一种促进美达霉素生物合成的基因工程菌及其应用

摘要

本发明提出一种促进抗生素美达霉素合成的基因工程菌及其用于美达霉素生产的方法，是以纳士威尔链霉菌AM-7161基因组DNA为模板，利用简并引物进行PCR扩增，获得一个新的链霉菌核糖体再循环因子的基因全序列；并将这个基因置于链霉菌高效启动子P

说明书

技术领域：

本发明涉及的是提高抗肿瘤抗生素美达霉素产量的遗传育种方 法，特别是一种来自纳士威尔链霉菌的核糖体再循环因子(ribosome  recycling factor，RRF)的克隆以及用于抗生素美达霉素高产菌育种 的方法。此链霉菌核糖体再循环因子能够促进美达霉素的积累，大大 提高抗生素的生物合成效率。

背景技术：

链霉菌能产生许多有用的抗生素，但多数天然菌株产生抗生素的 水平很低，限制了对抗生素的进一步开发，所以抗生素高产菌的育种 一直是抗生素产业中的瓶颈。目前抗生素高产菌育种的手段有很多， 包括传统的物化诱变、原生质体融合、分子诱变以及通过代谢工程进 行定向遗传改造等等。

在链霉菌体内抗生素的生物合成水平受到多种调控因素的控制， 包括多效调节因子(能调控不止一种代谢产物的积累，并且对细胞的 分化也有调控作用)、途径专一性调控基因(调节特定途径的次生代 谢)、体外信号分子等。营养物质对抗生素合成也有调节作用。抗生 素合成中的关键酶的限速作用、一些辅酶及前体的供应对抗生素的合 成效率都有很大影响。因此，抗生素的产生受到多层次的调控【王琳 淇等.微生物学报.2009；49(4)：411-416】。

在抗生素高产菌遗传育种中，最常用的靶点是途径专一性的调节 因子，这些基因位于抗生素生物合成基因簇中，敲除一些负调控因子， 或超量表达一些正调控因子都有助于提高抗生素的合成水平。对一些 链霉菌中特有的多效调节基因的遗传改造也有助于抗生素高产菌的 育种【雷健等.药物生物技术.2007；14(3)：225-229】。

核糖体再循环因子RRF在细胞中参与蛋白质合成过程，是蛋白 质合成中不可缺少的成分。在蛋白质合成结束后，RRF会与翻译延伸 因子一起把核糖体从mRNA上解离下来，参与下一轮蛋白质合成。 从三维结构来看，这个RRF蛋白更像是tRNA的结构类似物，所以 有科学家认为核糖体从mRNA上解离过程依赖的是RRF的类tRNA 结构。后有研究表明在大肠杆菌中RRF主要与50S核糖体亚基作用， 推测它与核糖体结合后占据了乙酰化的tRNA结合位点，导致tRNA 从核糖体上解离【Yokoyama T等，EMBO J.2012；31(7)：1836-1846】。

核糖体再循环因子RRF毋庸置疑决定蛋白质的合成水平，所以 RRF成为抗生素遗传育种的新型靶点【Li L等，JIndMicrobiol  Biotechnol.2010；37(7)：673-679】，因为抗生素生物合成的一些结构 酶的表达也依赖于核糖体再循环因子。

芳香聚酮抗生素美达霉素属于苯并异色烷醌 (benzoisochromanequinones)家族，可由纳士威尔链霉菌AM-7161 (Streptomyces nashivillensis AM-7161)产生，具有抗菌和抗肿瘤的生 物学活性，可以以一种新颖的机制阻断多种肿瘤细胞的信号传导，是 一种具有开发潜力的抗癌药物【Salaski EJ等，JMed Chem.2009；2(8)： 2181-2184】。

为提高野生菌纳士威尔链霉菌AM-7161中美达霉素的生物合成 水平，本发明旨在从AM-7161中克隆了核糖体再循环因子，并把它 构建成高表达质粒，导入美达霉素产生菌中，有效促进了美达霉素的 产量。

