一种小分子肺癌靶向放射治疗剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种小分子肺癌靶向放射治疗剂，其是由同位素131I标记含有XGXG结构的8肽分子后所得，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种。本发明还公开了上述小分子肺癌靶向放射治疗剂的制备方法。本发明的小分子肺癌靶向放射治疗剂具有良好的稳定性和生物分布特性，能明显抑制人肺癌裸鼠动物模型体内肿瘤的生长，对肝脏、肾脏、肺脏及心脏等重要器官无明显毒副作用，适用于非小细胞肺癌（鳞癌和腺癌）患者的靶向治疗，在肺癌的分子靶向治疗方面具有重大的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种小分子肺癌靶向放射治疗剂及其制备方法。

背景技术

全国抗癌协会最新公布的调查资料显示，肺癌已成为我国人群特别是城市居民中死亡率最高的癌症，严重危及着我国人群的健康与生命。肺癌的临床预后差的主要原因在于约80%的肺癌患者确诊时已属晚期，失去了最佳的手术治疗时机，此时化疗和局部的放射治疗成为主要的治疗方法，但肺癌患者对化疗药物易产生抗药性，同时化疗对人体健康的整体性危害较大，处于肺癌晚期患者常常因无法耐受化疗的痛苦而放弃治疗；而放疗目前主要作为肺癌的姑息治疗手段，如缓解疼痛和减轻症状。因此，对于大部分晚期肺癌患者尚无有效的治疗方法，已成为提高肺癌患者生存率的主要障碍，是肺癌临床治疗急需解决的重点问题之一。

分子靶向药物因能特异性作用于肺癌细胞，而且毒性反应较轻，显示出较好的临床应用前景和肺癌治疗的发展趋势，为治疗晚期肺癌患者提供了新途径。但由于目前临床上应用的分子靶向药物如易瑞沙、特罗凯等、恩度等，或是EGFR受体抑制剂，或是VEGF受体抑制剂，均需要患者长期使用且疗效仅对部分人有效，患者也常常因最终难以支付高额药费而放弃治疗。目前国内临床使用的易瑞沙，由于临床试验未能证实其延长了患者生存期，美国FDA已严格限制其在美国的临床应用。

相对于分子靶向药物，另一类肿瘤靶向治疗方法是放射免疫疗法（radioimmunotherapy，RIT），随着放射免疫治疗剂⁹⁰Y-ibritumomabn（商品名Zevalin）和¹³¹I-tositumoma（商品名Bexxar) 在淋巴瘤的治疗中取得了显著疗效，并取得了年销售额近10亿美金的良好经济效益，放射免疫治疗成为继化疗后又一重要的肿瘤靶向治疗方法。

¹³¹I-chTNT（唯美生）是全球首个实体瘤放射免疫治疗剂，2007年1月在我国正式上市，成为继Zevalin和Bexxar之后第三个全球放射免疫治疗剂，唯美生是可作为肺癌、肝癌及脑瘤等实体瘤的放射免疫治疗剂，临床试验表明晚期肺癌的病人接受了唯美生的注射，总有效率为33%，但唯美生还存在着明显的缺陷，因唯美生为人鼠嵌合单抗，含有一定鼠源成分，存在过敏的潜在危险，同时还存在着大分子抗体易被网状内皮系统识别吞噬而易引起非特异性聚集，以及因分子量大，穿透力差，在肿瘤内部扩散受到限制等难以解决的问题，均影响了其疗效。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的一个目的是提供一种小分子肺癌靶向放射治疗剂，其由治疗性放射同位素标记小分子肽所得。

本发明的另一个目的是提供上述小分子肺癌靶向放射治疗剂的制备方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种小分子肺癌靶向放射治疗剂，由治疗性放射同位素标记小分子肽后所得，所述小分子肽为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种。

所述小分子肽的氨基酸序列为cNGEGQQc（SEQ ID NO:1），其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。

所述治疗性放射同位素为¹³¹I、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y中的任一种。

一种小分子肺癌靶向放射治疗剂的制备方法，包括如下步骤：

1）将小分子肽的N端连接上酪氨酸；

2）将N-端连接有酪氨酸的小分子肽溶解后，加入治疗性放射同位素，然后再加入氯胺-T，震荡反应2min，用偏重亚硫酸钠溶液终止反应；

所述小分子肽为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种；

所述治疗性放射同位素为¹³¹I。

所述小分子肽的氨基酸序列为cNGEGQQc（SEQ ID NO:1），其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。

步骤1）的具体操作为：混合小分子肽和酪氨酸，加入氨基酸缩合剂EDC-HCI[1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二胺基盐酸盐]，室温下反应2小时后，将小分子肽的氨基（N）端与酪氨酸的羧基进行缩合连接。

