含有在脂质媒介物中的9-顺式-视黄酯的药物制剂

摘要

含有在脂质媒介物中的9-顺式-视黄酯的药物制剂被描述为用于治疗人类的视网膜变性的补偿疗法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2009年9月15日提交的美国专利 申请号61/242,741的权益，该申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及包含人工类视色素(retinoids)的药物制剂，具体 地，涉及适用于视觉生色团补偿疗法(chromophore replacement  therapy)的稳定制剂和剂量制剂(dosage formulation)。

背景技术

视知觉源自眼中视网膜光感受器将光能向电信号传递的生物转化， 即称作视觉传导的过程。视觉传导过程由视色素启动，所述视色素包括 生色团11-顺式-视黄醛，后者与脱辅蛋白G蛋白偶联的受体视蛋白结合， 以形成视紫红质(Palczewski K.G protein-coupled receptor rhodopsin. Annual review of biochemistry 2006；75：743-767)。所述生色团吸收光子， 这触发生色团光异构化成它的反式形式，并导致信号转导级联 (Palczewski K.同上；Ridge KD等人Visual rhodopsin sees the light： structure and mechanism of G protein signaling.J Biol Chem  2007；282：9297-9301)。异构化的生色团全-反式-视黄醛然后被还原成全- 反式-视黄醇，运输至视网膜色素上皮(RPE)并被卵磷脂：视黄醇酰基转 移酶(LRAT)转化成脂肪酸全-反式-视黄酯(retinyl ester)。最后，11- 顺式-视黄醛从脂肪酸全-反式-视黄酯再生，结束该类视色素(视觉)循 环(参见，例如，美国公开申请号2004/0242704、2006/028182、 2006/0221208)。

11-顺式-视黄醛的再生对于维持视力而言是关键性的(Travis GH， 等人.Diseases caused by defects in the visual cycle：retinoids as potential  therapeutic agents.Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007；47：469-512)。11- 顺式-视黄醛生产中的缺陷与许多遗传性退化性视网膜病变有关(Gu SM， 等人.Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset  severe retinal dystrophy.Nature genetics 1997；17：194-197)。2个实例是： 勒伯尔先天性黑矇(Leber congenital amaurosis)(LCA)，即一种造 成严重视力缺损的童年期发作的视网膜疾病；和色素性视网膜炎(RP)， 即另一种具有更易变的发作年龄的视网膜病变。

LCA是一种遗传性的、严重的、目前不可治愈的视网膜变性，它是 童年期失明的主要原因。在出生时或之后不久，LCA患者特征性地表现 出严重视力缺损，这通过下述现象来证实：徘徊性眼球震颤、黑蒙性瞳 孔、具有视锥和视杆敏感性损失的色素性视网膜病变、缺少或极大衰减 的视网膜电流图(ERG)应答以及视锥颤动振幅的约100倍降低(Perrault  I，等人Leber congenital amaurosis.Mol Genet Metab 1999；68：200-208； Fazzi E，等人Leber’s congenital amaurosis：an update.Eur J Paediatr  Neurol 2003；7：13-22；Fazzi E，等人Response to pain in a group of  healthy term newborns：behavioral and physiological aspects.Functional  neurology 1996；11：35-43)。

