一种利用磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法

摘要

本发明公开了一种利用磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法。首先采用磁场对荞麦籽粒进行诱导处理，再将诱导处理后的荞麦籽粒萌发7天后即得含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽。本发明的一种利用磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法，在提高荞麦籽粒发芽率和发芽势的同时，可以显著提高荞麦萌发过程中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）的活性，进而显著提高荞麦芽中生物活性物质—槲皮素的含量。

说明书

技术领域

本发明的目的是为了提供一种利用磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法。

本发明的技术原理

通过利用磁场物理手段，在荞麦籽粒萌发过程中，激发苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）等内源性酶活性，从而提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量。

背景技术

荞麦是我国特有的药食两用的双子叶植物，荞麦中含有蛋白质、B族维生素、槲皮素等生物活性物质、矿物营养素及植物纤维素等。槲皮素等生物活性物质是一种很强的抗氧剂，可有效清除肌体内的氧自由基，可以帮助人体改善血液循环，提高免疫力，对预防糖尿病、高血脂、高血压具有重要作用。目前，提高槲皮素等生物活性物质含量的技术主要有对荞麦籽粒进行萌发处理的技术，并无在萌发前通过磁场诱导处理等技术相结合的综合技术，因而限制了槲皮素等生物活性物质的含量增加。

磁化处理是种子加工过程中为进一步提高种子发芽力而采用的一种物理手段。国内外已对水稻、小麦、大豆、玉米、油菜以及许多蔬菜作物的种子进行过磁化研究，均证实磁场有利于促进种子发芽，提高发芽势和发芽率，但对于槲皮素等生物活性物质的含量影响尚无相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种在提高荞麦籽粒发芽力和活力的同时，有效提高槲皮素等生物活性物质形成过程中重要的两种酶（苯丙氨酸解氨酶、查尔酮异构酶）的比活力，进而提高荞麦芽中槲皮素等生物活性物质含量的方法，以满足荞麦功能性食品加工的要求。

本发明的技术方案

一种利用磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法，即首先采用磁场对荞麦籽粒进行诱导处理，再将诱导处理后的荞麦籽粒萌发7天，即得到含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽；

上述的磁场的磁场强度优选为0.2T～0.6T，诱导处理时间优选为30min；

上述的荞麦籽粒萌发条件优选控制温度28℃、湿度85%。

上述的一种利用磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法，具体包括如下步骤： 

（1）、荞麦籽粒的预处理

采用清水淘洗荞麦籽粒以去除不饱满籽粒和病虫籽粒，再以35℃温水浸种24h，然后用清水冲洗2-3次后沥干水分；

（2）、将步骤（1）经预处理并沥干水分的荞麦籽粒置于强度为0.2T～0.6T的磁场中诱导处理30min，然后在温度28℃、湿度85% 条件下萌发7天，即得到含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽。

本发明的有益效果

本发明的一种利用磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法，在提高荞麦籽粒发芽率和发芽势的同时，可以显著提高荞麦萌发过程中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）的活性，进而显著提高荞麦芽中生物活性物质—槲皮素的含量，尤其是经磁场强度为0.4T处理过的荞麦芽较没有经磁场处理的荞麦芽相比，其生物活性物质—槲皮素含量提高了近23%。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行阐述，但并不限制本发明。

本发明实施例中荞麦芽萌发过程中的各种指标的测试方法如下：

方法1：发芽势和发芽率的测定（《国际种子发芽规程》(ISTA)）

                

式中：M₁— 发芽势天数内的正常发芽粒数；

      M₂— 全部正常发芽粒数；

      M — 供试种子粒数

方法2：PAL、CHI粗酶液的提取（张必弦，胡小梅，朱延明等. 野生大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在不同诱导条件下变化规律[J]. 大豆科学, 2011,30(4):703-705,709.）

 取样品1 g 液氮中研碎; 加 5 mL 的 0.1 mol/L的硼酸硼砂缓冲液( pH 8.8，内含 1 mmol/L的 EDTA、5 mmol/L的巯基乙醇，1% 的 PVP，1% 的甘油) ，研磨成匀浆; 12 000 r/min，4℃离心20 min; 取上清液(即为粗酶液) 立即使用或者－80℃保存备用。

方法3：PAL活性的测定 (Lister C E, Lancaster J E. Developmental changes in enzymes of flavonoid biosynthesis in the skins of red and green apple cultivars [J]. Science of  Food Agriculture, 1996, 71:313-320.)