发明内容：

本发明目的是从苯并异色烷醌类抗肿瘤抗生素美达霉素的野生 型产生菌中克隆核糖体再循环因子RRF的编码基因(frr)，构建这个 基因的高效表达质粒，导入美达霉素的产生菌内并实现高效表达，从 而促进美达霉素的生物合成。

本发明是这样实现的：对GenBank中来自其它细胞的核糖体再 循环因子的编码基因(frr)序列进行比对，根据它们的序列保守性设 计简并引物，选择以美达霉素产生菌纳士威尔链霉菌AM-7161的基 因组为模板，对核糖体再循环因子基因进行PCR扩增。将PCR产物 的测序结果进行同源性比对后，将它克隆到链霉菌高效表达质粒 pIJ8600上，获得一个核糖体再循环因子高效表达链霉菌质粒 pHSL56.2。然后通过原生质体转化，将pHS56.2导入美达霉素产生 菌AM-7161中，构建工程菌AM-7161/pHSL56.2。在工程菌 AM-7161/pHSL56.2细胞内核糖体再循环因子的高效表达对美达霉素 产生水平起到促进作用。

具体步骤为：

(1)纳士威尔链霉菌AM-7161中核糖体再循环因子的PCR扩 增、克隆和测序：首先从GenBank中下载来自不同细胞的核糖体再 循环因子的基因序列，进行序列比对，根据序列保守区域设计了简并 引物(上游引物：5′-GTGATCGAA GARAYCCTC-3′；下游引 物：5′-TCAGACYTCRAGSAGCTC-3’)(图1)；提取美达霉素产生菌 AM-7161的基因组DNA为模板，在常规PCR条件下，进行PCR扩 增，获得了558bp的产物。将扩增产物通过平端连接克隆到pT7Blue 载体上，送公司测序，将测序获得的序列进行BLAST同源性比对， 与GenBank中的来自其它细胞的核糖体再循环因子的序列相比，同 源性最高达98％，所以认为扩增的序列编码产物确实是美达霉素产生 菌AM-7161的核糖体再循环因子。将序列上传到GenBank中，获得 序列号为JF807993。

(2)纳士威尔链霉菌AM-7161核糖体再循环因子高效表达质粒 的构建。

利用基因特异性引物(上游引物：

5’-GGAATTCCATATGATCGAAGAG ACC CTC；下游引物： 5’-CGGGATCCTCAGACTTCGAGCAGCTC)对获得的核糖体再循环 因子编码基因进行PCR扩增；然后经NdeI和BamHI酶切后，将PCR 产物连接到常用的链霉菌高效表达载体(pIJ8600)上，获得含有 AM-7161核糖体再循环因子的表达质粒pHSL56.2。在这个质粒上， 核糖体再循环因子的编码基因(frr)位于一个高效链霉菌启动子P_tipA之下，所以核糖体再循环因子的表达受到硫链丝菌素的诱导(图2) (没有硫链丝菌素诱导情况下，也会有一定的本底表达)。

(3)核糖体再循环因子高效表达工程菌的构建：

利用常规方法，通过原生质体转化将pHSL56.2导入宿主细胞-- 美达霉素产生菌纳士威尔链霉菌AM-7161中，获得工程菌 AM-7161/pHSL56.2(分类命名Streptomyces  nashvillensis AM-7161/pHSL56.2)，该菌株于2012年3月29日在中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No.M 2012093。

(4)利用核糖体再循环因子的高效表达促进美达霉素产生水平。

高效表达可以用固体培养或液体培养的方案进行。

固体培养方案----吸取工程菌AM-7161/pHSL56.2的孢子悬液接 入固体R4产素培养基，进行30℃、5天的培养，用抗生素积累的 颜色变化记录产素水平。美达霉素在固体R4产素培养基中呈现特有 的红褐色，所以色泽的变化代表产素能力的变化(图3)。收集固体 培养物切成小块后，进行乙酸乙酯提取。每升固体R4产素培养基配 方为：琼脂粉15.0g，葡萄糖10.0g，酵母膏1.0g，酪蛋白水解物0.1 g，K₂SO₄，0.2g，MgCL₂·6H₂O 10.0g，TES 5.6g，微量元素溶液2 毫升，CaCL₂·2H₂O 4.0g，其余为水，pH 7.2(用KOH调整)。培养 基灭菌后加入硫链丝菌素终浓度为12.5μg/ml；微量元素溶液配方为： CaCL₂·2H₂O 4.0g/l，L-Proline 3.0g/l，其余为水，pH 7.2。

