植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用

摘要

本发明公开了一种植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用。本发明提供的GmVP蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将GmVP基因导入目的植物中，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将含有筛选基因和目的基因的重组表达载体导入目的植物中，通过耐盐性筛选得到含有所述目的基因的转基因植物；所述筛选基因为GmVP基因。本发明将在植物育种，特别是大豆育种中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用。

背景技术

盐碱土是地球上广泛分布的一种土壤类型，全球约有8亿公顷的陆地受到盐胁迫 的影响（占据了世界陆地面积的6%），近50%的灌溉农田受到盐分影响。受自然和耕作 方式等因素的影响，受盐碱影响的耕地面积还在不断增加，该问题在干旱和半干旱地 区表现得尤为突出。中国盐碱土面积约1亿公顷，其中现代盐渍化土壤约0.37亿公顷， 残余盐渍化土壤约0.45亿公顷，潜在盐渍化土壤约0.17公顷。随着全球气候变暖和 灌溉农业的发展，土壤质量将面临更大的挑战，盐碱化土壤的面积将不断扩大。

植物耐盐性是个复杂的数量性状，开展植物耐盐性研究，了解其相关基因、调控 通路对全面认识和改良植物耐盐性具有重要意义。

目前研究认为氢离子焦磷酸酶类是定位于植物液泡膜结构的H⁺离子转运蛋白，能 够通过无机焦磷酸酶的水解作用使得PPi水解，并实现H⁺跨膜转运，调节液泡和细胞 质的酸化作用，帮助建立液泡膜内外电化学梯度，为各种物质（如离子、氨基酸、糖 类等）提供跨膜转运动力。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用。

本发明提供的植物耐盐相关蛋白，命名为GmVP（Glycine max vacuolar  pyrophosphatase）蛋白，来源于豆科大豆属栽培大豆（Glycine max（L.）Merrill）， 是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物耐盐相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

  标签   残基   序列   Poly-Arg   5-6（通常为5个）   RRRRR   Poly-His  2-10（通常为6个）   HHHHHH   FLAG   8   DYKDDDDK   Strep-tag II   8   WSHPQFEK   c-myc   10   EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个 或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′ 端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述GmVP蛋白的基因（GmVP基因）也属于本发明的保护范围。

所述GmVP基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列2自5’末端第1至2403位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表的序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐相关蛋白的DNA 分子；

4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐盐相关蛋白的 DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下 杂交并洗膜。

含有所述GmVP基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元 农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非 翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所 述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表 达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它 们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载 体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个 序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的， 也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

所述重组表达载体具体可为将所述GmVP基因插入pGFPGUSplus载体的多克隆位点 得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述GmVP基因导入目的植物中， 得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。所述GmVP基因具体可通过以上任一所述 重组表达载体导入所述目的生物中。含有有所述GmVP基因的重组表达载体可通过使用 Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基 因枪等常规生物学方法转化所述生物的细胞或组织。所述目的植物可为单子叶植物或 双子叶植物。所述双子叶植物可为大豆属植物，具体可为大豆属大豆，如文丰7号。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将含有筛选基因和目的基因的重组 表达载体导入目的植物中，通过耐盐性筛选（如采用100mmol/L NaCl筛选）得到含有 所述目的基因的转基因植物；所述筛选基因为所述GmVP基因。所述筛选基因和目的基 因具体可通过重组表达载体导入所述目的生物中。携带有所述筛选基因和目的基因的 重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注 射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化所述生物的细胞或组织。所述 目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为大豆属植物，具体可为 大豆属大豆，如文丰7号。所述筛选基因和目的基因具体可通过如下重组表达载体导 入所述目的生物中：将所述GmVP基因插入pGFPGUSplus载体的多克隆位点得到的重组 质粒。所述目的基因具体可为GUS基因。

所述GmVP基因作为筛选基因的应用也属于本发明的保护范围。

以上任一所述方法均可用于植物育种。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。 所述双子叶植物可为大豆属植物，具体可为大豆属大豆，如文丰7号。