按照酶粗提液0.5mL、L-苯丙氨酸（0.01mol·L^-1）1.5mL、硼酸硼砂缓冲液3mL混合，作为待测样品（总体积为5mL），用蒸馏水代替粗酶液与L-苯丙氨酸（0.01mol·L^-1）、硼酸硼砂缓冲液进行混合，作为空白对照；将混合好的溶液用紫外分光光度计测定OD₂₉₀值，并记录；将待测样品在30℃保温1h用0.2mL,20%的HCl终止反应；再次用紫外分光光度计（上海菁华仪器科技有限公司754型紫外可见分光光度计）测定反应后的OD₂₉₀值，并记录。按照每h每mL酶液在290nm处吸光值改变0.01为1个酶活单位，换算PAL的活性。

PAL活性=

方法4：CHI活性的测定：(Lister C E, Lancaster J E. Developmental changes in enzymes of flavonoid biosynthesis in the skins of red and green apple cultivars [J]. Science of Food Agriculture, 1996, 71:313-320.)

取0.75mL粗酶液加入2mL反应液（pH7.4，0.05M的Tris-HCL溶液，内含终浓度为7.5mg/mL牛血清白蛋白），然后加50μL，1mg/mL的羟基查尔酮溶液，在34℃恒温反应30min，另取同量的粗酶提取液加入2mL反应液，沸水浴10min作为对照，用紫外分光光度计（上海菁华仪器科技有限公司754型紫外可见分光光度计）测定OD₃₈₁处吸光值，按照每min每mL酶液在381nm处吸光值变化0.001为1个酶活单位，换算出CHI的活性。

CHI活性=

方法5：蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝（G-250）法（张必弦，胡小梅，朱延明等. 野生大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在不同诱导条件下变化规律[J]. 大豆科学, 2011,30(4):703-705,709.）

标准曲线的绘制：将配制好的考马斯亮蓝G-250（5mL）与各管中的标准蛋白液混匀，室温静置5min后用可见分光光度计（上海菁华仪器科技有限公司754型紫外可见分光光度计）测定各管OD₅₉₅，并记录。以吸光值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图，得到标准曲线（y=6.2071x+0.0388，R²=0.997）。粗酶液中蛋白含量测定：将0.2mL粗酶液，0.8mL蒸馏水和5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液充分混匀，室温静置5min后重复3次测定其OD₅₉₅值，取得平均值通过标准曲线查得蛋白质含量。

方法6：酶比活力的计算（张必弦，胡小梅，朱延明等. 野生大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在不同诱导条件下变化规律[J]. 大豆科学, 2011,30(4):703-705,709.）

酶的比活力=酶的活力/粗酶液中蛋白含量

方法7：槲皮素含量测定（高效液相色谱法）

仪器设备：安捷伦1100高效液相色谱仪

分析柱：反相Zorbax Eclipse SB-C18柱 (250×4.6 mm, 5μm).

流动相：采用乙腈和0.05%磷酸为洗脱剂，洗脱比例见表1：

表1 洗脱条件

时间（min）乙腈（％）0.05%磷酸（％）0.00109080.0118995.02575105.04060115.08020

检测波长：槲皮素选择370nm

柱  温 : 室温

流  速 : 1.0mL/min

进样量 : 15 μL

分析时间：120 min

实施例1

一种利用磁场强度为0.2T的磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法，包括如下步骤：

（1）、荞麦籽粒的预处理

采用清水淘洗荞麦籽粒以去除不饱满籽粒和病虫籽粒，再以35℃温水浸种24h，然后用清水冲洗2-3次后沥干水分；

（2）、将步骤（1）经预处理并沥干水分的荞麦籽粒置于磁场强度为0.2T磁场中诱导处理30min后，放入温度28℃、湿度85%的培养箱中进行萌发7天，即得含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽。 

采用方法1-7测定上述所得的含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽的发芽率和发芽势，以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）比活力、查尔酮异构酶（CHI）比活力和槲皮素含量。结果见表2。

