声明
第1章 文献综述
1.1 FK506生物合成研究进展
1.1.1 FK506的结构特征与理化性质
1.1.2 FK506生物合成机制
1.1.3 FK506的生理功能及市场应用
1.1.4 FK506微生物发酵生产现状
1.2 基因组尺度代谢网络模型
1.2.1 基因组尺度代谢网络模型发展现状
1.2.2 基因组尺度代谢网络模型的构建
1.2.3 基因组尺度代谢网络模型的静态模拟分析
1.2.4 基因组尺度代谢网络模型的动态模拟分析
1.2.5 基因组尺度代谢网络模型的应用
1.3 链霉菌属胞内代谢调控研究现状
1.4 本文的主要研究内容及技术路线
第2章 筑波链霉菌基因组尺度稳态代谢网络模型
2.1 材料与方法
2.1.1菌种与培养基
2.1.2 实验药品
2.1.3 实验仪器与设备
2.1.4 筑波链霉菌培养条件
2.1.5 菌体生物量和FK506含量检测
2.1.6 发酵液中总糖含量检测
2.1.7 发酵液中无机氮含量检测
2.2 稳态代谢网络模型的升级、补充与完善
2.2.1 代谢反应方向修正
2.2.2 同分异构体代谢物代谢反应简化
2.2.3 Gaps分析与填补
2.2.4 交换反应添加
2.3 稳态代谢网络模型的模拟与分析
2.4 本章小结
第3章 基因组尺度动态代谢网络模型的构建与靶点预测
3.1 基因组尺度动态代谢网络模型
3.1.1动态代谢网络模型框架
3.1.2 动态约束条件
3.1.3 常微分方程的构建(ODEs)
3.1.4 影响FK506产量靶点的动态预测
3.2 材料与方法
3.2.1菌种、培养基与菌株培养方法
3.2.2 实验药品与仪器
3.2.3 总糖、无机氮、生物量和FK506浓度检测
3.3 结果与讨论
3.3.1 GS-DFBA模型敏感性分析
3.3.2 GS-DFBA模型模拟准确性分析
3.3.3 不同培养条件下菌体代谢状况的动态模拟
3.3.4 实验验证下的动态模型对影响FK506产量靶点的预测结果
3.4 本章小结
第4章 动态代谢网络模型指导下菌株基因改造
4.1 实验材料
4.1.1菌种、质粒和引物
4.1.2 培养基
4.1.3 实验药品
4.1.4 主要溶液
4.1.5 实验仪器与设备
4.2 实验操作与方法
4.2.1筑波链霉菌的培养
4.2.2 大肠杆菌的培养
4.2.3 引物设计及基因测序
4.2.4 大肠杆菌感受态的制备
4.2.5 大肠杆菌感受态细胞转化
4.2.6 大肠杆菌质粒DNA的提取
4.2.7 筑波链霉菌基因组DNA的提取
4.2.8 DNA片段的回收纯化
4.2.9 重组质粒的构建
4.2.10 目标基因的过表达和敲除载体的构建
4.2.11 菌体生物量、FK506 及副产物FK520 的测定
4.2.12 酶活性分析
4.3 结果与讨论
4.3.1单基因过表达菌株的构建与分析
4.3.2 单基因敲除菌株HT-△gcdh的构建与分析
4.3.3 多基因联合操作对菌体生长和FK506合成的影响
4.4 本章小结
（1）单基因操作提高FK506 发酵产量
（2）多基因组合操作提升FK506 产量
第5章 化学触发剂处理下FK506代谢调控靶点分析
5.1 实验材料
5.1.1菌种与培养基
5.1.2 实验药品
5.1.3 试验仪器与设备
5.2 实验操作与方法
5.2.1筑波链霉菌培养条件
5.2.2 化学触发剂的外源添加
5.2.3 菌体生物量和FK506含量检测
5.2.4 胞内代谢物样品的制备
5.2.5 胞内代谢物GC-MS检测方法
5.2.6 胞内代谢物LC-MS/MS检测方法
5.2.7 代谢物数据处理及多元统计分析
5.2.8 WGCNA方法的构建
5.2.9 DMSO处理条件下胞内转录组学特性分析
5.3 结果与讨论
5.3.1不同化学触发剂处理对FK506产量的影响
5.3.2 不同化学触发剂组合对菌体生物量和FK506产量的影响
5.3.3 不同化学触发剂处理对胞内代谢曲线差异性影响
5.3.4 不同化学触发剂处理下胞内代谢响应模块分析
5.3.5 不同化学触发剂处理下Hubs代谢物分析
5.3.6 不同显著代谢模块中代谢物途径富集分析
5.3.7 DMSO处理下FK506合成潜在调控靶点分析
5.4 本章小结
（1）FK506 高效合成化学触发剂及其组合筛选
（2）不同化学触发剂处理下胞内代谢动态响应分析
（3）DMSO 处理对FK506 合成潜在调控靶点识别
第6章 结论与展望
6.1 本文主要结论
6.2 本文主要创新点
6.3 展望
参考文献
附录
发表论文和参加科研情况说明
致谢
