湿性关节炎、糖尿病性肾病和退行性脑病以及癌症(韩 国风湿病学会杂志(Journal of Korean Colledge of Rheumatology) 2005年6月第2期，第12卷；J AM Sco Nephrol 19:904-914(2008); 细胞死亡和分化(Cell Death Differ.)2003年1月，10(1):134-41)。因 而很多方法采用TRAIL通过诱导过表达的免疫细胞的死亡来缓解和 治疗自身免疫性疾病症状包括关节炎。因此，TRAIL不仅可有效地 用于治疗上述各种癌症，也可有效用于治疗T细胞介导的自身免疫 性疾病包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、风湿性关节炎和I型 糖尿病。
TIP41基因，也称为TIPRL(TOR信号转导途径调控因子样(TOR Signaling Pathway Regulator-Like))，其首先分离自酵母。已知TIP41 蛋白是TOR信号转导系统的负调控因子，其通过与TAP42蛋白相 互作用而与雷帕霉素(rapamycin)反应(Jacinto E等人，分子细胞(Mol cell)8(5):1017-26,2001)。人TIP41基因与酵母TIP41具有37%同 源性，已知其激活MAPK和NF-κB的信号转导系统(MatsudaA等人， 致癌基因(Oncogene),22(21):3307-3318,2003)。与酵母Tip41不同， 预期人TIP41激活细胞的增殖，至今未见报道人TIP41基因在关于 肝癌、胃癌或癌症发生方面的作用。
因此，本发明人通过证明使用siRNA(小干扰RNA)对抗TIP41， 通过TRAIL处理和TIP41消耗使得在TRAIL抗性癌细胞中的细胞 凋亡显著增加，从而完成了该研究。另外，不仅在表现出TRAIL抗 性的肝癌细胞中，也在表现出TRAIL抗性的肺癌细胞和结直肠癌细 胞中观察到细胞凋亡的诱导。此外，其效果也通过注射了抗TIP41 siRNA以及TRAIL的小鼠中肿瘤变小而证实。
发明概述
本发明提供含有TIP41蛋白表达或活性抑制剂的用于增强 TRAIL敏感性的组合物。
为实现该目的，本发明提供含有TIP41蛋白表达或活性抑制剂 的用于增强TRAIL敏感性的组合物。
本发明还提供含有TIP41蛋白表达或活性抑制剂的抗癌助剂。
本发明还提供含有本发明抗癌助剂、用于预防和治疗癌症的组 合物。
本发明还提供预防或治疗癌症的组合物的筛选方法。本发明还 提供增强癌症对TRAIL的敏感性的方法，其包括将药学上有效量的 TIP41蛋白表达或活性抑制剂施用于患有TRAIL介导的细胞凋亡相 关疾病的对象的步骤。
本发明还提供预防癌症的方法，其包括将药学上有效量的TIP41 蛋白表达或活性抑制剂施用于对象的步骤。
本发明还提供治疗癌症的方法，其包括将药学上有效量的TIP41 蛋白表达或活性抑制剂施用于罹患癌症的对象的步骤。
本发明还提供TIP41蛋白表达或活性抑制剂，其用于在治疗 TRAIL介导的细胞凋亡相关疾病期间增强TRAIL敏感性。
此外，本发明提供用作抗癌助剂的TIP41蛋白表达或活性抑制 剂。
当用TIP41 siRNA处理表现出TRAIL抗性的肝癌细胞系以抑制 TIP41的表达后，用TRAIL处理，则诱导出癌细胞系的特异性细胞 凋亡。同样的效果不仅在肝癌中、也在具有TRAIL抗性的肺癌和结 肠癌中发现。另外，TIP41表达的消耗和TRAIL处理减小了注射有 肿瘤细胞的裸鼠肿瘤大小。总之，本发明的含有TIP41表达或活性 抑制剂的组合物可用于增强TRAIL敏感性或用作抗癌助剂。
附图说明
参照所附的附图可最佳地理解本发明优选实施方案的应用，其 中：
图1显示TIP41在肝癌组织中表达增强，并证明了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中然后用TRAIL处理，对TIP41的 抑制：
图1A显示TIP41在肝癌组织中表达增强；
图1B显示通过蛋白质印迹法(Western Blot)分析，不考虑HBV 感染，与周围正常细胞中的TIP41相比，TIP41在肝癌组织中表达 增强的水平；
图1C显示通过将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中然后 用TRAIL处理，对TIP41表达的抑制；
si-cont：对照组siRNA；和
si-TIP41：TIP41siRNA。
图2所示确认了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中， 然后用TRAIL处理，所诱导的癌细胞的细胞凋亡：
图2A所示为将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后 以与时间相关的方式用TRAIL处理，通过核染色质染色法显示的癌 细胞的细胞凋亡；
si-cont：对照组siRNA；
si-1017：TIP41 siRNA;
图2B所示为将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后 以与时间相关的方式用TRAIL处理，采用膜联蛋白V-FITc/PI染色 法进行FACS(荧光活化细胞分选器)分析；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；
图2C所示为将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后 以与浓度相关的方式用TRAIL处理，采用膜联蛋白V-FITc/PI染色 法进行FACS(荧光活化细胞分选器)分析；
si-cont：对照组siRNA；和
si-TIP41：TIP41 siRNA。
图3所示确认了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中， 然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，促凋亡蛋白对癌细胞的细 胞凋亡的激活作用：
图3A所示确认了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中， 然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，半胱天冬酶(caspase)-3、 -8、-9和PARP(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)的激活作用：
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA;
图3B所示确认了将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中， 然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，细胞色素C释放至细胞液 中：
si-cont：对照组siRNA；和
si-TIP41：TIP41 siRNA。
图4显示JNK(Jun氨基末端激酶)途径与接受TIP41 siRNA和 TRAIL处理的Huh7肝癌细胞的细胞凋亡相关联：
图4A显示将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞系中，然后以 与时间相关的方式用TRAIL处理，JNK途径的激活作用：
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；
图4B显示JNK抑制剂处理减少了接受TIP41消耗和TRAIL处 理的Huh7肝癌细胞的细胞凋亡；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；
对照溶剂(Vehicle)：0.3%的二甲亚砜(DMSO)；和
SP600125:JNK抑制剂。
图5所示表明TIP41siRNA和TRAIL处理所诱导的Huh7肝癌 细胞的细胞凋亡与p53信号转导途径无关：
图5A显示接受TIP41 siRNA和TRAIL处理的Huh7肝癌细胞 细胞凋亡的诱导与p53信号转导途径无关；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；和
图5B所示表明TIP41消耗和TRAIL处理所诱导的细胞凋亡与 p53的存在无关。
图6显示TIP41消耗和TRAIL受体之间并无关联：
图6A显示TRAIL受体在各种细胞系中的表达水平；
图6B显示接受TIP41消耗和TRAIL的Huh7肝癌细胞系中 TRAIL受体的表达水平；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；和
图6C显示TRAIL受体的表达水平取决于肝癌组织的时期。
图7显示TIP41消耗和TRAIL处理无法诱导正常HAEC(人主 动脉内皮细胞)细胞中的大量细胞死亡：
图7A显示在接受与时间相关方式的TIP41消耗和TRAIL处理 的HAEC细胞中，未观察到显著的细胞凋亡的诱导；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；
图7B显示在接受与时间相关方式的TIP41消耗和TRAIL处理 的HAEC中，细胞凋亡与促凋亡蛋白裂解没有关联；
si-cont：对照组siRNA；和
si-TIP41：TIP41 siRNA。
图8显示在接受TIP41消耗和TRAIL处理的肺癌、结直肠癌和 肝癌细胞系中细胞凋亡增加：
图8A显示与对照组siRNA相比，将TIP41 siRNA转染至A549 肺癌细胞，然后以与时间相关的方式用TRAIL处理，所诱导的细胞 凋亡增加；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；
图8B显示与对照组siRNA相比，将TIP41 siRNA转染至A549 肺癌细胞，然后以与浓度或时间相关的方式用TRAIL处理，所诱导 的细胞凋亡增加；
si-cont：对照组siRNA；和
si-TIP41：TIP41 siRNA。
图8C显示与对照组siRNA相比，将TIP41 siRNA转染至 HepG2、SK-Hep1肝癌细胞，然后以与时间相关的方式用TRAIL处 理，所诱导的细胞凋亡增加；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；
图9所示为通过动物实验确认TIP41的抗细胞凋亡作用：
图9A显示裸鼠移植了癌细胞，然后注射TIP41 siRNA和 TRAIL，其肿瘤减小了；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；
图9B所示为通过对裸鼠肿瘤染色显示的细胞的细胞凋亡；
si-cont：对照组siRNA；
si-TIP41：TIP41 siRNA；和
图9C所示为对溶解的裸鼠肿瘤细胞采用蛋白质印迹法显示半 胱天冬酶-8蛋白的活性与细胞凋亡有关。
图10显示TIP41和PP2Ac之间的相互作用；
图10A显示在PP2Ac过表达后，用蛋白质印迹法对TIP41和 PP2Ac之间相互作用进行分析的结果；以及
图10B所示确认了TIP41和PP2Ac复合体(complex)之间，以及 TIP41和MKK7之间的相互作用。
图11所示确认了TIP41和PP2Ac复合体之间，以及TIP41和 MKK7之间的相互作用：
图11A所示确认了MKK7过表达后，TIP41和PP2Ac复合体之 间，以及TIP41和MKK7之间的相互作用；
图11B所示为采用免疫沉淀反应法(immunoprecipitation procedure)确认了TIP41和PP2Ac复合体之间，以及TIP41和MKK7 之间的相互作用；以及
图11C所示确认了采用体外GST免疫沉淀反应法确认了TIP41、 PP2Ac复合体和MKK7之间的相互作用。
图12所示确认了TIP41与MKK7相互作用的结合位点：
图12A显示制备的用于确认TIP41与MKK7相互作用结合位点 的TIP41片段；以及
图12B采用蛋白质印迹法显示的TIP41与MKK7相互作用的结 合位点。
图13所示确认了MKK7与TIP41相互作用的结合位点：
图13A显示制备的用于确认MKK7与TIP41相互作用结合位点 的MKK7片段；以及
图13B为采用蛋白质印迹法显示的MKK7与TIP41相互作用的 结合位点。
图14所示为通过MKK7与TIP41相互作用确认的细胞凋亡途 径：
图14A所示确认对MKK7表达的抑制减少了细胞凋亡；
