基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法

摘要

一种基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法：分别获取目的菌湿实验数据和高质量基因组尺度代谢网络模型；根据湿实验数据进行模拟条件设定；模拟实验菌的生长状态获得代谢通量分布，模拟优化工程菌的生长状态获得代谢通量分布；将两种代谢通量分布进行比较，确定两者之间的反应通量分布的不同；根据比较结果以及基因组尺度代谢网络模型中的基因-反应对应关系，得到相应的基因预测结果，从而确定将实验菌改造成优化工程菌所需进行的代谢工程改造，进而制定相应的湿实验策略。本发明可应用于任何具有基因组尺度代谢网络的物种，以及模拟预测网络模型计算能力范围内的任何产品，特别对于基因序列尚不明确的代谢工程菌具有很好的指导意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种代谢工程设计的计算机预测。特别是涉及一种可应用于任何具有基因组 尺度代谢网络物种的基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法。

背景技术

目前利用基因组尺度代谢网络模型进行的计算机预测多为必需基因预测或不同底物利用 情况的预测，所用的方法为通量平衡分析，通过计算机预测能够得到目标产物的最优合成途 径，但是无法判定野生菌或实验室使用的工程菌经过怎样的改造才能够实现最优合成途径。 同时，根据野生菌基因组建立的代谢网络模型无法模拟基因序列尚不清楚的工程菌的代谢状 况。另外，对于酿酒酵母，已经有预测通过添加外源基因提高目标产物产量的方法，但是目 前还没有对于菌体内已有基因进行代谢工程设计的计算机预测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够利用基因组尺度代谢网络模型，对生物实 验的设计进行计算机预测，从而有针对性的指导生物实验的基于基因组尺度代谢网络模型的 代谢工程设计预测方法。

本发明所采用的技术方案是：一种基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方 法，包括如下步骤：

1)分别获取目的菌湿实验数据和高质量基因组尺度代谢网络模型；

2)根据湿实验数据进行模拟条件设定；

3)模拟实验菌的生长状态，获得模拟实验菌的代谢通量分布，以及模拟优化工程菌的 生长状态，获得与实验菌同样培养条件下模拟优化工程菌的代谢通量分布；

4)将模拟实验菌的代谢通量分布与模拟优化工程菌的代谢通量分布进行比较，确定优 化工程菌与实验菌之间的反应通量分布的不同；

5)根据步骤4)的比较结果以及基因组尺度代谢网络模型中的基因-反应对应关系，得 到相应的基因预测结果，从而确定将实验菌改造成优化工程菌所需进行的代谢工程改造，进 而制定相应的湿实验策略。

步骤2)所述的模拟条件设定，是按照实验室使用的培养基组成，以及实验测定的溶氧 水平、菌体生长速率、目标产物以及副产物产量对模型中的参数进行设定。

步骤3)所述的实验菌是野生菌或工程菌。

步骤3)所述的模拟优化工程菌的生长状态，是在解除对目标产物以及副产物产量的设 定，其他条件保持与步骤1)相同的条件下进行模拟，从而获得与实验菌同样培养条件下优 化工程菌的代谢通量分布。

步骤4)所述的比较是：在模拟实验菌的代谢通量分布与模拟优化工程菌的代谢通量分 布有不同的反应中，当一个反应在优化工程菌中的代谢通量高于实验菌的代谢通量时，表明 该反应需要通过过表达进行优化；当该反应在优化工程菌中的代谢通量低于实验菌的代谢通 量时，表明该反应需要通过低表达进行优化；当该反应在优化工程菌中的代谢通量为0，而 在实验菌中的代谢通量不为0时，表明该反应需要通过敲除进行优化。

本发明的基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法，很好地解决了野生型 菌株基因组尺度代谢网络模型难以应用到工程菌实验指导方面的问题。本发明对于指导湿实 验设计，从而提高特定的具有商业价值的产物产量具有重要的作用。可应用于任何具有基因 组尺度代谢网络的物种，以及模拟预测网络模型计算能力范围内的任何产品，特别对于基因 序列尚不明确的代谢工程菌具有很好的指导意义。

附图说明

图1是本发明方法的流程图；

图2是核黄素产量提高需改造的预测反应在不同代谢系统中的分布

图中：a碳代谢，b氨基酸代谢，c辅因子代谢，d核酸代谢，e运输反应，f交换反应。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方 法做出详细说明。

本发明的基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法的实现，首先保证作为 基础的全基因组尺度代谢网络模型具有较高的质量。并且，本发明是利用COBRA工具包进行 编程计算。

如图1所示，本发明的基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法，包括如 下步骤：

1)分别获取目的菌湿实验数据和高质量基因组尺度代谢网络模型；

2)根据湿实验数据进行模拟条件设定，

所述的模拟条件设定，是按照实验室使用的培养基组成，以及实验测定的溶氧水平、菌 体生长速率、目标产物以及副产物产量对模型中的参数进行设定；

3)模拟实验菌的生长状态，所述的实验菌是指野生菌或工程菌，获得模拟实验菌的代 谢通量分布，以及模拟优化工程菌的生长状态，获得与实验菌同样培养条件下模拟优化工程 菌的代谢通量分布，所述的模拟优化工程菌的生长状态，具体是在解除对目标产物以及副产 物产量的设定，其他条件保持与步骤1)相同的条件下进行模拟，从而获得与实验菌同样培 养条件下优化工程菌的代谢通量分布；