液体培养方案----吸取工程菌AM-7161/pHSL56.2的孢子悬液转 入种子培养基中进行30℃、200转/分钟培养两天；每升种子培养基配 方：酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，牛肉膏3.0g，葡萄糖20.0g，NaCl 3.0g，CaCO₃10.0g，pH 7.0。将获得的种子培养物转接到R4产素液 体培养基中，30℃、200转/分钟进行培养4-7天，对发酵液进行离心， 收集上清液，调整pH至中性，乙酸乙酯萃取后，用LC/MSn检测美 达霉素产量的变化(图4)。每升液体R4产素培养基配方为：葡萄糖 10.0g，酵母膏1.0g，酪蛋白水解物0.1g，K₂SO₄0.2g，MgCL₂·6H₂0 10.0g，TES 5.6g，微量元素溶液2毫升，CaCL₂·2H₂O 4.0g，其余为 水，pH 7.2(用KOH调整)；微量元素溶液配方为：CaCL₂·2H₂O 4.0 g/l，L-Proline 3.0g/l，其余为水，pH 7.2。培养基灭菌后加入硫链丝 菌素终浓度为12.5μg/ml。

本发明使用的微生物：

1、美达霉素产生菌-纳士威尔链霉菌AM-7161(简称AM-7161)： 这个菌株的基因组中携带有本发明中的核糖体再循环因子的编码基 因，所以为这个基因的PCR扩增提供了模板。另外，在本发明中这 个菌是个宿主菌，当核糖体再循环因子的高效表达质粒导入这个菌株 后，基因组上这个基因的拷贝数发生翻倍，可以高效表达，表达效率 比野生菌株高。其三，这个菌株是美达霉素的产生菌，在核糖体再循 环因子高效表达后，可以检测到核糖体再循环因子对美达霉素的产生 具有促进效果。

AM-7161菌株菌学特性：

纳士威尔链霉菌AM-7161在R4固体培养基上生长迅速，相较一 般链霉菌而言，AM-7161生长是非常快的，一般链霉菌在固体培养基 上是5-7天才开始产孢，而AM-7161却2-3天就开始产孢。

在没有形成孢子之前培养基呈现出基质菌丝的颜色，色泽较浅； 培养至中后期，菌落周围培养基出现黄褐近红褐色色素，主要是由于 美达霉素分泌所致。

A形态特性：它是一种G⁺细菌，在固体培养基中培养时呈现典 型的链霉菌培养特征，即有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝的分化。菌 落表面干燥致密。幼龄菌落由于菌丝初生，表面光滑很像细菌菌落， 基质菌丝深入到培养基内，灰白色，比一般链霉菌容易挑起。培养 24小时后产生气生菌丝，灰白色，覆盖在菌落表面，使菌落呈绒毛 状。三天后，气生菌丝可分化形成灰白色孢子，布满菌落表面，使菌 落呈现颗粒状或粉状，不透明，有褶皱，菌落周围有放射状菌丝。

B生理特性：可以利用多种碳源，如淀粉、葡萄糖，在常规链霉 菌培养基中生长良好。生长到对数后期可进入次生代谢物积累阶段。 菌株本身会产生具有抗肿瘤活性的苯并异色烷醌类抗生素美达霉素。 在含有核糖体再循环因子高效表达质粒的工程菌AM-7161/pHSL56.2 中，其产生美达霉素的能力大大提高。

除了把链霉菌核糖体再循环因子高效表达质粒pHSL56.2直接导 入纳士威尔链霉菌AM-7161菌株外，还可以将其直接导入产其它苯 并异色烷醌家族抗生素的链霉菌菌株或产其它芳香聚酮抗生素的链 霉菌菌株，如Streptomyces tanashiensis(积累kalafungin)；Streptomyces  rosa(积累nanaomyci)；Streptomyces olivaceus(积累granaticin)； Streptomyces fradiae(积累frenolicin)；Streptomyces sh iodaensis(积累 julimycin)；Streptomyces capoamus(积累capoamycin和cyclacidin)等， 形成对应的高效表达工程菌，预期可以提高相应抗生素的产生能力。 本发明产生的积极技术效果：