RPE65(对RPE特异性的且在RPE中富含的一种65kDa蛋白，其 催化脂肪酸全-反式-视黄酯异构成11-顺式-视黄醇)通常被视作参与11- 顺式-视黄醛的再生的类视色素异构酶(Hamel CP，等人Molecular  cloning and expression of RPE65，a novel retinal pigment  epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally  regulated in vitro.J Biol Chem 1993；268：15751-15757；Jin M，等人 Rpe65 is the retinoid isomerase in bovine retinal pigment epithelium.Cell  2005；122：449-459；Moiseyev G，等人RPE65 is the isomerohydrolase in  the retinoid visual cycle.Proceedings of the National Academy of Sciences  of the United States of America 2005；102：12413-12418；Redmond TM，等 人Mutation of key residues of RPE65 abolishes its enzymatic role as  isomerohydrolase in the visual cycle.Proceedings of the National  Academy of Sciences of the United States of America  2005；102：13658-13663)。RPE65基因中的突变占LCA病例中的高达 16％，并占常染色体隐性的RP病例的2％(Gu SM，同上；Marlhens F， 等人Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis.Nature  genetics 1997；17：139-141；Morimura H，等人Mutations in the RPE65  gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber  congenital amaurosis Proceedings of the National Academy of Sciences of  the United States of America 1998；95：3088-3093；Thompson DA，等人 Genetics and phenotypes of RPE65 mutations in inherited retinal  degeneration.Investigative ophthalmology & visual science 2000；41：4293-4299；Lorenz B，等人Early-onset severe rod-cone  dystrophy in young children with RPE65 mutations.Investigative  ophthalmology & visual science 2000；41：2735-2742)。Rpe65在小鼠和狗 中的自发的或设计的缺失，会导致11-顺式-视黄醛缺乏，即一种早期发 作的且缓慢渐进的视网膜变性，其具有急剧降低的视网膜电流图(ERG) 应答和典型的LCA病理学，并伴有脂肪酸全-反式-视黄酯在RPE中的 积累(Redmond TM，等人Rpe65 is necessary for production of  11-cisvitamin A in the retinal visual cycle.Nature genetics  1998；20：344-351；Pang JJ，等人Retinal degeneration 12(rd12)：a new， spontaneously arising mouse model for human Leber congenital  amaurosis(LCA).Molecular vision 2005；11：152-162；Wrigstad A，等人 Ultrastructural changes of the retina and the retinal pigment epithelium  in Briard dogs with hereditary congenital night blindness and partial day  blindness.Experimental eye research 1992；55：805-818；Acland GM，等人 Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness. Nature genetics 2001；28：92-95；Imanishi Y，等人Noninvasive two-photon  imaging reveals retinyl ester storage structures in the eye.The Journal of  cell biology 2004；164：373-383)。

几种可能用于治疗LCA的疗法正在研究中。RPE65基因增强疗法 和视网膜假体已经在早期临床评价中表现出初步的鼓舞人心的视力挽救 征象(Bainbridge JW，等人Effect of gene therapy on visual function in  Leber’s congenital amaurosis.The New England journal of medicine  2008；358：2231-2239；Maguire AM，等人Safety and efficacy of gene  transfer for Leber’s congenital amaurosis.The New England journal of  medicine 2008；358：2240-2248；Yanai D，等人Visual performance using a  retinal prosthesis in three subjects with retinitis pigmentosa.American  journal of ophthalmology 2007；143：820-827)。

最近，已经提出使用9-顺式-视黄醛的视觉生色团补偿疗法，作为绕 过有缺陷的类视色素循环的新颖的药理学方案(Van Hooser JP，等人 Rapid restoration of visual pigment and function with oral retinoid in a  mouse model of childhood blindness.Proceedings of the National  Academy of Sciences of the United States of America 2000；97：8623-8628； Van Hooser JP，等人Recovery of visual functions in a mouse model of  Leber congenital amaurosis.J Biol Chem 2002；277：19173-19182；Aleman  TS，等人Impairment of the transient pupillary light reflex in Rpe65(-/-) mice and humans with leber congenital amaurosis.Investigative  ophthalmology & visual science 2004；45：1259-1271；Batten ML，等人 Pharmacological and rAAV Gene Therapy Rescue of Visual Functions in  a Blind Mouse Model of Leber Congenital Amaurosis.PLoS Med  2005；2：e333)。9-顺式-视黄醛会结合视蛋白，以形成视杆细胞色素，异 视紫红质，后者与视紫红质类似地启动视觉传导。已经证实，9-顺式-视 黄醛或它的前体的口服给药会在眼中再生视蛋白作为异视紫红质，改善 视网膜功能(通过ERG应答来评估)，并改善Rpe65和Lrat敲除的小 鼠(它们是LCA的2种遗传模型)的瞳孔光反射。需要进一步开发合成 的9-顺式-类视色素，其在口服地、胃地、局部地(诸如玻璃体内地)或 静脉内地施用的制剂中，所述制剂用于治疗由类视色素循环中的缺陷造 成的不同形式的遗传性视网膜变性。

发明内容

描述了药物制剂，其包含在脂质媒介物中的人工类视色素。所述人 工类视色素可以用于绕过类视色素循环中的关键阻断，诸如RPE65缺乏 或突变，从而产生可以在功能上与视蛋白相结合的人工顺式-类视色素生 色团。也描述了所述药物制剂的剂量制剂，包括单独的、间断的和每天 的给药方案。