步骤2）的具体操作为：用0.5M PBS ( pH=7.4)稀释N-端连接有酪氨酸的小分子肽，待小分子肽完全溶解后加入¹³¹I 37MBq/20μl，然后加入终浓度为0.9μg/μl的氯胺-T，震荡反应2min，用45μl (4μg/μl) 偏重亚硫酸钠溶液终止反应。

本发明的有益效果在于：

本发明利用治疗性核素标记小分子肽制备得到小分子肺癌靶向放射性治疗剂，其具有良好的稳定性和生物分布特性，能明显抑制人肺癌裸鼠动物模型体内肿瘤的生长，对肝脏、肾脏、肺脏及心脏等重要器官无明显毒副作用，适用于非小细胞肺癌（鳞癌和腺癌）患者的靶向治疗，在肺癌的分子靶向治疗方面具有重大的临床应用价值。

附图说明

图1 是小分子肽cNGEGQQc-Tyr的质谱分析图。

图2 是纸层析法测定¹³¹I标记小分子肽cNGEGQQc的放化纯度图。

图3 是¹³¹I标记酪氨酸cNGEGQQc的HPLC分析图。

图4 是根据获得的¹³¹I-cNGEGQQc在兔体内的SPECT动态显像图利用ROI感兴趣区分析技术获取各脏器的时间-放射性曲线图（1为兔动态显像图各脏器ROI感兴趣区勾画；2为心脏的时间-放射性曲线图；3为脾脏的时间-放射性曲线图；4为肝脏的时间-放射性曲线图；5为、肾脏的时间-放射性曲线图；6为膀胱的时间-放射性曲线图）。

图5是 ¹³¹I-cNGEGQQc在兔体内的SPECT动态显像图（1、2分别为注射¹³¹I-cNGEGQQc后30min兔前位、后位全身显像图；3、4分别为注射¹³¹I-cNGEGQQc后1h兔前位、后位全身显像图；5、6分别为注射¹³¹I-cNGEGQQc后3.5h兔前位、后位全身显像图）。

图6是 H1975肺癌裸鼠模型肿瘤生长曲线图。

图7 是L78肺癌裸鼠模型肿瘤生长曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

1 利用固相合成方法制备小分子肽cNGEGQQc（SEQ ID NO:1）

具体方法如下：

（1）称取1g表面具有NH₂活性基团的树脂珠子，用二甲基酰胺洗涤3次，然后在二甲基酰胺浸泡至珠子充分肿胀；

（2）加入D型半胱氨酸和N,N'-二异丙基碳二亚胺，室温下反应2小时后，用DMF洗涤珠子5次，接着加入20%（v/v）的哌啶，在室温下反应5 min，再加入20%（v/v）的DMF，反应15 min，完全脱去Fmoc保护基；

（3）按步骤（2）方法依次偶联D型天冬氨酸-L型甘氨酸-L型异亮氨酸-L型甘氨酸-L型脯氨酸-L型谷氨酰胺-D型半胱氨酸；

（4）将连接完最后一个氨基酸的珠子经25%（v/v）的三氟乙酸洗涤一次，蒸馏水洗涤3次；

（5）用无水氟化氢将小分子肽从树脂珠子上切下，同时脱除所有侧链保护基。还原产物在30%（v/v）乙酸高度稀释下用碘作氧化剂，使分子内2个半胱氨酸氧化形成二硫键。经Sephadex-G-15柱层析，透析和高效液相层析分离纯化，获得在反相高效液相层析（分析柱）为单一峰的高纯度产物。

2 本发明小分子肺癌靶向放射治疗剂（¹³¹I-cNGEGQQc）的制备

按照上述小分子肽的合成原理，混合小分子肽cNGEGQQc、酪氨酸和氨基酸缩合剂EDC-HCI[（1-乙基-3-二甲基氨基丙基）碳化二胺基盐酸盐]（1：3：3.6 摩尔比），室温下反应2小时后，将小分子肽的氨基（N）端与酪氨酸的羧基进行缩合连接，制备小分子肽cNGEGQQc-Tyr复合物（见附图1）。

采用氯胺-T标记法实现¹³¹I标记小分子肽cNGEGQQc，具体方法如下：

取N-端连接有酪氨酸的上述小分子肽50μg，用0.5M PBS ( pH=7.4) 50μl稀释；待小分子肽完全溶解后加入¹³¹I 37MBq/20μl，然后加入氯胺-T 30μl (3μg/μl)，使得氯胺-T终浓度为0.9μg/μl，震荡反应2min，用45μl (4μg/μl) 偏重亚硫酸钠溶液终止反应，再加入0.5M PBS（pH=7.4）溶液200μl混匀，取标记后的反应液，在层析纸上点样，在展开液为正丁醇：乙醇：氨水（5:1:2）混合液中进行纸层析，然后利用放射性薄层扫描仪测量，计算出标记率。将反应混合液通过Sephadex G25层析柱进行分离纯化，取纯化后的标记小分子肽溶液进行纸层析法测定放化纯度（见附图2）。