1、本发明利用简并引物从一株抗生素产生菌纳士威尔链霉菌的 基因组中对核糖体再循环因子基因进行了克隆。这个基因是克隆自没 有进行基因组测序的链霉菌菌株。对其测序后得到的碱基序列与 GenBank中的DNA序列进行比对，发现在GenBank数据库中没有找 到100％同源的基因，因此这个基因是从这个链霉菌中第一次克隆得 到，是个新基因(投放到数据库中已经获得序列号)。

2、将这个基因克隆出来，构建了一个链霉菌表达质粒pHSL56.2， 在高效启动子的作用下，在链霉菌中可以实现高效表达。选用的载体 pIJ8600导入链霉菌的效率比一般链霉菌载体高很多倍，可以整合插 入链霉菌基因组上的特定位点，而且许多产抗生素的链霉菌都含有这 样的整合位点。所以，以pIJ8600为基础构建的高效表达质粒 pHSL56.2可以很容易导入许多抗生素产生菌中实现高效表达。

3、将这个质粒导入美达霉素产生菌中可以促进美达霉素产生， 因为这种调控作用并非是针对某一种抗生素的相关酶的表达，所以具 有全局和通用性，预期对同一菌株中其它代谢产物的产生也有促进作 用，预期在许多近缘菌株中都可以发挥作用。

4、一般而言，抗生素的高产菌遗传育种多是利用常见的调控因 子，而利用这种核糖体再循环因子的方法还非常少见，从美达霉素(异 色烷醌类抗肿瘤抗生素)产生菌中获得这种调控因子并在这类抗生素 高产菌遗传育种中得到应用还是首次。

总之，这个来自纳士威尔链霉菌AM-7161的核糖体再循环因子 的克隆及高效表达质粒的构建可以在将来抗生素高产菌育种中发挥 其应用潜力。

附图说明

图1几种不同来源的链霉菌核糖体再循环因子的序列的同源性 比对结果及简并引物的设计

图解：7组核糖体再循环因子的基因序列分别来自于7株链霉菌： ①Streptomyces avermitilis MA-4680，②Streptomyces scabiei  87.22，③Streptomyces coelicolor A3(2)，④Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350，⑤Streptomyces sp.SA3_actG，⑥Streptomyces violaceusn iger Tü4113，⑦Streptomyces flavogriseus ATCC 33331)； 星号表示保守碱基，粗体表示非保守碱基；下划线表示引物设计依据 的模板序列。

图2核糖体再循环因子高效表达质粒pHSL56.2的构建过程

图解：表达质粒pHSL56.2的载体上各功能原件：Int是来自噬 菌体φC31的整合酶基因；aac(3)IV是阿泊拉霉素抗性基因；tsr是硫 链丝菌素抗性基因；tfd是终止子区域；PtipA是硫链丝菌素诱导型启 动子；oriT是接合转移功能区；attP是整合位点；ori是大肠杆菌复 制功能区。

图3工程菌AM-7161/pHSL56.2的固体发酵和乙酸乙酯萃取液 中显示的美达霉素的颜色变化

图4工程菌AM-7161/pHSL56.2液体发酵液提取离子色谱图

图解：液质连用多级质谱分析系统(LC/MSn)是1100LC/MSD Trap(Agilent)，分析条件：色谱柱：TSK gel ODS-80TM(4.6mm i.d.X 150mm，TOSOH C18反向柱子)；柱温：40℃；梯度洗脱：solventA(含 0.5％乙酸的乙腈)，solvent B(含0.5％乙酸的超纯水)；梯度范围：0 -5min，20％A；5-25min，20-70％A；25-28min，70-95％A；28 -32min，95％A；32-35min，95-20％A；离子源：ESI(+)。