图14B所示表明一旦TIP41表达被抑制则MKK7/JNK途径被激 活；
si-cont：对照组siRNA；和
si-MKK7：MKK7 siRNA。
具体实施方式
参照附图和下列优选实施方案的详细描述，将更加清楚地理解 本发明的特点和优势。首先应注意的是，基于发明人可以恰当地定 义术语的概念以便最好地描述其发明这一原则，本发明所用的术语 和词语应视为与本发明的技术精神相对应的含义或概念。同样，应 当理解，对本发明涉及的熟知功能和结构的详细描述将被省略，以 免不必要地模糊本发明的重点。
以下详细描述本发明。
本发明提供一种含有TIP41蛋白表达或活性抑制剂、用于增强 TRAIL敏感性的组合物。
优选所述TIP41蛋白具有如SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列， 但不限于此。
优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为TRAIL敏化剂，但不 限于此。
优选所述TIP41表达抑制剂选自下组之一：互补结合TIP41基 因mRNA的反义核苷酸、抗TIP41的小干扰RNA(siRNA)、短发夹 RNA，但不限于此。
优选所述TIP41活性抑制剂选自下组之一：特异性结合TIP41 的化合物、肽、肽模拟物、配体、抗体和天然物质，但不限于此。
优选所述组合物用于使用TRAIL治疗癌症、炎症性疾病或自身 免疫性疾病。
优选所述癌症选自下组之一：肝癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌、 胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、膀胱癌、血癌、 胰腺癌和任何对TRAIL有抗性的癌症，但不限于此。
进一步地，优选所述炎症性疾病选自下组之一：皮肤炎、过敏 症、特异反应性、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃 体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、结肠炎、 痔疮、痛风、僵直性脊椎炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、 银屑病关节炎、退行性关节炎、风湿性关节炎、肩关节炎、腱炎、 肌腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综 合征、多发性硬化症以及急性和慢性炎症，但不限于此。
进一步地，优选所述自身免疫性疾病选自下组之一：风湿性关 节炎、多发性硬化症、重症肌无力、葛瑞夫兹病(Graves disease)、桥 本甲状腺炎、阿狄森病(Addison’s disease)、白癜风、全身性硬化症、 肺出血肾炎综合征、白塞病(Becet's disease)、克罗恩病、僵直性脊椎 炎、葡萄膜炎、血小板减少性紫癜、寻常性天疱疮、糖尿病、自身 免疫性贫血、冷球蛋白血症、肾上腺脑白质营养不良(ALD)和全身 性红斑狼疮(SLE)，但不限于此。
反义核苷酸
如沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对所定义，反义核苷酸与 DNA的互补碱基对、未成熟-mRNA或成熟-mRNA结合(杂交)，并 限制遗传信息从DNA向蛋白的流动。反义核苷酸特异性结合靶序列 的特点尤其使得其具有多种功能。由于反义核苷酸是单体单元的长 链，其能够很容地针对靶RNA序列进行合成。最近的研究证明，反 义核苷酸可作为研究靶蛋白的生化工具(Rothenberg等人，J.Natl. Cancer Inst.,81:1539-1544,1999)。在有些领域已经取得了重大进展， 包括表现出核酸酶抗性的寡核苷酸化学和核苷酸合成，改善的细胞 系粘附和靶标结合亲和力，因此，反义核苷酸的用途可以看作是一 种新型抑制剂。
肽模拟物
所述肽模拟物是抑制导致TIP41活化的TIP41结合域的肽或非 肽。非水解型肽类似物的主要残基包括β-转角二肽核(Nagai等人， 四面体通讯(Tetrahedron Lett)26:647,1985)，酮-亚甲基假肽基 (Ewenson等人，J Med chem 29:295,1986；以及Ewenson等人，肽： 结构和功能(Peptides:Structure and Function)(第9次美国肽学术会议 文集(Proceedings of the 9th AmeriCan Peptide Symposium))Pierce化 学公司，伊利诺伊州罗克兰(Rockland)，1985)，吖庚因(Huffman等 人，肽：化学和生物学(Peptides:Chemistry and Biology)，G.R.Marshall 编著，EScOM出版社，荷兰莱顿市(Leiden)，1988)，苯二氮(Freidinger 等人，肽：化学和生物学(Peptides:Chemistry and Biology)，G.R. Marshall编著，EScOM出版社，荷兰莱顿市(Leiden)，1988)，β-氨 基醇(Gordon等人，生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res commun)126:4191985)，以及取代的γ-内酰胺环(Garvey等人， 肽：化学和生物学(Peptides:Chemistry and Biology)，G.R.Marshall 编著，EScOM出版社，荷兰莱顿市(Leiden)，1988)。
siRNA分子
正义-RNA和反义-RNA形成双链RNA分子，优选正义-RNA 为siRNA，其部分包含与部分TIP41mRNA中的连续核苷酸靶序列 相同的核酸序列。优选抗TIP41的siRNA被设计为包括10-30碱基 对的正义序列和互补结合所述正义序列的反义序列，但其并不限于 此，也可以使用任何具有互补结合靶向TIP41基因碱基对的正义序 列的双链RNA分子。最优选与正义序列具有互补序列的反义序列。
抗体
对于TIP41抗体，可使用通过注射TIP41制备的抗体，也可以 使用市售的抗体。同样，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和 可结合抗原表位的片段。
多克隆抗体可通过将TIP41注射到动物体内，并通过抽血从动 物中采集含有抗体的血清的常规方法制备。所述多克隆抗体可使用 本领域熟知的任何方法纯化，也可以从任意的动物宿主如山羊、兔 子、绵羊、猴子、马、猪、牛或狗中制备。
单克隆抗体可使用只要通过连续细胞系培养可提供抗体分子生 产的任何技术来制备。尽管其不限于此，所述技术可包括杂交瘤、 人B-细胞杂交瘤和EBV杂交瘤(Kohler G等人，自然(Nature) 256:495-497,1975；Kozbor D等人，免疫方法杂志(J Immunol Methods) 81:31-42,1985；cote RJ等人，美国科学院院刊(Proc Natl ACad Sci) 80:2026-2030,1983；以及cole SP等人，分子细胞生物学(Mol cell Biol) 62:109-120,1984)。
可制备含有特异性结合TIP41的位点的抗体片段。例如，尽管 不限于此，F(ab’)2片段可用胃蛋白酶降解抗体分子制备，Fab片段 可通过还原F(ab’)2片段的二硫键桥来制备。作为另一方法，具有所 需特异性的单克隆Fab片段可通过减小Fab表达文库的大小来快速 且简易地分离(Huse WD等人，科学(Science)254:1275-1281,1989)。
为简化下列步骤如洗涤或分离复合体，所述抗体可结合至固体 基质。固体基质的实例包括合成树脂、硝化纤维、玻璃基质、金属 基质、玻璃纤维、微球和微珠。另外，合成树脂包括聚酯、聚氯乙 烯、聚苯乙烯、聚丙烯、PVDF和尼龙。
适体
适体是一种单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)，其本身具 有稳定的三维结构，可以高亲和力和特异性结合靶分子。由于第一 种适体发现技术的发展，即SELEX(指数富集配体系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)) (Ellington,AD和Szostak,JW.,自然(Nature)346:818-822,1990)，发 现了许多可结合各种靶分子如低分子量有机物质、肽和膜蛋白的适 体。由于适体具有独特的高亲和力(通常为pM水平)和对靶分子的特 异性，这一点与单克隆抗体相当，尤其是其用作替代性抗体的可能 性很高，因而适体通常被称为“化学抗体”。
在本发明的一个实验例中，通过免疫组织化学和蛋白质印迹法 确定了肝癌组织中TIP41蛋白的过表达。同样，在以TIP41siRNA 感染的肝癌细胞系中确定了TIP41蛋白消耗(参见图1)。
在本发明的一个实验例中，当用TIP41 siRNA处理Huh7肝癌 细胞后，以TRAIL处理各种不同的时间，确定的结果表明通过核染 色质染色和FACS分析法证实了细胞凋亡。另外，将TIP41 siRNA 转染至Huh7肝癌细胞系后，通过TRAIL以浓度-依赖的方式诱导细 胞凋亡，FACS分析结果证实与仅用TRAIL处理相比，在用TIP41 siRNA和TRAIL共处理的情况下，细胞凋亡进一步增加(参见图2)。
在本发明的一个实验例中，用TIP41 siRNA转染后，以时间- 依赖的方式用TRAIL处理Huh7肝癌细胞系，观察到蛋白激活与细 胞凋亡有关，尤其确定了半胱天冬酶-3、-8、-9和聚ADP核糖聚合 酶(PARP)。另外也确定了细胞色素C在细胞液中的表达，其表明的 事实为通过外在途径和内在途径的结合，在Huh7肝癌细胞系中发 生了由TRAIL和TIP41蛋白消耗导致的细胞凋亡(参见图3)。
在本发明的一个实验例中，将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌 细胞系中后，用TRAIL以时间-依赖的方式处理，然后确定了c-Jun N-末端激酶(JNK)转导途径的激活(activation)，由于在JNK抑制剂处 理的情况下确定了通过TRAIL和TIP41蛋白消耗的细胞凋亡减少， 通过这些发现证明JNK转导途径在TRAIL介导的通过TIP41消耗 的细胞凋亡中起着重要的作用(参见图4)。
在本发明的一个实验例中，为证明通过TIP41蛋白消耗，TRAIL- 诱导的细胞凋亡不会在正常细胞系中诱导细胞凋亡，而是特异性地 在癌细胞系中发生的事实，研究了在TIP41 siRNA和TRAIL-诱导的 细胞凋亡途径中p53蛋白的作用，并观察到在丝氨酸(ser)15和392 位的磷酸化。然而，在p53-缺陷的HCT116同基因的HCC细胞系中 TIP41消耗后，用TRAIL处理以诱导细胞凋亡，凋亡的细胞死亡得 以证实。这表明用TRAIL处理的TIP41消耗所诱导的细胞凋亡与 p53的存在无关(参见图5)。
在本发明的一个实验例中，确定在肝癌和肺癌细胞系中TRAIL 受体的转录水平的结果为，与正常细胞系相比TRAIL-R2(DR5)过表 达。另外，TIP41消耗后，同样地确定了肝癌细胞系中TRAIL受体 表达。这表明通过TIP41消耗的细胞凋亡增加并非由于TRAIL受体 表达的变化(参见图6)。
在本发明的一个实验例中，在正常细胞系中用TIP41 siRNA和 TRAIL处理后检验细胞凋亡，与TIP41 siRNA转染和TRAIL处理 有关的细胞凋亡没有变化，证明影响细胞凋亡的蛋白激活没有变化。 因此，siRNA TIP41转染后确定TRAIL介导的细胞凋亡特异性发生 于癌细胞(参见图7)。
在本发明的一个实验例中，用siRNA和TRAIL处理TRAIL-抗 性肺癌和结直肠癌细胞系，通过TIP41敲除确定细胞凋亡的诱导(参 见图8)。
在本发明的一个实验例中为了通过动物实验证明TIP41的功 能，将肝癌细胞系移植至裸鼠后，注射TIP41 siRNA和TRAIL，确 定了肿瘤大小的减小和细胞凋亡的诱导，与仅注射TRAIL相比，当 TIP41 siRNA和TRAIL一起注射时，与细胞凋亡有关的蛋白激活甚 至增强(参见图9)。
另外，为了确定TIP41作为TRAIL敏化剂诱导的细胞凋亡途径， 确定了MKK7与作为TIP41结合蛋白的PP2Ac成分，以及与PP2Ac 复合体之间的相互作用(参见图10和11)。
更具体地，为了确定结合TIP41的MKK7的结合位点，构建包 括各种MKK7区的片段，并确定结合位点(参见图12和13)。