GmVP蛋白属于植物氢离子焦磷酸酶类，将GmVP基因导入大豆后，可能显著显加 转基因大豆发状根系对盐胁迫的耐受性。基于上述原理，GmVP基因可用于培育耐盐转 基因植物，也可用作筛选基因（用于转基因材料创制过程中转基因材料的筛选，即将 GmVP基因和目的基因构建重组表达载体，导入植物后，通过耐盐性筛选转目的基因的 植物）。本发明为通过分子手段培育和创制耐盐转基因材料和品种提供了依据，将在植 物耐盐性的遗传改良中发挥重要作用。本发明对于植物育种（特别是大豆育种）具有 重大价值。

附图说明

图1为实施例1中的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为重组质粒丙的结构示意图。

图3为实施例3中的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为实施例5中的发状根耐盐鉴定照片。

图5为实施例6中的GUS染色结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。下述实施例中的引物合成及测序工作均由深圳华大公司完成。

文丰7号（大豆耐盐品种）：山东省农业科学院作物所于1963年以莒选23为母本， 齐黄1号为父本进行杂交，经济宁地区农科所鉴定而育成，1971年定名为文丰7号，品 种编号为“鲁1707”，文丰7号在国家农作物种质保存中心（依托单位为中国农业科学 院作物科学研究所）长期保存，可免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人员使用； 提及“文丰7号”的参考文献：邵桂花,万超文,李舒凡.大豆萌发期耐盐生理初步研 究.作物杂志,1994,(6):25-27；由中国农业科学院作物科学研究所提供给申请人。

pGFPGUSplus载体：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材 料的非专利文献是：Claudia E.Vickers,Peer M.Schenk,DongxueLi,et al. pGFPGUSPlus,a new binary vector for gene expression studies and optimising  transformation systems in plants.Biotechnol Lett,2007,29:1793–1796。

发根农杆菌K599：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料 的非专利文献是：Claudia E.Vickers,Peer M.Schenk,DongxueLi,et al. pGFPGUSPlus,a new binary vector for gene expression studies and optimising  transformation systems in plants.Biotechnol Lett,2007,29:1793–1796。

实施例1、GmVP蛋白及其编码基因的发现

一、GmVP序列片段的获得及证实

通过盐胁迫抑制差减杂交文库获得EST序列，进一步比对同源作物的基因组序列， 设计特异性引物M1和M2。

将文丰7号在蛭石和营养土混合盆皿中培养至第一片真叶展开，在1/2hoagland 营养液中加入0.9g/100mL NaCl，水培法处理幼苗，待24小时后取盐处理材料根系， 提取总RNA，并反转录为cDNA，以其为模板用M1和M2特异引物对进行RT-PCR。

特异引物序列如下：

M 1:5’-ATGATGGAGGATGACATGGAG-3’；

M2:5’-TCACAGGAAGACTGGAGCCATT-3’。

RT-PCR反应体系：Ex Taq Buffer 2μl、Ex Taq 0.2μl、dNTP Mix(2.5M)3.0μl、 M1(10μM)0.5μl、M2(10μM)0.5μl、cDNA 2μl、ddH₂O12.8μl。

PCR程序：94℃4min；94℃30s、57℃40s、72℃2.5min，28个循环；72℃5min。

将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果见图1，其中，M为DL2000的DNA分子量标 准，1为PCR产物。将PCR产物进行测序，结果表明，PCR产物为2406bp，如序列表的序 列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GmVP蛋白，该蛋白具有离子焦磷酸酶活性的 功能区域。

将编码GmVP蛋白的基因命名为GmVP基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、重组表达载体的构建