Sephadex G25层析柱制备方法及标记小分子肽的纯化方法：称取1g Sephadex（葡聚糖凝胶）G25在PBS（pH7.4）中浸泡24h，轻轻摇动除去细小颗粒，待其充分膨胀后，抽气减压，然后将凝胶加入玻璃层析管中；先用PBS（pH7.4）平衡层析柱，然后用BSA（20mg溶于1ml的PBS）过柱饱和，再经PBS（pH7.4）洗涤后，将上述标记反应液过柱，收集A280nm吸收峰的洗脱液；加入适量BSA和NaN₃，分装冻存备用。

3 本发明小分子肺癌靶向放射治疗剂的标记质量控制和体外稳定性鉴定

采用纸层析法测定标记率，具体方法：将标记后的混合物在层析纸一端点样，分别放入展开剂正丁醇：乙醇：氨水（5:1:2）混合液中，待样品迁移至层析纸的另一端时，将层析纸取出晾干，并把层析纸按10等份剪下并放入试管中，用γ免疫计数器测定各试管的放射性，并据此计算标记率（纯化前标记物峰的放射性计数占各峰总放射性计数的百分比) 和放化纯度（纯化后标记物峰的放射性计数占各峰总放射性计数的百分比），¹³¹I-cNGEGQQc的迁移率（Rf）=0-0.1，游离¹³¹I的Rf=0.4-0.6和0.9-1.0。¹³¹I标记cNGEGQQc的最佳条件为：最佳的cNGEGQQc/氯胺-T质量比为1:1.8，在20℃、pH值7.4和反应时间2min，在最佳条件下经纸层析法测定标记率均大于90%。¹³¹I标记cNGEGQQc的HPLC分析结果见附图3。

为评价小分子放射治疗剂的体外稳定性，采用纸层析法测定其在室温下和人血清中放置0-24h的放射化学纯度变化，经HPLC纯化后的¹³¹I-cNGEGQQc在室温下放置24h后的放射化纯度均大于90%，表明标记物在室温条件下稳定性良好；为进一步评价小分子放射治疗剂在模拟体内环境中的稳定性，将小分子放射治疗剂放置人新鲜血清中，37℃下温育24h，其放射化学纯度由0h的92.5%，逐步下降至24h的88.2%，表明标记小分子放射治疗剂在血清中稳定性良好。

4 本发明小分子肺癌靶向放射治疗剂的体内生物学分布分析

（1） 取健康雄性昆明小鼠15只，4-6周龄，体重19-21g，尾静脉注射0.48MBq（50μl）¹³¹I-cNGEGQQc，分别于注射后1、3、6、12、24h分别各处死3只小鼠，取血液及主要脏器，称重并测定放射性计数，经放射性衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率（%ID/g）。采用GE公司的Millennium VG SPECT，探头配备低能高分辨准直器，能峰中心为364 KeV，窗宽20%，矩阵128×128，放大倍数为1。

SPECT显像结果详见表1：在健康小鼠各个组织器官中，肾脏的放射性明显高于其它脏器，且清除时间长，表明本发明小分子放射治疗剂主要经肾脏代谢；其次是胃，随着时间的延长，各个脏器的的放射性逐渐下降，胃肠的放射性变化比较平稳，说明小分子放射治疗剂在体内稳定，没有明显的游离¹³¹I释出，肌肉组织和脑组织对小分子放射治疗剂的摄取最少。¹³¹I-cNGEGQQc在小鼠体内的放射性分布结果详见表1。

（2）取健康雄性日本大耳兔2只，分别仰卧位固定于木制实验台上，探头视野中心对准兔胸腹部，确保整个兔身均在探头视野范围内，经耳缘静脉注射生理盐水稀释的¹³¹I-cNGEGQQc 0.5 ml（14.8 MBq）/只，立即进行动态显像和多时相静态显像，观察兔体内组织器官放射性影像的动态分布变化。采集条件如下：首先1帧/10秒×6，其次1帧/1分钟×4，然后1帧/5分钟×5，最后于注药后30分钟、1小时和3.5小时分别进行全身前位和后位静态显像。同时对获得的兔后位系列动态采集图像进行感兴趣区（ROI）半定量分析，对心前区、肝脾、双肾及膀胱划感兴趣区，进行ROI分析，建立各自的时间-放射性曲线（见附图4-5）。