而且，为了确定由TIP41消耗和TRAIL处理诱导的细胞凋亡途 径是否由于TIP41和MKK7之间的相互作用而减少，在Huh7肝癌 细胞系中实施MKK7敲除以及TIP41和TRAIL处理后，进行细胞 凋亡分析。在这种情况下观察到细胞凋亡的减少。
MKK7敲除明显减少了由TIP41消耗和TRAIL处理诱导的细胞 凋亡。此外，我们还检验了是否JNK激活与TIP41消耗和TRAIL- 诱导的细胞凋亡有关(参见图14)。
因此，当用TIP41 siRNA和TRAIL处理TRAIL-抗性肝癌细胞 系后，在TRAIL抗性癌细胞如肝癌、肺癌和结直肠癌中诱导了细胞 凋亡。另外，将TIP41 siRNA和TRAIL注射到人癌细胞系产生的异 种移植小鼠后，观察到癌症组织中肿瘤大小的减小和细胞凋亡的诱 导。因此，TIP41蛋白表达或TIP41活性抑制剂可有效地用作增强 TRAIL敏感性的组合物中的活性成分。
除了TIP41蛋白表达或活性抑制剂以外，所述组合物可含有一 种或多种具有相同或相似功能的活性成分。
所述组合物可口服或非肠道途径施用，在非肠道途径施用时， 其可进行腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉 内注射、子宫内注射(intrauterine dural injection)、脑血管内注射或胸 廓内注射，并可作为常规药物形式使用。
所述组合物可单独使用或与包括手术、放射治疗、激素治疗、 化学治疗和生物反应调节剂的方法联用。
所述组合物的日剂量为约0.0001g~100mg/kg，优选0.001g~10 mg/kg，且优选每天施用一次或分几次施用，其可变化范围取决于患 者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间和方法、排泄 速率和疾病严重度。
在实际的临床施用中，本发明所述组合物可作为各种非口服制 剂施用；配制时其可通过使用稀释剂或赋形剂制备，如填充剂、增 量剂(extender)、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。对于非肠 道制剂，其包括无菌溶液、疏水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干药物和 栓剂。对于疏水溶剂和悬浮溶剂，可使用植物油如丙二醇、聚乙二 醇和橄榄油及注射用酯如油酸乙酯。对于栓剂的基质可使用 witepsol(饱和脂肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、 月桂酸甘油酯(laurin)和甘油胶冻。
本发明还提供含有TIP41蛋白表达或活性抑制剂的抗癌助剂。
优选所述TIP41蛋白具有如SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列， 尽管其不限于此。
优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为TRAIL敏化剂，尽管 其不限于此。
优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为例如选自下组之一 (但不限于此)：互补结合TIP41基因mRNA的反义核苷酸、抗TIP41 的小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA，尽管其不限于此。
优选所述TIP41活性抑制剂选自下组之一：特异性结合TIP41 的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体和天然物质，但不限于此。
优选所述癌症选自下组之一：肝癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌、 胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、膀胱癌、血癌和 胰腺癌，以及任何具有TRAIL抗性的癌症，但不限于此。
进一步地，在所述抗癌助剂中，优选所述TIP41蛋白表达或活 性抑制剂增强TRAIL敏感性，但不限于此。
在本发明的一个实验例中，TIP41蛋白在肝癌组织中过表达(参 见图1)，与仅用TRAIL处理相比，当将TIP41 siRNA转染至Huh7肝 癌细胞系且用TRAIL以不同的时间段处理后，细胞凋亡增加更多(参 见图2)。另外，为了发现通过TIP41 siRNA和TRAIL诱导的细胞凋 亡途径，检测了半胱天冬酶-3、-8、-9和聚ADP核糖聚合酶以及JNK 转导途径相关蛋白和p53蛋白的活性，与仅用TRAIL处理相比，当 用TIP41 siRNA和TRAIL二者处理时细胞凋亡增加更多，其表现的 细胞凋亡被确定为癌细胞系特异性细胞凋亡(参见图3、4、5和7)。 另外当TIP41蛋白受到抑制，确定了TRAIL受体未发生变化(参见 图6)。此外，用TIP41 siRNA和TRAIL处理肝癌以外的也具有TRAIL 抗性的细胞系，确定了凋亡的细胞死亡(参见图8)。而且，与分别注 射TRAIL和TIP41 siRNA相比，共同注射TIP41 siRNA和TRAIL 时异种移植裸鼠的肿瘤大小减小了。另外，也观察到共同注射TIP41 siRNA和TRAIL时，细胞凋亡相关蛋白的激活和肿瘤组织中的细胞 凋亡最有效。
因此，当用TIP41 siRNA和TRAIL处理具有TRAIL-抗性的肝 癌细胞系时，在TRAIL抗性癌细胞如肝癌、肺癌和结直肠癌中诱导 了癌细胞系特异性细胞凋亡，且当将TIP41 siRNA和TRAIL注射到 异种移植小鼠模型中，其可有效诱导癌细胞的细胞凋亡并减小肿瘤 的大小，因此其可有效用作含有TIP41表达或活性抑制剂的抗癌助 剂。
除了TIP41表达或活性抑制剂以外，所述抗癌助剂可含有一种 或多种具有相同或相似功能的活性成分。
所述抗癌助剂可口服或非肠道途径施用，在非肠道途径施用时， 其可进行腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉 内注射、子宫内注射、脑血管内注射或胸廓内注射，并可作为常规 药物形式使用。
所述抗癌助剂可单独使用或与包括手术、放射治疗、激素治疗、 化学治疗和生物反应调节剂的方法联用。
所述抗癌助剂的日剂量为约0.0001g~100mg/kg，优选0.001g~10 mg/kg，且优选每天施用一次或分几次施用，其可变化范围取决于患 者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间和方法、排泄 速率和疾病严重度。
在实际的临床施用中，本发明所述抗癌助剂可作为各种非口服 制剂施用；配制时其可通过使用稀释剂或赋形剂制备，如填充剂、 增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。对于非肠道制剂， 其包括无菌溶液、疏水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干药物和栓剂。对 于疏水溶剂和悬浮溶剂，可使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄 油及注射用酯如油酸乙酯。对于栓剂的基质可使用witepsol(饱和脂 肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯和 甘油胶冻。
本发明还提供一种预防和治疗癌症的组合物，其包含本发明的 抗癌助剂。
在一个实施方案中，当本发明的TIP41蛋白表达或活性抑制剂 与TRAIL联用时，在各种具有TRAIL抗性的癌细胞系如肝癌、肺 癌和结直肠癌细胞系中，癌症特异性细胞凋亡比率增加。进一步地， 在植入癌细胞系的裸鼠模型中检测了本发明TIP41蛋白表达或活性 抑制剂的癌症特异性细胞凋亡体内效果。
因此，所述含有TIP41蛋白表达或活性抑制剂的抗癌助剂可用 作所述预防和治疗癌症的组合物的活性成分。
除了TIP41表达或活性抑制剂以外，所述组合物可含有一种或 多种具有相同或相似功能的活性成分。
所述组合物可口服或非肠道途径施用，在非肠道途径施用时， 可将所述组合物进行腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉内 注射、肌肉内注射、子宫内注射、脑血管内注射或胸廓内注射，并 可作为常规药物形式使用。
所述组合物可单独使用或与包括手术、放射治疗、激素治疗、 化学治疗和生物反应调节剂的方法联用。
所述组合物的日剂量为约0.0001g~100mg/kg，优选0.001g~10 mg/kg，且优选每天施用一次或分几次施用，其可变化范围取决于患 者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间和方法、排泄 速率和疾病严重度。
在实际的临床施用中，本发明所述组合物可作为各种非口服制 剂施用；配制时其可通过使用稀释剂或赋形剂制备，如填充剂、增 量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。对于非肠道制剂， 其包括无菌溶液、疏水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干药物和栓剂。对 于疏水溶剂和悬浮溶剂，可使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄 油及注射用酯如油酸乙酯。对于栓剂的基质可使用witepsol(饱和脂 肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯和 甘油胶冻。
本发明还提供一种筛选预防或治疗癌症的组合物的方法。
所述筛选预防或治疗癌症的组合物的方法，可优选包括：
1)用样品物质处理癌细胞系作为实验组；
2)测量步骤1）中TIP41与PP2Ac或TIP41与MKK7蛋白之 间的结合水平；以及
3)与未经步骤1）中样品物质处理的对照相比，筛选出降低步 骤2）中TIP41和PP2Ac或TIP41和MKK7蛋白之间结合水平的物 质，尽管其不限于此。
优选所述癌症选自下组之一：肝癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、 胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、结肠癌、血癌和 胰腺癌，更优选所述癌症为肝癌、肺癌或结直肠癌，但其并不限于 此；且优选包括具有TRAIL抗性的所有癌症，但其并不限于此。
在本发明的筛选预防或治疗癌症的组合物的方法中，优选步骤 2）中所述蛋白的结合水平以选自下组之一的方法测量：免疫沉淀反 应、ELISA、蛋白质印迹法、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)钓饵 (Pull-down)分析、蛋白质芯片、荧光共振能量转移(FRET)、双分子 荧光互补(BiFC)和酵母双杂交(Y2H)，但其并不限于此。
本发明还提供一种筛选预防或治疗癌症的组合物的方法。
所述筛选预防或治疗癌症的组合物的方法，可优选包括：
1)用样品物质处理癌细胞系作为实验组；
2)测量步骤1）中MKK7的活性；以及
3)与未经步骤1）中样品物质处理的对照相比，筛选出增加步 骤2）中MKK7活性的物质，但不限于此。
在本发明的筛选预防或治疗癌症的组合物的方法中，优选步骤 2）中所述MKK7蛋白的表达水平以选自下组之一的方法测量： RT-PCR、ELISA、免疫组织化学染色、蛋白质印迹法和FACS，但 其并不限于此。
优选所述癌症选自下组之一：肝癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、 胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、结肠癌、血癌和 胰腺癌，更优选所述癌症为肝癌、肺癌或结直肠癌，但其并不限于 此；且优选包括具有TRAIL抗性的所有癌症，但其并不限于此。
本发明还提供一种筛选预防或治疗癌症的组合物的方法。
所述筛选预防或治疗癌症的组合物的方法，可优选包括：
1)用样品物质处理癌细胞系作为实验组；
2)测量步骤1）中PP2Ac的表达水平；以及
3)与未经步骤1）中样品物质处理的对照相比，筛选出降低步 骤2）中PP2Ac蛋白表达水平的物质，尽管其不限于此。
在本发明的筛选预防或治疗癌症的组合物的方法中，优选步骤 2）中所述PP2Ac蛋白的表达水平以选自下组之一的方法测量：免 疫荧光、ELISA、质谱分析和蛋白质芯片，但其并不限于此。