一、重组质粒甲和重组质粒乙的构建

1、随机选取PMD18-T simple载体（购自TaKaRa公司，目录号：D103A）的一段序 列，设计特异引物对F1和R1。

F 1：5’-GTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATG-3’；

R 1：5’-CTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGC-3’。

2、以PMD18-T simple载体为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。

3、将步骤2的PCR扩增产物插入PMD20-T载体（购自TaKaRa公司，目录号：D107A）， 得到重组质粒甲。

4、用限制性内切酶Sac Ⅰ和XbaⅠ双酶切重组质粒甲，回收约1300bp的DNA片段(该 DNA片段如序列表的序列3所示)。

5、用限制性内切酶Sac Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切pGFPGUSplus载体，回收载体骨架（约 12935bp）。

6、将步骤4回收的DNA片段与步骤5回收的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据 测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：用序列表的序列3自5’末端第7至1370 位核苷酸所示的双链DNA分子（其中第1365至1370位核苷酸为Kpn Ⅰ酶切识别序列）取 代了pGFPGUSplus载体XbaⅠ和Sac Ⅰ酶切位点之间的小片段。

二、重组质粒丙的构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物。

F2：5’-gcTCTAGAATGATGGAGGATGACATGGAG-3’（下划线标注XbaⅠ酶切识别序列）；

R2：5’-ccGGTACCTCACAGGAAGACTGGAGCCATT-3’（下划线标注Kpn Ⅰ酶切识别序列）。

3、用限制性内切酶XbaⅠ和Kpn Ⅰ双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶XbaⅠ和Kpn Ⅰ双酶切重组质粒乙，回收载体骨架（约13000bp）。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒丙（又称重组质粒 pGUS-GmVP)。根据测序结果，对重组质粒丙进行结构描述如下：用序列表的序列2所示 的双链DNA分子取代了重组质粒乙XbaⅠ和Kpn Ⅰ酶切位点之间的小片段（事实上，重组 质粒乙的构建仅是为了在pGFPGUSplus载体的Sac Ⅰ前添加Kpn Ⅰ酶切位点）。重组质粒 丙的结构示意图见图2。

实施例3、转基因材料（转基因发状根）的获得

一、制备重组农杆菌

1、用重组质粒pGUS-GmVP转化发根农杆菌K599感受态细胞，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌接种于YEP液体培养基（含卡那霉素50mg/L），28℃、270rmp振荡 培养，得到OD600=0.6-0.8的重组农杆菌菌液。

二、制备遗传转化用外植体

1、灭菌

取无病虫害和斑点、饱满、均一、干燥的文丰7号种子，完全平铺在培养皿中，加 盖培养皿盖并封口，然后将培养皿放入干燥器中；然后在干燥器中放入100ml容量的烧 杯，倒入80ml次氯酸钠水溶液（次氯酸钠浓度为12M，次氯酸钠购自北京益利精细化学 品有限公司），再慢慢加入4ml浓盐酸；然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置 12-16h。

2、灭菌结束后，取出培养皿，在超净台中打开培养皿盖，释放残余氯气；然后用 镊子夹取种子，在超净台中接种于发芽培养基上，盖上培养皿但不封口，在温度为24 ℃，光量子为150mol/m²·s的培养间培养5d（每天光照16小时，黑暗8小时）。

发芽培养基（pH5.7）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：3.12g/L B5盐（购自Phytotech 公司，货号M524）、30g/L蔗糖（购自北京化工有限公司）、7.5g/L琼脂（购自上海生 物工程股份有限公司，货号AN5255）。

3、完成步骤2后，取发芽良好的种子，进行如下操作，得到外植体：用镊子剥去 种皮，切除部分下胚轴（剩余部分还保留3-5mm的下胚轴），在剩余部分的子叶节点（又 称子叶基部）处平行划伤5-7次。

三、侵染

将步骤二得到的外植体在步骤一制备的重组农杆菌菌液中浸泡30min，然后倒掉菌 液，将子叶内面（平滑面）向下平铺在铺有滤纸的MSCCM培养基上，置于光照培养箱中 培养。培养条件22℃培养5d（每天光照16小时，黑暗8小时）。