具体实施方式：

应用PCR扩增方法，以未经测序的纳士威尔链霉菌AM-7161的 基因组为模板首先克隆到了一个可能编码链霉菌核糖体再循环因子 的基因，序列比对的结果发现克隆的基因编码产物属于核糖体再循环 因子。因为在GenBank数据库中未找到100％同源的基因，所以作为 一个新基因序列投放到GenBank数据库中(序列号为JF807993)；并 利用一个链霉菌表达载体pIJ8600克隆这个基因，获得一个高效表达 质粒pHSL56.2(将这个基因置于高效启动子P_tipA下游)，然后通过原 生质体转化，将pHSL56.2导入抗肿瘤抗生素美达霉素产生菌 AM-7161中，获得基因工程菌株AM-7161/pHSL56.2。

实施例1：

工程菌AM-7161/pHSL56.2的固体发酵：

鉴定8个可能含有质粒pHSL56.2的重组菌株 AM-7161/pHSL56.2，在30℃下固体R4培养基上培养5天至产孢， 收集孢子，保存在20％的甘油中冻存。取工程菌AM-7161/pHSL56.2 和野生菌AM-7161孢子悬液分别涂布在20ml固体R4培养基上(R4 培养基配方见发明内容，培养野生菌AM-7161时培养基中不添加硫 链丝菌素，因为野生菌AM-7161无硫链丝菌素抗性)；放在30℃下 静置培养3-5天，可以看到由于核糖体再循环因子的高效表达从而导 致美达霉素产生量明显提高(分泌到培养基中显红褐色)(图3)；收 集固体培养物(连同培养基)，切成小块，用乙酸乙酯萃取三遍，用 无水硫酸钠除水，滤纸过滤。旋转蒸发去掉乙酸乙酯，最后再在少量 乙酸乙酯中溶解。乙酸乙酯萃取液中的红褐色表示工程菌 AM-7161/pHSL56.2中美达霉素产量明显提高。在434nm下测定OD 值(美达霉素在434nm有特征性吸收)。工程菌AM-7161/pHSL56.2 的粗提物的OD₄₃₄较野生菌提高到3-4倍。

实施例2：

工程菌AM-7161/pHSL56.2的液体发酵：

吸取工程菌AM-7161/pHSL56.2的孢子悬液50μl接种于5mL 种子培养基中(培养基配方见发明内容)，在200转/分、30℃下培养 2天，然后按1∶100的比例将种子培养物转接入液体R4产素培养基 中(培养基配方见发明内容，添加12.5μg/ml硫链丝菌素作为诱导剂)， 在200转/分、30℃下培养5-6天。将发酵液转入50ml离心管中， 室温下3000rpm，离心10min，收集上清。上清调pH至中性，用乙 酸乙酯萃取三遍，萃取液混合后，加水萃取一遍(洗)，用无水硫酸 钠粉剂过滤除水，滤纸过滤，旋转蒸发去掉乙酸乙酯，最后在乙酸乙 酯中溶解。

收集的粗提物进行LC/MSn检测(美国Agilent公司离子阱质谱连用仪 1100LC/MSD Trap，多级质谱分析)。检测条件：色谱柱为TSK gel ODS-80TM(4.6mm i.d.X 150mm，TOSOH C18反向柱子)，柱温40 ℃，离子化方式为ESI(电喷雾电离)；用洗脱液A(含0.5％乙酸的 乙腈)和洗脱液B(含0.5％乙酸的超纯水)进行梯度洗脱，梯度范围设 置为：0-5min，20％A；5-25min，20-70％A；25-28min，70-95％A； 28-32min，95％A；32-35min，95-20％A；流速为1.0ml/min。图4为 提取离子色谱(extracted ion chromatogram，EIC)。因为目标化合物 美达霉素的分子量为457，其分子离子峰M+1的值是458，所以EIC 图中设置的提取值为458。图4显示在这些条件下检测20μl萃取粗 提物，可以检测到目标化合物美达霉素，其保留时间在12.5min左右 (二级质谱加以验证，图略)。通过比较野生菌和工程菌发酵液在12.5 min位置的峰面积显示美达霉素在工程菌中的产量较野生菌中提高 到3倍，还有一些其它代谢产物的产量也有明显增加(如15min左 右的峰)。