优选所述癌症选自下组之一：肝癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、 胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、结肠癌、血癌和 胰腺癌，更优选所述癌症为肝癌、肺癌或结直肠癌，但其并不限于 此；且优选包括具有TRAIL抗性的所有癌症，但其并不限于此。
本发明还提供一种增强癌症对TRAIL敏感性的方法，其包括将 药学上有效量的TIP41蛋白表达或活性抑制剂施用于患有TRAIL介 导的细胞凋亡相关疾病对象的步骤。
优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为TRAIL敏化剂，但其 并不限于此。
优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂选自下组之一：互补结 合TIP41基因mRNA的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)和短发夹 RNA，但其并不限于此。
优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂选自下组之一：特异性 结合TIP41的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体和天然物质，但 其并不限于此。
所述TRAIL介导的细胞凋亡相关疾病为癌症、炎症性疾病或自 身免疫性疾病，但其并不限于此。
优选所述癌症选自下组之一：肝癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌、 胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、膀胱癌、血癌和 胰腺癌，但不限于此。
进一步地，优选所述炎症性疾病选自下组之一：皮肤炎、过敏 症、特异反应性、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃 体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、僵 直性脊椎炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、 退行性关节炎、风湿性关节炎、肩关节炎、腱炎、肌腱炎、腱鞘炎、 腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征、多发性硬化 症以及急性和慢性炎症，但不限于此。
进一步地，优选所述自身免疫性疾病选自下组之一：风湿性关 节炎、多发性硬化症、重症肌无力、葛瑞夫兹病、桥本甲状腺炎、 阿狄森病、白癜风、全身性硬化症、肺出血肾炎综合征、白塞病、 克罗恩病、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、血小板减少性紫癜、寻常性 天疱疮、糖尿病、自身免疫性贫血、冷球蛋白血症、肾上腺脑白质 营养不良(ALD)和全身性红斑狼疮(SLE)，但不限于此。
在一个实施方案中，当本发明的TIP41蛋白表达或活性抑制剂 与TRAIL联用时，在各种具有TRAIL抗性的癌细胞系如肝癌、肺 癌和结直肠癌细胞系中，癌症特异性细胞凋亡比率增加。进一步地， 在植入肿瘤的裸鼠模型中检测了本发明TIP41蛋白表达或活性抑制 剂的癌症特异性细胞凋亡体内效果。
因此，本发明的TIP41蛋白表达或活性抑制剂可有效地用于增 强TRAIL敏感性。
本发明还提供一种预防癌症的方法，其包括将药学上有效量的 TIP41蛋白表达或活性抑制剂施用到对象的步骤。
本发明还提供一种治疗癌症的方法，其包括将药学上有效量的 TIP41蛋白表达或活性抑制剂施用到患有癌症的对象的步骤。
优选所述对象为脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为包括小 鼠、兔、豚鼠、仓鼠、狗、猫的实验动物，最优选为包括黑猩猩或 大猩猩的类人猿动物。
所述药学上有效量的TIP41蛋白表达或活性抑制剂可根据各种 因素如给药方法、靶向部位或患者状况而变化。因此，所述施用量 在用于人体时应该考虑到稳定性和效率而恰当地确定。所述药学上 有效量的给药量也可在动物实验中估测然后调整用于人类。关于确 定药学上有效量的给药量要考虑的因素的信息，可参见Hardman和 Limbird编著，古德曼和吉尔曼的治疗学药物基础(Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第10版(2001), 珀盖蒙出版社(Pergamon Press)；以及E.W.Martin编著，雷明顿药物 科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版(1990)，麦克出 版公司(Mack Publishing Co.)。
根据一个实施方案，TIP41蛋白表达或活性抑制剂可包括通常 用于生物药物制剂中的载体、赋形剂、稀释剂，或上述两者或更多 的组合。所述药用载体没有严格的限制，条件是所述载体适合将 TIP41蛋白表达或活性抑制剂蛋白递送到体内。作为实例，所述载 体可包括在默克索引(Merck Index)，第13版，默克公司(Merck & Co. Inc)公开的化合物的混合物、盐溶液、无菌水、林格氏(Ringer's)溶液、 缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或上述一种或 以上的混合物。根据需要，所述载体可以和其他常用添加剂包括抗 氧化剂、缓冲液或抑真菌剂一起加入。进一步地，可另外加入稀释 剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以制备包括水溶液、悬 浮液或乳液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂的剂型。此外，可使用 已知方法或雷明顿药物科学(麦克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿， 第18版，1990)公开的方法根据疾病或成分而制备合适的剂型。
本发明TIP41蛋白表达或活性抑制剂可另外包括一种或多种具 有相同或相似功能的有效成分。相对于药物组合物的总重量，本发 明药物组合物包括0.0001~10wt%的所述蛋白，优选包括0.001~1wt% 的所述蛋白。
根据不同目的，本发明TIP41蛋白表达或活性抑制剂可为非经 口给药(如静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射或局部应用)或经口给 药。进一步地，所述给药量可根据患者的体重、年龄、性别、健康 状况、饮食、给药时间和方法、排泄速率和疾病严重度而变化。本 发明药物组合物每日给药量的范围为0.001μg~10mg/kg，优选为 0.01μg~10mg/kg，且优选将每日一次给药分为每日多次给药。
本发明还提供在治疗TRAIL介导的细胞凋亡相关疾病期间，用 于增强TRAIL敏感性的TIP41蛋白表达或活性抑制剂。
此外本发明提供用作抗癌助剂的TIP41蛋白表达或活性抑制 剂。
优选所述TIP41蛋白具有如SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列， 但不限于此。
优选所述TIP41蛋白表达或活性抑制剂为TRAIL敏化剂，但不 限于此。
优选所述TIP41表达抑制剂选自下组之一：互补结合TIP41基 因mRNA的反义核苷酸、抗TIP41的小干扰RNA(siRNA)、短发夹 RNA，但不限于此。
优选所述TIP41活性抑制剂选自下组之一：特异性结合TIP41 的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体和天然物质，但不限于此。
所述TRAIL介导的细胞凋亡相关疾病为癌症、炎症性疾病或自 身免疫性疾病，但不限于此。
优选所述癌症选自下组之一：肝癌、结肠癌、宫颈癌、肾癌、 胃癌、前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、肺癌、子宫癌、膀胱癌、血癌、 胰腺癌和具有TRAIL抗性的任何癌症，但不限于此。
进一步地，优选所述炎症性疾病选自下组之一：皮肤炎、过敏 症、特异反应性、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃 体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、僵 直性脊椎炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、 退行性关节炎、风湿性关节炎、肩关节炎、腱炎、肌腱炎、腱鞘炎、 腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征、多发性硬化 症以及急性和慢性炎症，但不限于此。
进一步地，优选所述自身免疫性疾病选自下组之一：风湿性关 节炎、多发性硬化症、重症肌无力、葛瑞夫兹病、桥本甲状腺炎、 阿狄森病、白癜风、全身性硬化症、肺出血肾炎综合征、白塞病、 克罗恩病、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、血小板减少性紫癜、寻常性 天疱疮、糖尿病、自身免疫性贫血、冷球蛋白血症、肾上腺脑白质 营养不良(ALD)和全身性红斑狼疮(SLE)，但不限于此。
以下将结合实验例和制备例详细描述本发明。然而，下列实验 例和制备例仅用于说明本发明的目的，本发明并不限于下列实验例 和制备例。
<实验例1>确认肝癌和肺癌组织中TIP41蛋白的表达
<1-1>用免疫染色确认TIP41表达
将肝癌患者的组织(忠南大学医学院，Kim,Jin-Man教授)用约 10%中性福尔马林溶液固定，加入石蜡并切成约5μm厚的切片。将 所述切片用约10mM的抗坏血酸缓冲液(pH6.0)处理约4分钟，置 于含有约3%过氧化氢(H2O2)的约0.1M Tris-缓冲盐溶液(TBS,pH7.4) 中约30分钟。将所述切片用蛋白封闭液(DAKO)于室温下处理约20 分钟，并与抗-TIP41抗体反应30分钟。用0.1M TBST(含有0.01% 吐温20的0.1M TBS)洗涤后，使所述切片与nVision抗兔聚合物 (DAKO)反应30分钟。通过与3,3-二氨基联苯胺(DAB)色原体基质溶 液(DAKO)反应可以观察到该过氧化物酶-结合抗体。在显微镜下观 察，适当染色后用0.1M TBS洗涤以结束反应，用奥林巴斯(Olympus) BX51显微镜(奥林巴斯，日本)观察，用奥林巴斯DP 70照相机(奥林 巴斯，日本)成像。
结果，与正常区域相比，观察到肝癌组织肿瘤区域的TIP41过 表达(图1A)。另外与肝癌和肺癌患者的周围正常组织(忠南大学Kim, Jin-Man教授的研究组提供)相比，这些患者癌症组织中的TIP41蛋 白过表达(表1和2)。TIP41表达和癌症阶段之间的相关分析表明， TIP41阳性表达与NSCLC的较高阶段显著相关，肺癌(P=0.045)，表 明了TIP41表达与NSCLC级数的相关性(表2)。这些数据显示在 HCC和NSCLC细胞中TIP41表达是高度过表达。
【表1】肝癌(HCC)临床组织中的TIP41表达水平(IHC法)
P值由线性相关的卡方值(linear by linear associations)计算。
【表2】肺癌(非小细胞肺癌，NSCLC)临床组织中的TIP41表达水平(IHC法)
P值由线性相关的卡方值计算。
<1-2>用蛋白质印迹法确认TIP41表达
通过使用提取自7位带有乙型肝炎病毒(HBV)的肝癌患者和7 位无HBV的肝癌患者(忠南大学医学院)的肝癌组织和其临近正常组 织的蛋白，用蛋白质印迹法检测TIP41蛋白表达水平。