4)将模拟实验菌的代谢通量分布与模拟优化工程菌的代谢通量分布进行比较，确定优 化工程菌与实验菌之间的反应通量分布的不同，

所述的比较是：在模拟实验菌的代谢通量分布与模拟优化工程菌的代谢通量分布有不同 的反应中，当一个反应在优化工程菌中的代谢通量高于实验菌的代谢通量时，表明该反应需 要通过过表达(overexpress)进行优化；当该反应在优化工程菌中的代谢通量低于实验菌的 代谢通量时，表明该反应需要通过低表达(underexpress)进行优化；当该反应在优化工程 菌中的代谢通量为0，而在实验菌中的代谢通量不为0时，表明该反应需要通过敲除 (knockout)进行优化；

5)根据步骤4)的比较结果以及基因组尺度代谢网络模型中的基因-反应对应关系，得 到相应的基因预测结果，从而确定将实验菌改造成优化工程菌所需进行的代谢工程改造，进 而制定相应的湿实验策略。

下面是将本发明的基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法用在野生型 枯草芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌工程菌在最小培养基上进行的核黄素生产上的实例。

所采用的模型是申请者自行构建的野生型枯草芽孢杆菌基因组尺度代谢网络模型，该模 型包含1145个基因和1735个反应，实验菌生长条件的数据来自史硕博等2009年在ME上发 表论文中Bacillus subtilis 168的实验数据，该菌种在最小培养基上进行培养，最小培养 基包含的元素组成及其在模型中通量的上下限如表1所示。

各通量交换反应上下的设定主要依据以下几点：

(1)K⁺，Na⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Fe³⁺，CO₂，H₂O和H⁺可以自由地进入和离开网络，因此它们反 应通量的上限为1000mmol g DW^-1h^-1，下限为-1000mmol g DW^-1h^-1；

(2)由于枯草芽孢杆菌为需氧菌，因此设氧气可以自由进入网络，却不可能离开网络(即 生成氧气)，因此设定氧气交换反应通量的下限为-1000mmol g DW^-1h^-1，上限为0；

(3)碳源、氮源、硫源、磷源作为从培养基中获得的有限底物，其最大吸收速率根据实 验设定为5mmol g DW^-1h^-1，即其通量交换反应的下限为-5mmol g DW^-1h^-1，上限为1000mmol g DW^-1h^-1。其中，根据实验条件，菌体利用的碳源为α-D-葡萄糖。

表1最小培养及条件及通量设置

根据本发明的方法，计算机预测的结果表明在两次模拟中共有127个反应具有不同的通 量，即有127个反应需进行改造，其中有69个需高表达的反应，42个需低表达的反应，16 个需敲除的反应。这些反应在不同代谢系统中的分布如图2所示。需高表达的反应多分布在 碳水化合物和核酸代谢中，这与核黄素的两个前体(5-磷酸-核糖和GTP)分别分布在碳水化 合物和核酸代谢中有关。将这些反应对应到基因上，得到83个需高表达的基因，46个需低 表达的基因，10个需敲除的基因，另外有4个基因对应模拟结果相矛盾的反应(例如一个高 表达，一个低表达)，因而无法进行预测。

在上述模拟预测的结果中，2009年发表在代谢工程(Metabolic Engineering)期刊11 卷243-252页的文献“Transcriptome analysis guided metabolic engineering of Bacillus  subtilis for riboflavin production”证实了模型预测的prs基因的过表达能够提高核黄 素的产量。同年发表在生化工程杂志(Biochemical Engineering Journal)46卷28-33页 上的文章“Increased production of riboflavin by metabolic engineering of the purine  pathway in Bacillus subtilis”证实了模型预测的purFMNHD五个基因的过表达能够提高 核黄素的产量。1999年发表在工业微生物和生物技术杂志(ournal of Industrial  Microbiology and Biotechnology)22卷1-7页上的文章“GTP cyclohydrolase II and 3，4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase are ratelimiting enzymes in  riboflavin synthesis of an industrial Bacillus subtilis strain used for riboflavin  production”和2005年发表第二届全国化学工程和生物化学工程年会上的文章“Effect of  transcriptional modified riboflavin operon on riboflavin biosynthetic ability in  Bacillus subtilis”证实了模型预测的ribABGHT五个基因的过表达能够提高核黄素的产量。 上述经过证实的基因预测表明了该方法对于野生菌代谢工程设计预测的准确性。

为了验证该方法在代谢工程菌上的应用性，按照文献“Transcriptome analysis guided  metabolic engineering of Bacillus subtilis for riboflavin production”和文献 “Increased production of riboflavin by metabolic engineering of the purine pathway  in Bacillus subtilis”两篇文章的实验条件分别模拟预测了RH33和B.subtilis PK两株工 程菌的核黄素生产情况，结果表明在实验给定的最小培养基条件下，该方法对RH33和 B.subtilis PK的模拟结果进一步印证了生物湿实验中prs和purFMNHD的过表达对提高核黄 素产量的作用。RH33和B.subtilis PK都是经过多次进化实验和得到的菌型，它们的基因组 序列尚不清晰。上述经过证实的基因预测表明了本发明对于工程菌代谢工程设计预测的准确 性。这两个实验表明该方法对于序列不清楚的工程菌具有很好的应用性，这一点很好地解决 了野生型菌株基因组尺度代谢网络模型难以应用到工程菌实验指导方面的问题。

本发明的基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法，对于指导湿实验设 计，从而提高特定的具有商业价值的产物产量具有重要的作用。本发明可应用于任何具有基 因组尺度代谢网络的物种，以及模拟预测网络模型计算能力范围内的任何产品，特别对于基 因序列尚不明确的代谢工程菌具有很好的指导意义。