表2 .0.2T磁场强度处理荞麦发芽测定结果

处理强度发芽率（%）发芽势（%）PAL比活力（U/mg）CIH比活力（U/mg）槲皮素（%）0T53%±0.01657%±0.012212.41±1.59379.81±1.2473.53±0.1040.2T65%±0.034**68%±0.029**217.27±2.011**86.20±1.841**3.82±0.086*

       显著性差异：*表示P<0.05，即差异显著；**表示P<0.01，即差异极显著。

从表2中可以看出，随着磁场强度的增加，发芽率、发芽势极显著增加的同时，苯丙氨酸解氨酶（PAL）和查尔酮异构酶（CHI）比活力的也随之增加，槲皮素含量也呈现显著增加。

实施例2

一种利用磁场强度为0.4T的磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法，包括如下步骤：

（1）、荞麦籽粒的预处理

采用清水淘洗荞麦籽粒以去除不饱满籽粒和病虫籽粒，再以35℃温水浸种24h，然后用清水冲洗2-3次后沥干水分；

（2）、将步骤（1）经预处理并沥干水分的荞麦籽粒置于强度为0.4T磁场中诱导处理30min后，放入温度28℃、湿度85%的培养箱进行萌发7天，即得含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽。 

采用方法1-7测定上述所得的含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽的发芽率和发芽势，以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）比活力、查尔酮异构酶（CHI）比活力和槲皮素含量。结果见表3。

表3 .0.4T磁场强度处理荞麦发芽测定结果

处理强度发芽率（%）发芽势（%）PAL比活力（U/mg）CIH比活力（U/mg）槲皮素（%）0T53%±0.01657%±0.012212.41±1.59379.81±1.2473.53±0.1040.4T70%±0.009**73%±0.008**223.58±1.894**88.74±0.769**4.34±0.165**

        显著性差异：*表示P<0.05，即差异显著；**表示P<0.01，即差异极显著。

从表3中可以看出，随着磁场强度的增加，发芽率、发芽势极显著增加的同时，苯丙氨酸解氨酶（PAL）和查尔酮异构酶（CHI）比活力也极显著增加，槲皮素含量也呈现极显著增加

实施例3

一种利用磁场强度为0.2T的磁场诱导处理提高荞麦芽生物活性物质—槲皮素含量的方法，包括如下步骤：

（1）、荞麦籽粒的预处理

采用清水淘洗荞麦籽粒以去除不饱满籽粒和病虫籽粒，再以35℃温水浸种24h，然后用清水冲洗2-3次后沥干水分；

（2）、将步骤（1）经预处理并沥干水分的荞麦籽粒置于磁场强度为0.6T磁场中诱导处理30min后，放入温度28℃、湿度85%的培养箱进行萌发7天，即得含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽。 

采用方法1-7测定上述所得的含有较高生物活性物质—槲皮素含量的荞麦芽的发芽率和发芽势，以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）比活力、查尔酮异构酶（CHI）比活力和槲皮素含量。结果见表4。

表4 .0.6T磁场强度处理荞麦发芽测定结果

处理强度发芽率（%）发芽势（%）PAL比活力（U/mg）CIH比活力（U/mg）槲皮素（%）0T53%±0.01657%±0.012212.41±1.59379.81±1.2473.53±0.1040.6T69%±0.029**73%±0.024**220.58±2.018**82.97±1.09*4.11±0.073**

        显著性差异：*表示P<0.05，即差异显著；**表示P<0.01，即差异极显著。

从表4中可以看出，随着磁场强度的增加，发芽率、发芽势极显著增加的同时，苯丙氨酸解氨酶（PAL）和查尔酮异构酶（CHI）比活力的也显著增加，槲皮素含量也呈现显著增加。

    综上所述，可以看出，本发明随着磁场诱导处理时磁场强度的增加，在提高荞麦籽粒发芽力和发芽势的同时，可以有效提高槲皮素形成过程中重要的两种酶（苯丙氨酸解氨酶、查尔酮异构酶）的比活力，进而提高荞麦芽中生物活性物质—槲皮素含量，尤其是经磁场强度为0.4T处理过的荞麦芽较没有经磁场处理的荞麦芽相比，其生物活性物质—槲皮素含量提高了近23%。

上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。