将组织用裂解缓冲液[20mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基乙 磺酸)(pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，2mM EGMA(乙二醇四乙酸)，1%Triton X-100，10%甘油，蛋白酶抑制剂 混合物，磷酸酶抑制剂混合物I/II]裂解，在约15,000rpm下离心约 10分钟去除细胞碎片并收集蛋白。通过SDS-PAGE根据分子量分离 蛋白后，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜，用约5%脱脂奶封闭1 小时以停止任何非特异性反应。约1小时后，将硝酸纤维素膜与 1:2,000TIP41(Betyl实验室，美国)和1:5,000GAPDH(Abforntier， 韩国)在约4℃反应12小时以上，用0.1%TBST(含吐温-20的Tris- 缓冲盐溶液)洗涤3次，每次洗涤约10分钟，将抗-小鼠(Pierce，美 国)抗-兔(Pierce，美国)的二抗于室温下反应约1小时。然后用0.1% TBST洗涤3次，每次洗涤约10分钟，用化学发光试剂确定所述表 达。作为每种组织的定量对照组，使用管家基因GAPDH(甘油醛-3 磷酸脱氢酶)。
结果，确定了7位带有乙型肝炎病毒(HBV)的肝癌患者和7位 无HBV的肝癌患者中TIP41过表达(图1B)。
<1-3>肝癌细胞系的培养
将源自韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)的人Huh7肝癌细 胞系于37℃、5%CO2下在含10%胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格 尔培养基(DMEM)中培养。将1×106个细胞/100mm的Huh7肝癌细 胞系在培养皿中培养24小时，然后用siRNA转染。
<1-4>siRNA转染
为检测TIP41作为TRAIL敏化剂的功能，挑选出能有效抑制 TIP41的siRNA序列，并合成TIP41 siRNA(Dharmacon RNAi Technologies，美国)。
将<1-3>中培养的2×105肝癌细胞系接种至60mm培养皿中，使 用RNAimax脂质体转染试剂(invitrogen)按照生产商的说明书指导用 siRNA进行转染。约72小时后，用TRAIL(100ng/ml)分别处理转染 后的细胞约0、0.5、1、2、3、4、6小时；在每个时间段使用裂解 缓冲液从所述细胞中收集蛋白，并实施蛋白质印迹法。用裂解缓冲 液[20mM HEPES(pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA，2mM EGTA， 1%Triton X-100，10%甘油，蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂混 合物I/II]裂解所述细胞后，在约15,000rpm下离心约10分钟去除细 胞碎片并收集蛋白。通过SDS-PAGE根据分子量分离蛋白后，将分 离的蛋白转移至硝酸纤维素膜，用约5%脱脂奶封闭1小时以停止任 何非特异性反应。约1小时后，使硝酸纤维素膜与1:2,000TIP41 (Betyl实验室，美国)和1:5,000GAPDH(Abforntier，韩国)在约4℃ 反应12小时以上，用0.1%TBST(含吐温-20的Tris-缓冲盐溶液)洗 涤3次，每次洗涤约10分钟，将抗-小鼠(Pierce，美国)抗-兔(Pierce， 美国)的二抗于室温下反应约1小时。然后用0.1%TBST洗涤3次， 每次洗涤约10分钟，用化学发光试剂确定所述表达。作为每种组织 的定量对照组，使用管家基因GAPDH(甘油醛-3磷酸脱氢酶)。
使用的TIP41 siRNA序列为：5'-CCT AAT GAA ATA TCC CAG TAT-3'(SEQ.ID.NO:2)。
结果，TIP41 siRNA处理后，无论是否进行TRAIL处理，TIP41 蛋白都被完全抑制(图1C)。
<实验例2>通过TIP41消耗和TRAIL处理诱导细胞凋亡
<2-1>用核染色质染色进行TIP41消耗诱导的细胞凋亡分析
将TIP41-抑制的细胞系按2×105个细胞/孔接种到6-孔培养板， 按实验例<1-1>的方法培养。约24小时后，用100ng/ml的TRAIL 分别处理所述细胞0、2、4、6、8小时，用5μg/ml的Hoechst 33342 于室温染色约30分钟。用Hoechst 33342进行核染色质染色后，通 过荧光显微镜对死亡的细胞系计数，测量细胞凋亡。
结果，与仅用TRAIL处理相比，用TIP41 siRNA和TRAIL二 者处理的Huh7癌细胞系中细胞凋亡增加。细胞凋亡随着TRAIL处 理时间的增加而增加，与对照组siRNA处理相比，观察到在TIP41 siRNA处理组中细胞凋亡增加约30%。这表明在Huh7癌细胞中 TIP41 siRNA处理降低了TRAIL抗性(图2A)。
<2-2>用FACS进行TIP41消耗诱导的细胞凋亡分析
将TIP41siRNA转染到按实验例<1-1>方法培养的Huh7肝癌细 胞系并降低细胞内TIP41表达量后，用约100ng/ml的TRAIL处理， 用膜联蛋白V-FITc/PI染色法在0、2、4、6、8小时染色细胞凋亡分 开死亡细胞系和正常细胞系，并用FACS(荧光活化细胞分选器)测量 细胞凋亡。
为测量细胞凋亡，用胰蛋白酶-EDTA收集细胞系，然后用FITc- 融合膜联蛋白v(50μg/ml)和PI(碘化丙啶)(50ng/ml)染色约20分钟， 用FACS Caliber(BD)流式细胞仪分离细胞系，然后分析膜联蛋白 V-FITc/PI染色的细胞系比率。
结果，通过FACS分析确认的事实是，用TRAIL处理不同时间 段后发生了细胞凋亡(图2B)，且当用约0、25、50、100、200ng/ml 浓度的TRAIL采用同样的实验方法处理约4小时，确认细胞凋亡随 着处理浓度的增加而增加(图2C)。
<实验例3>检测TIP41消耗和TRAIL处理诱导的细胞凋亡途径
<3-1>半胱天冬酶激活
将TIP41 siRNA转染至实验例<1-1>培养的细胞系约72小时后， 用约100ng/ml的TRAIL处理不同的时间段。用裂解缓冲液[20mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基乙磺酸)(pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，2mM EGMA(乙二醇四乙酸)，1%Triton X-100，10%甘油，蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂混合物I/II] 裂解所述细胞，在约15,000rpm下离心约10分钟去除细胞碎片并收 集蛋白。通过SDS-PAGE根据分子量分离蛋白后，将分离的蛋白转 移至硝酸纤维素膜，用约5%脱脂奶封闭1小时以停止任何非特异性 反应。约1小时后，使硝酸纤维素膜与1:1,000半胱天冬酶-3、半胱 天冬酶-8、半胱天冬酶-9和1:2,000PARP(细胞信号转导技术(cell signaling technology)，美国)在约4℃反应12小时以上，用0.1%TBST (含吐温-20的Tris-缓冲盐溶液)洗涤3次，每次洗涤约10分钟，将 抗-小鼠(Pierce，美国)抗-兔(Pierce，美国)的二抗于室温下反应约1 小时。然后用0.1%TBST洗涤3次，每次洗涤约10分钟，用化学 发光试剂确定所述表达。
结果，图3A显示TIP41消耗后用TRAIL处理不同的时间段， 激活了半胱天冬酶-9、-8、-3和PARP。该结果表明经TIP41消耗后 是细胞凋亡随TRAIL处理时间和浓度的增加而增加。
<3-2>细胞色素C从线粒体释放至细胞液中
为了弄清楚线粒体中的细胞色素C是否释放至细胞液中以确定 细胞凋亡途径，进行亚细胞结构分级分离和蛋白质印迹法。通过将 TIP41 siRNA转染至按实验例<1-1>方法培养的Huh7肝癌细胞系中 以降低细胞内TIP41表达量后，将TIP41-抑制的细胞系按2×106个 细胞/培养皿接种到60mm的培养皿中。约24小时后，用约100ng/ml 的TRAIL分别处理0、1、2、4小时，并进行亚细胞结构分级分离。 使用亚细胞蛋白质组抽提试剂盒(Calbiochem Co.)进行亚细胞结构 分级分离；试剂盒由4种缓冲液组成，分别使用每种缓冲液将亚细 胞结构分级分离为细胞液、线粒体、细胞核和细胞骨架部分。
将约500μl提取缓冲液1加入至每种细胞系，在约4℃搅拌约 10分钟并离心以获得细胞基质部分，在约500μl提取缓冲液2中于 4℃搅拌约30分钟并离心以获得线粒体部分。对分离的细胞液和线 粒体部分实施蛋白质印迹法。
将TIP41siRNA转染至实验例<1-1>培养的细胞系中约72小时 后，用TRAIL分别处理0、2、4和6小时。用裂解缓冲液[20mM HEPES (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基乙磺酸)(pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA (乙二胺四乙酸)，2mM EGMA(乙二醇四乙酸)，1%Triton X-100， 10%甘油，蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂混合物I/II]裂解所述 细胞，在约15,000rpm下离心约10分钟去除细胞碎片并收集蛋白。 通过SDS-PAGE根据分子量分离蛋白后，将分离的蛋白转移至硝酸 纤维素膜，用约5%脱脂奶封闭1小时以停止任何非特异性反应。微 管蛋白(Tubulin)被用作细胞液部分的标记，过氧化物还原酶III被用 作线粒体部分的标记。约1小时后，使硝酸纤维素膜与1:1,000的细 胞色素C(BD，美国)、1:5,000的微管蛋白(Tubulin)(Sigma Aldrich， 美国)和1:2,000的过氧化物还原酶III(Abfrontier，韩国)在约4℃反 应12小时以上，然后用0.1%TBST(含吐温-20的Tris-缓冲盐溶液) 洗涤3次，每次洗涤约10分钟，抗-小鼠(Pierce，美国)抗-兔(Pierce， 美国)的二抗以1:2,000的比例于室温下反应约1小时。然后用0.1% TBST洗涤3次，每次洗涤约10分钟，用化学发光试剂确定所述表 达。
结果发现，经TIP41 siRNA处理后细胞色素C释放至细胞液中 (图3B)。因此，半胱天冬酶-8和-9被激活，且细胞色素C从线粒体 中释放至细胞液中。这些结果证实，通过线粒体发生了细胞凋亡。 这些发现表明TIP41消耗和TRAIL处理在Huh7肝癌细胞系中诱导 的细胞凋亡与半胱天冬酶/线粒体相关的凋亡的细胞死亡途径紧密 相关。
<实验例4>通过TIP41消耗和TRAIL处理激活JNK途径
<4-1>通过TIP41消耗和TRAIL处理激活JNK
据报道JNK途径通过TRAIL调节细胞死亡。已有报道激活JNK 和p38以诱导细胞凋亡。为了发现<实验例>中确定的TRAIL处理和 TIP41消耗诱导的细胞凋亡，以及丝裂原活化蛋白激酶(MAP)途径， 尤其是JNK和p38之间的关系，将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌 细胞系，然后用TRAIL(100ng/ml)分别处理0、1、2、4小时。用蛋 白质印迹法检测TIP41蛋白消耗和TRAIL处理诱导的细胞凋亡与 JNK以及p38之间的关系。将TIP41siRNA转染至实验例<1-1>培养 的细胞系中约72小时后，用TRAIL分别处理约0、2、4和6小时。 用裂解缓冲液[20mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基乙磺酸) (pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，2mM EGMA(乙 二醇四乙酸)，1%Triton X-100，10%甘油，蛋白酶抑制剂混合物， 磷酸酶抑制剂混合物I/II]裂解所述细胞，在约15,000rpm下离心约 10分钟去除细胞碎片并收集蛋白。通过SDS-PAGE根据分子量分离 蛋白后，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜，用约5%脱脂奶封闭1 小时以停止任何非特异性反应。约1小时后，使硝酸纤维素膜与 1:1,000比例的p-MKK7(cST Inc.，美国)、p-p38(cST Inc.，美国)、 1:1,000比例的p-JNK(cST Inc.，美国)和1:5,000比例的微管蛋白 (Sigma Aldrich，美国)在约4℃反应12小时以上，然后用0.1%TBST 洗涤3次，每次洗涤约10分钟，将抗-小鼠(Pierce，美国)抗-兔(Pierce， 美国)的二抗于室温下以1:2,000的比例反应约1小时。然后用0.1% TBST洗涤3次，每次洗涤约10分钟，用化学发光试剂确定所述表 达。
如图4A所示，由RNAi导致的TIP41下调足以延长TRAIL-诱 导的MKK7/JNK激活作用(图4A)。