MSCCM培养基（pH5.4）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.43g/L MS盐（购自拜 尔迪有限公司）、200mM乙酰丁香酮（购自Sigma，货号D5545）、150mg/L二硫苏糖醇 （DL-Dithiothreitol，DTT；购自Sigma，货号D5545）、100mg/L半胱氨酸（拜尔迪 公司）、30g/L  蔗糖、7.5g/L  琼脂、3.9mg/L  2-吗啉乙磺酸 （2-(4-Morphol ino)ethanesulfonic acid，MES；购自拜尔迪公司）。

四、诱导发状根

将经过共培养的外植体用1/2MS液体培养基清洗3-4遍，再用1/2MS液体培养基浸 泡30min，然后倒掉培养基，用滤纸吸干培养液；然后将外植体内面（平滑面）斜向上 插入1/2MS固体培养基（含有6mg/l潮霉素B，潮霉素B购自Sigma，货号HO654）中，透 气膜封口，然后在温度为24℃，光量子为150mol/m²·s的培养间培养至发状根长出（每 天光照16小时，黑暗8小时）。

1/2MS液体培养基（pH5.8）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：2.17g/L MS盐、0.6mg/L MES、250mg/L头孢霉素（购自上海生物工程股份有限公司，货号CB1276）、250mg/L 羧苄青霉素（购自INALCO，货号1758-9317）、30g/L蔗糖。

1/2MS固体培养基（pH5.8）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：2.17g/L MS盐、0.6mg/L MES、250mg/L头孢霉素、250mg/L羧苄青霉素、75g/L琼脂、30g/L蔗糖。

五、发状根GUS染色（β-葡萄糖醛酸糖苷酶显色反应）

切下发状根并将上部的一段浸入GUS染液中（确保发状根根尖不损伤），将发状根 下端按顺序平放于1/2MS固体培养基上，在37℃培养箱培养1d，显示蓝色即为GUS检测 阳性。

GUS染液的配制方法：将80ml磷酸钠缓冲液、1ml铁氰化钾母液、1ml亚铁氰化钾母 液、2ml EDTA母液、5ml x-Gluc溶液和20ml甲醇混匀，避光保存。

x-Gluc溶液；将100mg x-Gluc(-20℃保存)溶于5ml二甲基亚砜。

磷酸钠缓冲液（pH7.0）：将39ml A液与61ml B液混合，用蒸馏水定容至400ml；A 液：将3.12g NaH₂PO₄.2H₂O溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至100ml（浓度为0.2mol/L）；B 液：将7.17g Na₂HPO₄.12H₂O溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至100ml（浓度为0.2mol/L）。

铁氰化钾母液：将3.295g铁氰化钾溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至200ml（浓度为 50mmol/L），避光保存。

亚铁氰化钾：将4.224g亚铁氰化钾溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至200ml（浓度为 50mmol/L），避光保存。

EDTA母液（pH8.0）：称取EDTA-Na₂·2H₂O 18.6g，加入6gNaOH，用约80ml超纯水溶 解并定容为100ml（终浓度为0.5mol/L）。

六、PCR检测

取GUS检测为阳性的发状根，提取基因组DNA并以基因组DNA为模板用F3(对应载体 骨架)和R3（对于序列2中的部分片段）组成的引物对进行PCR检测。

F3：5’-TCCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’；

R3：5’-AACTGACACCCACATCCCTAC-3’；

PCR反应体系：Ex Taq Buffer 2μl、Ex Taq 0.2μl、dNTP Mix(2.5M)3.0μl、 F3(10μM)0.5μl、R3(10μM)0.5μl、cDNA 2μl、ddH₂O 12.8μl。

PCR反应程序：94℃4min、94℃30s、55℃30s、72℃1min，30个循环；72℃5min。

将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。部分结果见图3，其中，M为DL2000的DNA分子 量标准，1-5为PCR检测为阳性样本（目的片段大小约600bp），CK-为实施例4得到的转 空载体发状根，CK+为重组质粒丙。