5本发明小分子肺癌靶向放射治疗剂对肺癌生长的抑制作用

人肿瘤裸鼠动物模型的建立。实验用细胞分别为：二种人非小细胞肺癌细胞包括NCI-H1975（腺癌）和L78（鳞癌），常规方法培养至对数生长期，胰蛋白酶消化，离心除去消化液，PBS洗涤2次，加入无血清培养液制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶/ml，分别于裸鼠背部皮下注射细胞悬液0.2ml，建立不同肺癌细胞的动物模型，每种肺癌细胞各12只裸鼠模型，定期观察肿瘤生长情况及裸鼠的一般情况如精神、饮食及体重等，待肿瘤直径达1cm左右时，开始抑瘤实验。

治疗前3天开始饮用水中加入终浓度为0.2%的碘化钾溶液，以封闭甲状腺，直至实验结束。每种肺癌的12只裸鼠模型随机分为3组，每组4只，于鼠尾静脉分别注射：（A）¹³¹I-cNGEGQQc；（B）¹³¹I-cNAQAEQc（阴性对照小分子肽）；（C）¹³¹I；（D）生理盐水；分别于给药后的第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天测量裸鼠体重和移植瘤的长径和宽径，计算移植瘤的体积（V＝4/3×π×R1×R1×R2；R1＜R2，R1为最短半径，R2为最长半径）。

根据各组肿瘤体积变化情况，绘制肿瘤生长曲线，结果显示给药7天后，¹³¹I-cNGEGQQc组H1975和L78移植瘤体积开始缩小，其它组移植瘤体积继续增大（见附图6-7）；继续观察各组裸鼠的生存期，中位生存期依次为（A）¹³¹I-cNGEGQQc组54天；（B）¹³¹I-cNAQAEQc组（阴性对照小分子肽）45天；（C）¹³¹I组42天；（D）生理盐水组43天。结果表明本发明小分子放射治疗剂有明显抑制体内肿瘤生长作用。

6本发明小分子肺癌靶向放射治疗剂对重要脏器毒性影响的评价

（1）放射治疗剂对人肺癌裸鼠动物模型的毒性分析

人肺癌裸鼠动物模型给予放射治疗剂3周后，处死裸鼠，分别留取血液、肝、肾、心、肺、脾等重要脏器，常规方法分析血细胞及肝、肾生化功能；常规病理切片检查肝、肾等组织，显微镜下观察各组织器官的细胞形态变化；常规电子显微镜切片下观察各组织器官细胞的超微形态结构变化。

血细胞分析结果显示¹³¹I-cNGEGQQc组红细胞、白细胞及血小板数量较生理盐水对照组无明显改变，¹³¹I-cNAQAEQc组和¹³¹I组白细胞数量较生理盐水对照组降低；生化分析结果显示小分子放射治疗剂组反应肝功能指标[丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）]，及反应肾功能指标[肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）]均未见明显异常（P<0.05）（见表2）。常规病理切片和超微电镜检查肝脏、肾脏、心脏、肺脏均未见明显改变。

（2）放射治疗剂对健康兔的毒性分析

6只健康家兔，饮食及活动状态佳，3只注射放射治疗剂，3只注射生理盐水，注射前15 min，测量各只兔体温在38.9~ 9.3 ℃之间；注射后24 h内，3次测量的体温分别如下：1 h在38.7~39.2 ℃之间，12 h在39.1~39.6 ℃之间，24 h在38.9~39.1 ℃之间。每只家兔24 h内的体温升高值在0.7 ℃以下，3次测量的体温升高总值在1.5 ℃以下。耳缘静脉抽取血液2ml，行血细胞及肝、肾生化功能分析，相对于对照组，除外小分子放射治疗剂组24小时血细胞中血小板数量减少，其余时间点血细胞、肝功能指标（ALT、AST）及反应肾功能指标（CRE、BUN）的分析结果均未见明显异常（见表3），呼吸、自主及中枢神经系统行为也无明显异常表现。表明小分子放射治疗剂对肺脏、肝脏、肾脏、心脏等器官无明显毒性作用。

本实施例采用目前临床广泛应用的治疗性放射性同位素¹³¹I标记肺癌细胞特异性小分子肽制备的肺癌靶向放射药物，近年来随着新型同位素的不断发现和应用，根据本发明建立的标记方法为基础，可以不断更换新型同位素如¹⁸⁸Re、⁹⁰Y，从而获得治疗效果更为理想的肺癌靶向放射治疗剂。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110>  南方医科大学珠江医院

<120>  一种小分子肺癌靶向放射治疗剂及其制备方法

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<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人工序列

<223>  Cys为D型半胱氨酸

<400>  1

Cys Asn Gly Glu Gly Gln Gln Cys

1               5