<4-2>通过JNK抑制剂处理减少凋亡的细胞死亡
为了发现JNK转导途径与TRAIL处理和TIP41消耗诱导的细 胞凋亡之间的关系，以如实验例<4-1>的方法将细胞系接种后，用 TIP41siRNA处理所述细胞系，然后用JNK抑制剂SP600125 (10μg/ml)处理1小时以抑制JNK转导途径。通过采用 Annexin-FITc/PI染色法的FACS分析测量由TRAIL刺激而诱导的细 胞凋亡。
结果，在用JNK抑制剂处理抑制JNK转导途径后，用TRAIL 处理的实验中，细胞凋亡减少了。通过这一点确认一个事实，即JNK 转导途径在TRAIL处理和TIP41蛋白消耗诱导的细胞凋亡中起着重 要的作用(图4B)。
<实验例5>确认TIP41蛋白消耗后p53-非依赖性细胞凋亡途径
<5-1>确认肝癌细胞系中p53-非依赖性细胞凋亡途径
目前使用的抗癌剂最大的问题是其杀死正常细胞系的副作用， 其无法区分正常细胞系和癌细胞系，而已知正常细胞系细胞凋亡的 机理是其通过p53途径的激活而产生。由于诱导p53-非依赖性细胞 凋亡的抗癌剂即影响癌症也影响正常细胞系，已确认TIP41siRNA 处理后TRAIL-诱导的细胞凋亡是否通过p53而发生。将TIP41 siRNA转染至HCT 1116p53野生型和p53缺陷型结肠癌细胞系约 72小时后，用约100ng/ml的TRAIL分别处理0、2、4和6小时。 为了用磷酸-p53抗体实施蛋白质印迹法确认是否通过p53转导途径 发生了细胞凋亡，使用了确认p53磷酸化的抗体。使用p-p53(Ser 6)、 p-p53(Ser 9)、p-p53(Ser15)、p-p53(Ser 20)、p-p53(Ser 37)、p-p53 (Ser 46)和p-p53(Ser 392)，检测p53丝氨酸6、9、15、20、37、46、 392的磷酸化。
用裂解缓冲液[20mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基乙磺酸) (pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，2mM EGMA(乙 二醇四乙酸)，1%Triton X-100，10%甘油，蛋白酶抑制剂混合物， 磷酸酶抑制剂混合物I/II]裂解所述细胞，在约15,000rpm下离心约 10分钟去除细胞碎片并收集蛋白。通过SDS-PAGE根据分子量分离 蛋白后，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜，用约5%脱脂奶封闭1 小时以停止任何非特异性反应。约1小时后，使硝酸纤维素膜与 1:1,000比例的p-p53(Ser 6)、p-p53(Ser 9)、p-p53(Ser15)、p-p53(Ser 20)、p-p53(Ser 37)、p-p53(Ser 46)和p-p53(Ser 392)(cST Inc，美国) 在约4℃反应12小时以上，然后用0.1%TBST洗涤3次，每次洗涤 约10分钟，抗-小鼠(Pierce，美国)抗-兔(Pierce，美国)的二抗于室温 下以1:2,000的比例反应约1小时。然后用0.1%TBST洗涤3次， 每次洗涤约10分钟，用化学发光试剂确定所述表达。
结果，当用TIP41 siRNA和TRAIL处理细胞，确认在p53蛋白 的Ser 15和392位的磷酸化(图5A)。Ser 15磷酸化的发生是通过激 活ATM(毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白)/ATR(ATM和RAD3- 相关蛋白)途径，其由于DNA损伤而影响到细胞凋亡，而DNA依赖 性蛋白激酶(DNA-PK)及其与细胞凋亡的关系是已知的，已知Ser 392 的磷酸化影响p53蛋白与细胞核中的DNA序列结合。因此，有可能 通过TIP41消耗的TRAIL介导的细胞凋亡是p53-依赖性的。但是， 考虑到JNK转导途径激活的丝氨酸不表达这一结果，其p53-非依赖 性可能性也不可忽视。
<5-2>p53-缺陷细胞系培养
HCT116细胞系是正常产生p53蛋白的结直肠癌细胞系，已知其 为通过TRAIL处理而不经常进入细胞凋亡的TRAIL-抗性细胞系。 HCT116p53-缺陷细胞系是由B.Vogelstein博士于1998年建立的p53 基因缺陷型(Vogelstein,B.,科学(Science),1998)。将该细胞系分散开 用于实验，所述细胞系在含有约10%胎牛血清、约100mg/ml链霉 素和约100IU/ml氨苄青霉素的DMEM(Hyclone，美国)培养基中继 代培养3天时间，加入约100μg/ml G418稳定标记抗生素。
<5-3>确认p53缺陷细胞系中p53-非依赖性细胞凋亡途径
为了确认p53-非依赖性的可能性，将TIP41 siRNA转染至实验 例<5-2>中制备的HCT116p53缺陷细胞系中，以同样的条件用 TRAIL处理以诱导细胞凋亡，然后用Annexin-FITc/PI染色法进行 FACS分析。
结果，在TIP41 siRNA转染后用TRAIL处理，在HCT116p53- 缺陷细胞系以及Huh7肝癌细胞系中很好地诱导了细胞凋亡，这表 明TIP41消耗和TRAIL处理在p53-非依赖性途径中诱导了癌细胞系 的细胞凋亡。因此，图5A所示的p53Ser 15激活对通过TIP41消耗 的TRAIL介导的细胞凋亡影响很小，预期p53进入到细胞核中以增 强转录活性(图5B)。
<实验例6>测量TRAIL受体表达水平
<6-1>确认TRAIL受体在各种细胞系中的表达
一项研究报道，为了通过克服TRAIL抗性来增强癌细胞系特异 性治疗效果，已将增强TRAIL受体表达作为增加癌细胞系细胞凋亡 的方法。与该项研究相关，为确定TIP41消耗和TRAIL受体之间的 关系，确定了在正常细胞系、肝癌和肺癌细胞系中TRAIL的表达水 平。有四种TRAIL受体，分别为TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、 TRAIL-R3(DcR1)和TRAIL-R4(DcR2)；R1和R2的功能为细胞凋 亡受体，当结合TRAIL后其诱导细胞系启动细胞凋亡，但R3和R4 已知为诱捕受体，其通过抑制TRAIL结合R1和R2而减少TRAIL- 诱导的细胞凋亡。
使用Trizol试剂从Huh7肝癌细胞系、HAEC(人主动脉内皮细胞， Clonetics)正常细胞系和A549肺癌细胞系(韩国细胞系库)中提取 RNA进行实时定量PCR，使用约1μg提取的RNA和反转录酶 SuperScript II(Invitrogen)进行cDNA合成，基于该模板使用TIP41 引物、TRAIL-R1(死亡受体(DR)4)、TRAIL-R2(DR5)、TRAIL-R3 (DcR1)和TRAIL-R4(DcR2)基因。用2-DDct比较法通过PCT结果 确定每种基因的相对表达水平。使用TIP41正向引物(SEQ.ID.NO:3: 5'-att gaa agc cag aga aca ga-3′)和TIP41反向引物(SEQ.ID.NO:4: 5'-tct cgt gtc att cat tct ga-3′)、DR4正向引物(SEQ.ID.NO:5:5'-ctc agc gga atc aat cag ctg tg-3′)、DR4反向引物(SEQ.ID.NO:6:5'-aga gga aca cga caa tca gcc tta g-3′)、DR5正向引物(SEQ.ID.NO:7:5'-atc aag cgg ccc cct ttt ttt cac-3′)、DR5反向引物(SEQ.ID.NO:8:5'-ctc att gtc aca ctc ctc gac agc-3')、DcR1正向引物(SEQ.ID.NO:9:5'-tcc cca aga ccc taa agt tc-3′)、DcR1反向引物(SEQ.ID.NO:10:5'-ggc acc aaa ttc ttc aac ac-3′)、DcR2正向引物(SEQ.ID.NO:11:5'-gca cag agggtg tgg att ac-3′)和DcR2反向引物(SEQ.ID.NO:12:5'-gag cag atg cct ttg agg ta-3′)进行实时定量PCR。此时，将写作β-2-微球蛋白(B2M)的正向 引物(SEQ.ID.NO:13:5'-ctc gct ccg tgg cct tag-3')和反向引物(SEQ. ID.NO:14:5'-caa atg cgg cat ctt caa-3′)的引物对作为定量对照组，也 进行实时定量PCR。PCR条件包括：约95℃变性约10分钟，在约 95℃约30秒、约60℃约30秒和约72℃约1分钟的条件下进行约 40个循环；此后约72℃延伸约8分钟，并冷却至室温。用2-DDct 比较法分析实时定量PCR的结果，其将每个样品的TRAIL受体表 达水平调整(compensate)为β-2-微球蛋白(B2M)表达水平，然后将肝 癌组织中表达水平与正常肝组织中TRAIL受体表达水平的倍数示于 图6中。
结果，与正常细胞系相比，TRAIL-R3(DcR1)在肝癌和肺癌细胞 系、TRAIL抗性癌细胞系中的表达更少，而TRAIL-R4(DcR2)的表 达水平与正常细胞系相似。与正常细胞系相比，TRAIL-R1(DR4)在 肝癌和肺癌细胞系的表达水平略高，但其总表达水平较低，且确定 了与正常细胞系相比，TRAIL-R2(DR5)在肝癌和肺癌细胞系中过表 达。因此，正如通常所知，细胞凋亡受体在肝癌和肺癌细胞系的表 达较多，这表明TRAIL抗性和该受体的表达之间并无相关性(图 6A)。
<6-2>通过TRAIL处理和TIP41消耗确认TRAIL受体表达
为了发现通过敲除TIP41蛋白诱导的细胞凋亡和TRAIL受体之 间的关系，检测用TRAIL和TIP41 siRNA处理的Huh7肝癌细胞系 中TRAIL受体的表达水平。将TIP41 siRNA转染至Huh7肝癌细胞 系约72小时后，用约100ng/ml的TRAIL分别处理4和6小时。用 TRAIL处理后，通过用Trizol试剂从Huh7肝癌细胞系中提取RNA 进行实时定量PCR，使用约1μg提取的RNA和反转录酶SuperScript II(Invitrogen)进行cDNA合成，基于该模板使用TIP41引物、 TRAIL-R1(死亡受体(DR)4)、TRAIL-R2(DR5)、TRAIL-R3(DcR1) 和TRAIL-R4(DcR2)基因。用2-DDct比较法通过PCT结果计算每 种基因的相对表达水平。
如图6B所示，比较TIP41 siRNA转染组和对照组后发现，TIP41 蛋白消耗后的TRAIL受体表达(TRAIL-R1、-R2、-R3和-R4)没有显 著差异(图6B)。
<6-3>确认肝癌组织中的TRAIL受体表达
用反转录酶-PCR测量肝癌组织和临近组织中的TRAIL受体表 达水平。该实验所用的组织术前征得患者同意而收集自韩国首尔的 天主教大学(Catholic University of Medicine)；收集了患者各个肝癌阶 段的19种组织，包括肝癌组织和临近的正常组织，包括Edmonson 和Steiner四级分级法中的Ⅰ(n=5)、Ⅱ(n=5)、Ⅲ(n=5)和Ⅳ(n=4)。
通过用Trizol试剂从Huh7肝癌细胞系中提取RNA进行实时定 量PCR，使用约1μg提取的RNA和反转录酶SuperScript II (Invitrogen)进行cDNA合成，基于该模板使用TIP41引物、TRAIL-R1 (死亡受体(DR)4)、TRAIL-R2(DR5)、TRAIL-R3(DcR1)和TRAIL-R4 (DcR2)基因。用2-DDct比较法通过PCT结果确定每种基因的相对 表达水平。
结果，在肝癌阶段I观察到TRAIL-R1(DR4)的表达水平显著增 加，随后分别是阶段III、II、IV；表达水平差异显著。对于TRAIL-R2 (DR5)，观察到与正常组织相比，其在肝癌组织阶段I和阶段V的表 达显著增加，但TRAIL-R3(DcR1)的表达水平在几乎每个阶段都很 低，且在正常组织和肝癌组织之间没有观察到存在差异。而且，观 察到TRAIL-R4(DcR2)的表达仅在肝癌组织的阶段II显著增加；而 在其他阶段其表达水平与正常组织类似，或甚至在正常组织中表现 出更高的表达水平(图6C)。
<实验例7>检测正常细胞系中的细胞凋亡
<7-1>用FACS分析法对通过TIP41消耗和TRAIL处理的正 常细胞系中的细胞凋亡进行分析