PCR检测为阳性的发状根即为转基因发状根。

实施例4、转空载体材料的获得

用pGFPGUSplus载体代替重组质粒丙进行实施例3的操作，得到转空载体发状根。

实施例5、发状根的耐盐鉴定

将转基因发状根、转空载体发状根分别进行如下平行的分组处理（每组处理中， 转基因发状根和转空载体发状根各10个；重复进行三次试验）：

第一组：将发状根整齐摆放在1/2MS固体平板上；

第二组：将发状根整齐摆放在含50mmol/L NaCl的1/2MS固体平板上；

第三组：将发状根整齐摆放在含100mmol/L NaCl的1/2MS固体平板上；

第四组：将发状根整齐摆放在含150mmol/L NaCl的1/2MS固体平板上；

第五组：将发状根整齐摆放在含200mmol/L NaCl的1/2MS固体平板上；

各组处理均在温度为24℃，光量子为150mol/m²·s的光照培养箱中培养15d（每 天光照16小时，黑暗8小时），观察发状根长势，拍照并统计每个处理下发状根的伸 长量（即与处理的初始时刻相比，培养15天后发状根的生长量）。

培养15天后的照片见图4。

培养15天后，第一组至第五组转基因发状根的伸长量依次为5.06厘米、3.95厘 米、1.81厘米、1.81厘米和0.38厘米。第一组至第五组转空载体发状根的伸长量依 次为5.72厘米、2.38厘米、1.19厘米、0.31厘米和0.16厘米。

计算培养15天后，与第一组相比，其它几组发状根的相对伸长率。结果见表2（三 次试验的平均值）。

表2发状根在不同浓度NaCl胁迫下的相对伸长率（%）

在50、100、150、200mM NaCl处理下转基因的发状根相对伸长率分别为转空载体 发状根的1.87、1.72、6.46、2.71倍，即转基因发状根在盐胁迫条件下可以维持较高 根系伸长量，表现为极显著差异。结果表明，GmVP基因能提高大豆根系在盐胁迫下的 生长量，有助于提高大豆的耐盐性。

实施例6、GmVP基因作为筛选标记的应用

本实施例中，将GUS基因作为目的基因，GmVP基因作为筛选基因。

一、制备重组农杆菌

同实施例3的步骤一。

二、制备遗传转化用外植体

同实施例3的步骤二。

三、侵染

同实施例3的步骤三。

四、筛选转基因发状根

1、将经过共培养的外植体用1/2MS液体培养基清洗3-4遍，再用1/2MS液体培养 基浸泡30min，然后倒掉培养基，用滤纸吸干培养液。

2、完成步骤1后，随机取60个外植体，随机分成两组，每组30个，分别进行如下 处理：

实验组：将外植体内面斜向上插入1/2MS固体培养基（含100mmol/L NaCl）中，透 气膜封口，然后在温度为24℃，光量子为150mol/m².s的培养间培养8天（每天光照16 小时，黑暗8小时）；

对照组：将外植体内面斜向上插入1/2MS固体培养基中，透气膜封口，然后在温度 为24℃，光量子为150mol/m²·s的培养间培养8天（每天光照16小时，黑暗8小时）；

每组随机选择20个发状根进行GUS染色，统计阳性率。

部分染色照片见图5，其中CK为对照组得到的某个发状根的照片（GUS染色结果为 阴性），1-5为实验组得到的某5个发状根的照片（GUS染色结果均为阳性）。

进行三次重复实验。对照组三次试验的阳性率分别为16%，20%和18%。实验组三次 实验的阳性率分别为75%、78%和80%。结果表明100mmol/L NaCl筛选能明显提高发状根 的阳性率，即GmVP蛋白或其编码基因能作为选择标记应用于转基因发状根的筛选中。

实际应用中，可以将GmVP基因作为筛选标记，与目的基因共转染出发植物，然后 通过盐浓度筛选含有目的基因的转基因植物。