TIP41特异性地在癌细胞系中过表达，但其也在正常细胞系中 表达；由于TIP41消耗可诱导正常细胞系的细胞凋亡，这与其在癌 细胞系中所发生的一样，为了确认通过TIP41消耗和TRAIL处理诱 导的细胞凋亡是否为特异性针对癌细胞系的反应，用TIP41蛋白消 耗和TRAIL处理在正常细胞系HAEC(人主动脉内皮细胞)中诱导细 胞凋亡。
将TIP41 siRNA转染至HAEC正常细胞系约72小时后，用约 100ng/ml的TRAIL分别处理0、2、4和6小时以诱导细胞凋亡。 采用如上所述的膜联蛋白V-FITc/PI染色法分析细胞死亡，并用 FACS(荧光活化细胞分选器)测量细胞凋亡。
结果发现，TRAIL处理后无论是否用TIP41 siRNA处理，细胞 凋亡均无差异。因此，用特异性在癌细胞系中过表达的TIP41 siRNA 转染后，通过TRAIL处理诱导的细胞凋亡特异性地发生于癌细胞系 中(图7A)。
<7-2>分析通过TIP41消耗和TRAIL处理的正常细胞系中的 促凋亡蛋白
用同样的实验方法将TIP41 siRNA转染至正常细胞系，检测半 胱天冬酶-8、半胱天冬酶-3、JNK、PARP蛋白的活性。用100ng/ml 的TRAIL分别处理正常细胞系0、2、4小时，用如上所述的蛋白质 印迹法检测促凋亡蛋白的表达和活性。
结果，确认了TIP41 siRNA转染后的TIP41蛋白消耗，对于影 响细胞凋亡转导途径的半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-3、JNK和 pJNK(磷酸化JNK)而言没有发生变化。另外，通过确定这些蛋白没 有被活化，证实TIP41 siRNA转染和TRAIL诱导的细胞凋亡特异性 地发生于癌细胞系中(图7B)。
<实验例8>癌细胞系中通过TIP41消耗的TRAIL介导的细胞凋亡
<8-1>肺癌细胞系中通过TIP41消耗的TRAIL介导的细胞凋 亡
<8-1-1>用蛋白质印迹法确认肺癌细胞系中TIP41蛋白消耗诱 导的细胞凋亡
在不同于上述<实验例>所用肝癌细胞系的TRAIL-抗性癌细胞 系中，为了证明其作为敏化剂功能克服由于TIP41蛋白消耗导致的 TRAIL抗性，用与肝癌细胞系的同样的方法将TIP41 siRNA转染至 A549细胞系、肺癌细胞系约72小时后，用约100ng/ml的TRAIL 分别处理0、1、2、3和4小时，并用蛋白质印迹法检测与细胞凋亡 相关的蛋白的活性。
结果，如在肝细胞系中所示，通过JNK、半胱天冬酶-8和PARP 的活化确认了细胞凋亡，但其弱于肝癌细胞系中的细胞凋亡(图8a)。
<8-1-2>用核染色质染色确认肺癌细胞系中TIP41蛋白消耗诱 导的细胞凋亡
将TIP41siRNA转染至A549细胞系、肺癌细胞系以消耗细胞 中TIP41的表达水平，用100ng/ml的TRAIL处理，并用核染色质 染色法分别测量0、1、2、4和6小时的细胞凋亡率。
用Hoechst 33342将细胞染色，用荧光显微镜进行细胞凋亡计 数。将TIP41消耗的细胞系接种到2×105个细胞/孔的6孔板。24 小时后,用100ng/ml的TRAIL分别处理所述细胞0、1、2、4、6小 时，然后用5μg/ml的Hoechst 33342于室温染色30分钟。在荧光 显微镜下观察核染色的细胞，并对死亡细胞计数以测量细胞凋亡率。
结果示于图8b-A中，其表明与仅用TRAIL处理A549肺癌细 胞系相比，当用TIP41 siRNA和TRAIL处理A549肺癌细胞系时细 胞凋亡增加。该观察结果表明用TRAIL处理的时间越长，细胞凋亡 增加越多。进一步地，与用siRNA处理的对照组相比，在用TIP41 siRNA处理的组中细胞凋亡增加约30%。因此，确认了A549肺癌 细胞系的TIP41 siRNA减小了TRAIL-抗性(图8b-A)。
<8-1-3>用FACS分析确认肺癌细胞中通过TIP41消耗的 TRAIL-介导的凋亡的细胞死亡
用TIP41 siRNA转染549细胞以消耗细胞中的TIP41表达水平， 用100ng/ml的TRAIL处理死亡细胞系和正常细胞系，在0、1、2、 4、6小时分别用膜联蛋白V-FITC/PI染色，用FACS(荧光活化细胞 分选器)测量细胞凋亡。
为了测量细胞凋亡，用胰蛋白酶-EDTA使细胞胰蛋白酶化，用 FITC结合的膜联蛋白v(50μg/ml)和PI(碘化丙啶)(50ng/ml)染色20 分钟，然后用FACS Calibur(BD)分析计算膜联蛋白V-FITC/PI染色 的细胞比率。
与用对照siRNA处理的A549细胞(即，肺癌细胞系)相比，本发 明用TIP41 siRNA处理的A549细胞表现出显著增加的A549细胞的 细胞凋亡(图8b-B)。进一步地，如图8b-C所示，为了检测细胞凋亡， 分别用浓度为0、25、50、100和200ng/ml的TRAIL处理细胞4 小时。结果，观察到在用TRAIL和TIP41 siRNA二者处理的实例中 较高浓度的TRAIL增加了细胞凋亡(图8b-C)。
基于上述结果，确认本发明的TIP41 siRNA减小了肺癌细胞系 的TRAIL-抗性，并诱导了癌症特异性细胞凋亡。
<8-2>结直肠癌细胞系中通过TIP41消耗的TRAIL-介导的细 胞凋亡
用同样的方法将TIP41 siRNA转染至HCT116结直肠癌细胞系 中约72小时后，用约0、50和100ng/ml的TRAIL处理，用0.3% DMSO作为对照溶剂处理，进行细胞凋亡诱导实验。按上述方法用 膜联蛋白V-FITC/PI染色法染色死亡细胞，用FACS测量细胞死亡。
结果确认，细胞凋亡增加与TRAIL处理的浓度成正比；与对照 组相比，TIP41 siRNA转染组细胞凋亡增加。因此，通过确定结直 肠癌细胞系和肝癌细胞系中的细胞凋亡，确认了TIP41蛋白抑制剂 可作为TRAIL敏化剂用于TRAIL-抗性的癌症(图8a-B)。
<8-3>肝癌细胞系中通过TIP41消耗的TRAIL-介导的细胞凋 亡
在不同于上述<实验例>所用肝癌细胞系的TRAIL-抗性癌细胞 系中，为了证明其作为敏化剂功能克服由于TIP41蛋白表达抑制导 致的TRAIL抗性，将TIP41 siRNA转染至HepG2(肝细胞)和 SK-Hep1细胞中约72小时后，用约100ng/ml的TRAIL分别处理0、 1、2、4和6小时，并用蛋白质印迹法检测与细胞凋亡相关的蛋白 的活性。
如图8c-A和8c-B中所示，确认了在HepG2和SK-Hep1细胞系 中具有导致细胞凋亡的半胱天冬酶-8和PARP的活化作用(图8c-A 和8c-B)。
<实验例9>通过动物实验确认TIP41的功能
<9-1>将Huh7肝癌细胞系移植到裸鼠体内
将约2×106个Huh7肝癌细胞异种移植至裸鼠的右背部以后，肿 瘤长到一定的大小(50~100mm3)。该实验中每组7只小鼠(n=7)；总 计28只裸鼠购自日本SLc Inc。
<9-2>测量通过TIP41消耗和TRAIL处理的肿瘤大小变化
按照实验例<9-1>所述的方法将Huh7肝癌细胞系移植至裸鼠并 形成肿瘤后，在12天的时间段内，分别在第0、4、6和8天将对照 siRNA和TIP41 siRNA注射到所述肿瘤中，并分别在第2、5、7、9、 10和11天注射TRAIL，于第12天处死小鼠。用50nM浓度的 Lipofectamine(脂质体)RNAiMax试剂制备药物组合物并注射到肿瘤 中；将约2.5μg/kg的TRAIL于第2、5、7、9、10和11天注射以 后，将小鼠分为4个不同组(对照siRNA+对照溶剂，对照 siRNA+TRAIL，TIP41 siRNA+对照溶剂，TIP41 siRNA+TRAIL)， 观察TIP41 siRNA和TRAIL处理后的肿瘤大小。
结果观察到，与对照siRNA组相比，观察到注射TIP41 siRNA 组的肿瘤减小了，当注射了TRAIL后与对照siRNA组相比，TIP41 siRNA处理的肿瘤大小减小的甚至更多(图9a)。
<9-3>观察癌症组织中的细胞凋亡
将小鼠分为无siRNA处理组、对照siRNA处理组、siRNA和 TRAIL处理组，以及无处理组；从上述组中分别切离肿瘤后用福尔 马林固定，并用石蜡包埋。制作约5μm厚的切片后，用二甲苯除去 石蜡，并用乙醇浓溶液再水化。用4%多聚甲醛溶液处理以固定组织 切片，用蛋白酶K溶液处理使组织透明，将其再次于4%聚甲醛溶 液中固定后，用TUNEL染色试剂盒(Promega，美国)实施该实验。 当用平衡缓冲液平衡所述组织切片时，制备rTdT反应溶液并处理平 衡区。最后，用链霉亲和素HRP溶液处理，用DAP混合物进行颜 色反应，然后用光学显微镜观察。
结果，在TIP41 siRNA和TRAIL处理组观察到大量增加的细胞 凋亡(图6B)。
<9-4>测量肿瘤的细胞凋亡
通过溶解来自4个组(对照siRNA+对照溶剂，对照 siRNA+TRAIL，TIP41 siRNA+对照溶剂，TIP41 siRNA+TRAIL)的 肿瘤细胞并提取蛋白后，通过蛋白质印迹法使用作为细胞凋亡标记 的半胱天冬酶-8抗体检测细胞凋亡。
结果，通过TIP41蛋白表达水平的降低确定了TIP41 siRNA的 效果，观察到TIP41 siRNA转染后半胱天冬酶-8的表达增加，而通 过TRAIL处理其并未增加。通过这一点确认TIP41 siRNA可应用于 活体内，并可用作抗癌剂，其具有通过有效地诱导TRAIL-抗性癌症 的细胞凋亡而克服TRAIL抗性的效果(图9c)。
<实验例10>测量TIP41和PP2Ac之间的结合
<10-1>构建表达载体
为了制备表达TIP41、PP2Ac、MKK7、α4和PR65基因的载体， 从肝癌细胞中提取RNA并克隆到表达载体中。以反向RNA为模板， 使用对应于每个基因的引物进行PCR。实施PCR使用的引物为： TIP41正向引物(SEQ.ID.NO:15:5'-cg ggt acc aa atg atg atc cac ggc ttc'-3′)和TIP41反向引物(SEQ.ID.NO:16:5'-ccc gga tcc tta ttc Cac ttg tgt act-3')，PP2Ac正向引物(SEQ.ID.NO:17:5'-cg gga tcc atg gac gag aag gtg ttc-3')和PP2Ac反向引物(SEQ.ID.NO:18:5'-a tag ttt agc ggc cgc tta cag gaa gta gtc tgg-3')，MKK7正向引物(SEQ.ID.NO:19: 5'-ccg ctc gag atg gcg gcg tcc tcc ctg-3′)和MKK7反向引物(SEQ.ID. NO:20:5'-gg ggt acc cct gaa gaa ggg cag gtg-3′)，α4正向引物(SEQ.ID. NO:21:5'-cg gga tcc atg gct gct gag gac gag-3′)和α4反向引物(SEQ. ID.NO:22:5'-a tag ttt agc ggc cgc tca gcc cat gtt ctg tcg-3′)，PR65正向 引物(SEQ.ID.NO:23:5'-cg gga tcc atg gcg gcg gcc gac ggc-3')和 PR65反向引物(SEQ.ID.NO:24:5'-a tag ttt agc ggc cgc tca ggc gag aga cag aac-3′)。PCR的条件为：95℃变性3分钟，并在95℃1分钟、 58℃1分钟和72℃1分钟30秒的条件下进行30个循环；在循环 的最后，72℃延伸约10分钟，冷却至4℃。
对于TIP41的载体，将提取的PCR产物用KpnI和BamHI限制 酶进行酶切，然后插入至pHA载体(pcDNA3.1；由Invitrogen公司 通过插入HA标签制备的载体)。所用引物包括KpnI和BamHI限制 位点。对于PP2Ac、PR65、MKK7和α4，使用包括Not I和BamHI 限制位点的引物进行扩增；纯化PCR产物，然后用Not I和BamHI 限制酶进行酶切，并插入至pGST载体(pEBG载体)中(Mayer等人， 1995，现代生物学(Current Biology)5(3):296-305)。另外，为了制备 重组蛋白，使用上述同样的引物进行PCR。将MKK7和PP2Ac的 PCR产物分别插入至pET21a(Novagen Inc.)载体中，其为大肠杆菌 (E.coli)表达载体，并将TIP41的PCR产物插入至pGEX4T-1(GE helthcare)载体。通过该方法构建pET21-MKK7、pET21-PP2Ac和 pGEX4T-TIP41。
<10-2>培养HEK293T细胞系
将源自韩国细胞系库的HEK293T细胞系在约37℃、5%CO2下 于含有10%胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中培 养。为了转染siRNA，将HEK293T细胞系接种于1×106个细胞/100 mm的培养皿并培养约24小时；然后完成转染。
<10-3>确认TIP41和PP2Ac之间的结合
通过该实验本发明人揭示了由TIP41消耗和TRAIL处理导致的 细胞凋亡是由于连续激活JNK的结果，其意味着TIP41消耗诱导了 JNK激活机制。为了确定JNK的激活是否由已知结合TIP41的蛋白 控制，在实验例<10-1>中制备表达蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)的表达载 体，最近的报道中PP2Ac为结合TIP41的蛋白。
PP2Ac蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，其功能是去除许多蛋 白中磷酸化Ser/Thr氨基酸的磷酸。已知Foxo1、NF-κB(p65)、AMPK 和MKK4为PP2Ac蛋白的底物。
为了确认TIP41结合PP2Ac，将2×105HEK293T细胞系接种到 100mm培养皿中，使用Lipofectamine LTX试剂将实验例<10-1>制 备的PP2Ac表达载体转染至细胞中，PP2Ac过表达。从转染细胞中 提取细胞溶解产物并进行GST-钓饵(pull down)分析。按如下方式进 行GST-钓饵分析：将40μlGSH-珠加入至1mg/ml细胞溶解产物中， 约4℃小心搅拌约12小时后，加入约1ml PBST[包括0.1%吐温20 的PBS]缓冲液进行洗涤，该过程重复6次。最后，将100μl 1×样 品缓冲液(用于蛋白质印迹法)加入至洗涤后的珠中，在加热器中约 95℃煮约5分钟，于冰上冷却约2分钟。然后，使用每一种抗体按 上述条件实施蛋白质印迹法。
结果，如图10A所示，确认了TIP41结合PP2Ac，α4是作为阳 性对照组而提供的。另外，在进行GST钓饵之前通过全细胞溶解产 物(WcL)确定每种表达载体的表达水平(图10A)。
<10-4>确认TIP41和PP2Ac复合体之间的相互作用
为了确定TIP41和已知为JNK激酶的PP2Ac之间的结合，将实 验例<10-1>制备的表达载体按照前述方法转染至HEK293T细胞系， 并在进行GST-钓饵后实施蛋白质印迹法。
结果，如图10B所示，确认了TIP41和PP2Ac的结合，以及 PP2Ac、PR65和α4的结合(图10B)。
<实验例11>确认TIP41和MKK7之间的相互作用
<11-1>确认MKK7过表达后TIP41和MKK7之间的相互作 用
为了确定TIP41和已知为JNK激酶的MKK7之间的结合，将实 验例<10>制备的表达载体按照同样的方法转染至HEK293T细胞系 并过表达，然后进行GST-钓饵。
结果，如图11A所示，确认了TIP41和MKK7的结合(图11A)。
<11-2>用免疫沉淀反应确认TIP41和MKK7之间的相互作用
为了确定TIP41和MKK7之间的相互作用，用每种抗体进行免 疫沉淀反应，用蛋白质印迹法确认了TIP41和MKK7之间的结合。 按如下方式实施免疫沉淀反应：将约2μg待沉淀的蛋白抗体加入至 1mg细胞溶解产物中于约4℃反应约2小时，添加约30μl Protein G 琼脂糖珠于约4℃反应约12小时。然后，加入约1ml PBST[包括0.1% 吐温20的PBS]缓冲液进行洗涤，该过程重复4次。然后，将100μl 1×样品缓冲液(用于蛋白质印迹法)加入至洗涤后的珠中，在加热器 中约95℃煮约5分钟，于冰上冷却约2分钟。然后，使用MKK7 和TIP41抗体实施蛋白质印迹法。
结果，如图11B所示，确认了TIP41与MKK7的结合(图11B)。 <实验例12>确认TIP41和PP2Ac或TIP41和MKK7之间的相互 作用
为了更准确地确认TIP41和PP2Ac、MKK7的相互作用，用大 肠杆菌中合成的(E.coli)重组蛋白以1:1的反应比例进行GST-钓饵分 析，不用于TIP41和MKK7之间的细胞内相互作用。通过将实验例 <10-1>合成的大肠杆菌表达载体转染至BL21大肠杆菌菌株来制备 重组蛋白。按如下方式实施诱导：将转染的大肠杆菌接种到LB肉 汤中培养至0.4~0.6OD水平，然后按最终浓度为1mM加入异丙基 β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，并于30℃培养2小时。然后，用声波 降解法制备溶解产物，以用于GST-钓饵。
结果，如图11C所示，确认了TIP41和MKK7之间的直接相互 作用，也确认了TIP41和PP2Ac之间的直接相互作用(图11C)。
另外，在实验例<10-4>的结果中同样确认了TIP41和PP2Ac、 MKK7之间的相互作用(图10B)。
<实验例13>确认TIP41结合MKK7的位点
为了确认TIP41结合MKK7的位点，按照前述<实验例10>中 所述的方法克隆TIP41片段表达载体。
如图12A所示，将全长TIP41分为6个片段D1~D6，使用下述 引物扩增每个片段并插入到pHA表达载体中。PCR所用引物如下： TIP41-D1正向引物(SEQ.ID.NO:15)和TIP41-D1反向引物(SEQ.ID. NO:25:5'-cg gga tcc cag gct tga aac tcc atg-3′)，TIP41-D2正向引物 (SEQ.ID.NO:15)和TIP41-D2反向引物(SEQ.ID.NO:26:5'-cg gga tcc g gaa ggt gga aca tgc atc-3')，TIP41-D3正向引物(SEQ.ID.NO:27: 5'-gg ggt acc atg ctt aaa gtg gcc tgt g-3')和TIP41-D3反向引物(SEQ. ID.NO:16)，TIP41-D4正向引物(SEQ.ID.NO:28:5'-cg gga tcc atg ctt aaa gtg gcc tgt-3′)和TIP41-D4反向引物(SEQ.ID.NO:29:5'-ccg ctc gag cag gct tga aac tcc atg-3′)，TIP41-D5正向引物(SEQ.ID.NO:15) 和TIP41-D5反向引物(SEQ.ID.NO:30:5'-cg gga tcc gtg ttc acc ctc cgt cct-3′)，TIP41-D6正向引物(SEQ.ID.NO:31:5'-cg gga tcc aaa ttg aaa gcc aga gaa c-3')和TIP41-D6反向引物(SEQ.ID.NO:16)。
为了使表达D1~D6的TIP41片段的载体过表达，将3×106HEK293T细胞系接种至100mm培养皿中，然后用Lipofectamine LTX试剂将克隆的TIP41D1~D6片段表达载体转染至细胞中。从 转染的细胞中提取细胞溶解产物，并进行GST-钓饵分析。按照前述 方法进行GST-钓饵分析。
图12B表明与MKK7结合的片段分别为全长TIP41蛋白、片段 D3和D6。因此，确认了MKK7与所述TIP41蛋白(SEQ.ID.NO:1) 的N末端区位点230~272结合(图12)。
<实验例14>确认MKK7结合TIP41的位点
为了确定MKK7与TIP41结合的位点，用前述<实验例10>中 的方法克隆MKK7片段表达载体。使用下述引物进行PCR： MKK7-D1正向引物(SEQ.ID.NO:32:5'-cg gga tcc cgc agc atg gag agcatt-3')和MKK7-D1反向引物(SEQ.ID.NO:20)，MKK7-D5正向 引物(SEQ.ID.NO:33:5'-cg gga tcc gcc ggc tgt gcc gcc tac-3′)和 MKK7-D5反向引物(SEQ.ID.NO:20)，MKK7-D6正向引物(SEQ.ID. NO:19)和MKK7-D6反向引物(SEQ.ID.NO:34:5'-at agt tta gcg gc cg cta aat gcg ctc ggg gat ggg-3′)。如图13A所示，全长MKK7分为3 个片段即D1、D5和D6，通过使用上述引物将它们进行扩增并插入 至pGST表达载体中。
为了使表达D1、D5和D6的MKK7片段的载体过表达，将3×106HEK293T细胞系接种至100mm培养皿中，然后用Lipofectamine LTX试剂将克隆的MKK7D1、D5和D6的片段表达载体转染至细 胞中。从转染的细胞中提取细胞溶解产物，并进行GST-钓饵分析。 按照前述方法进行GST-钓饵分析。
结果，如图13B所示，MKK7结合TIP41的片段为全长MKK 蛋白和D6片段。因此，确认TIP41结合至MKK7(SEQ.ID.NO:35) 的N末端区1~85氨基酸序列(图13B)。
<实验例15>MKK7/JNK途径介导的细胞凋亡
<15-1>通过MKK7消耗减少细胞凋亡
为了确认细胞凋亡耐受性是MKK7和TIPP41之间相互作用介 导的，检测由抗MKK7的siRNA导致的细胞凋亡耐受性的减小。
将抗MKK7、TIPP41及二者混合物的siRNA引入至Huh7肝癌 细胞，用100ng/ml的TRAIL刺激细胞约0、3和6小时后，通过膜 联蛋白V-FITc/PI染色法用FACS分析测量细胞凋亡。
结果，MKK7敲除减少了通过TIP41消耗和TRAIL处理导致的 细胞凋亡。因此，确认了MKK7在TIP41蛋白抑制和TRAIL处理 诱导的细胞凋亡中的重要作用(图14A)。
<15-2>通过TIP41消耗激活MKK7/JNK途径
为了确认TIP41消耗是否直接影响MKK7的活性，及其对 MKK7信号转导的影响，进行体外免疫复合激酶分析 (Immune-co-kinase analysis)。免疫复合激酶分析是一种免疫沉淀反 应；其为一种通过在体外沉淀MKK7然后定量加入MKK7的底物和 影响MKK信号转导的底物来确定磷酸化水平的实验方法。使用上 述的MKK7抗体进行免疫沉淀反应后，获得了结合有MKK7蛋白的 蛋白G微珠，然后将作为MKK7底物的重组GST-JNK1、作为JNK1 底物的GST-c-Jun和同位素标记物(-32P)加入至激酶缓冲液并在约 37℃反应约30分钟。然后，加入1×蛋白上样染料并在约95℃煮约 5分钟。在10%SDS-PAGE凝胶电泳后，在凝胶干燥器中干燥凝胶， 然后用BAS阅读仪(辐射测量仪，日本富士通公司)进行感光。
图14B表明TIP41消耗、磷酸化的GST-JNK1(MKK7的底物) 和激活的JNK1磷酸化GST-c-jun蛋白(JNK途径的底物)激活了 MKK7。因此，证明了TIP41蛋白消耗和TRAIL处理激活了MKK7， 而JNK转导途径通过其被激活(图14B)。
下面提供本发明组合物的制备例：
<制剂例1>制备药物制剂
<1-1>制备粉剂
TIP41蛋白表达或活性抑制剂2g
乳糖1g
将上述成分混合后装入密封袋以制备成粉剂。
<1-2>制备片剂
TIP41蛋白表达或活性抑制剂100mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
将上述成分混合后按照常规制备方法压片以制备成片剂。
<1-3>制备胶囊剂
TIP41蛋白表达或活性抑制剂100mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
将上述成分混合后按照常规片剂制备方法封装入明胶胶囊中以 制备成胶囊剂。
<1-4>制备丸剂
TIP41蛋白表达或活性抑制剂1g
乳糖1.5g
甘油1g
木糖醇0.5g
将上述成分混合后按照常规方法制备成丸剂，其中每丸重4g。
<1-5>制备颗粒剂
TIP41蛋白表达或活性抑制剂150mg
大豆提取物50mg
葡萄糖200mg
淀粉600mg
将上述成分混合后加入100mg的30%乙醇，然后在60℃干燥。 制粒后将颗粒装入包装袋中。
工业实用性
如上所述，当用TIP41 siRNA处理TRAIL-抗性的肝癌细胞系以 抑制表达、然后用TRAIL处理时，诱导了癌细胞系的特异性细胞凋 亡。同样的效果不仅在TRAIL-抗性的肝癌细胞系也在TRAIL-抗性的 肺癌和结肠癌细胞系中发现。另外，当小鼠接受癌细胞移植并施予 TIP41 siRNA和TRAIL后，癌细胞大小减小并诱导了癌细胞的细胞凋 亡。基于上述所示的效果，本发明的包括TIP41表达或活性抑制剂的 组合物可用于增强TRAIL敏感性或用作预防和治疗癌症的抗癌助 剂。
机译： 用于增强TRAIL敏感性的组合物，其包含作为TRAIL敏化剂的靶基因的TIP41的表达或活性抑制剂
机译： 用于提高TRAIL敏感性的组合物，其包含作为TRAIL敏化剂的靶基因的TIP４１的表达或活性抑制剂
机译： 增强TRAIL敏感性的组合物，其包含用于抑制TRAIL敏化靶基因TIP41的表达或活性的抑制剂