因而，一个实施方案提供了一种药物制剂，其包含脂质媒介物和一 种或多种式(I)的9-顺式-视黄酯：

其中R是烷基或烯基；且所述脂质媒介物包含超过50w/w％的多不 饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸包括ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸，它们 之比(按重量计算)小于15。

在一个具体实施方案中，所述式(I)的9-顺式-视黄酯是乙酸9-顺式- 视黄酯(9-cis-retinyl acetate)。

在一个具体实施方案中，所述脂质媒介物包含大豆油。

另一个实施方案提供了一种剂量制剂，其适用于给有此需要的受试 者每天施用9-顺式-视黄酯，所述剂量制剂包含在大豆油中的约1.25-20 mg/mL的乙酸9-顺式-视黄酯，其中所述剂量制剂在24小时时段内会提 供约1.25-40mg的乙酸9-视黄酯/m²受试者体表面积。

另一个实施方案提供了一种剂量制剂，其适用于给受试者单次在玻 璃体内施用乙酸9-顺式-视黄酯，所述剂量制剂包含在大豆油中的约 18-40％mg/mL的乙酸9-顺式-视黄酯。

另一个实施方案提供了一种治疗人受试者的勒伯尔先天性黑矇的方 法，所述方法包括：施用药物制剂，所述药物制剂具有在脂质媒介物中 的有效量的一种或多种式(I)的9-顺式-视黄酯，所述脂质媒介物包含超过 50w/w％的多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸包括ω-6脂肪酸和ω-3 脂肪酸，它们之比(按重量计算)小于15。

在一个具体实施方案中，在所述方法中采用的式(I)的9-顺式-视黄酯 是乙酸9-顺式-视黄酯。

在一个具体实施方案中，在所述方法中采用的脂质媒介物包含大豆 油。

另一个实施方案提供了一种方法，所述方法包括：给缺乏11-顺式- 视黄醛的人受试者施用药物制剂，所述药物制剂具有在脂质媒介物中的 有效量的一种或多种式(I)的9-顺式-视黄酯，所述脂质媒介物包含超过50 w/w％的多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸包括ω-6脂肪酸和ω-3 脂肪酸，它们之比(按重量计算)小于15。

在一个具体实施方案中，在所述方法中采用的式(I)的9-顺式-视黄酯 是乙酸9-顺式-视黄酯。

在一个具体实施方案中，在所述方法中采用的脂质媒介物包含大豆 油。

附图说明

图1(A-D)显示了在大豆油中的乙酸9-顺式-视黄酯的相对吸收， 和它的活性代谢物(包括脂肪酸9-顺式-视黄酯和9-顺式-视黄醇)的血 浆保留。

图2(A-C)显示了在用单次剂量的在大豆油中的乙酸9-顺式-视黄 酯治疗的小鼠中，a-波和b-波振幅的剂量依赖性的增加。

图3显示了在14天时段内的给药方案，其中，记录单次快速ERGs， 并测量眼中的类视色素水平。

图4(A-D)显示了与基线5周龄Rpe65^-/-小鼠相比，在治疗的小鼠 中，a-波和b-波振幅的剂量依赖性的增加的ERGs。

图5显示了给药方案，和在大豆油中的乙酸9-顺式-视黄酯的3个日 剂量以后，ERGs的评价和类视色素分析。

图6(A-F)显示了在大豆油中的乙酸9-顺式-视黄酯的3个日剂量 以后直到第9天，记录的ERG应答的剂量依赖性的a-和b-波振幅。

图7显示了在8周时段内的间断给药方案和每天给药方案。

图8(A-D)显示了在间断给药方案和每天给药方案中，在第28和 56天，a-波和b-波的振幅的剂量依赖性的增加。

图9(A-I)表明，在长期施用乙酸9-顺式-视黄酯以后，通过光感受 器外段(outer segment)的长度评估的、对视网膜的剂量依赖性的保护 作用。

图10显示了在乙酸9-顺式-视黄酯施用以后，通过HPLC测得的类 视色素的血浆水平。

图11(A-D)显示了在每天用乙酸9-顺式-视黄酯治疗的14天以后， 眼和肝中的类视色素。

图12显示了在3个日剂量的乙酸9-顺式-视黄酯以后，9-顺式-视黄 醛从眼消失的动力学。

图13(A-B)显示了在间断和每天用9-顺式-R-Ac治疗共8周以后， Rpe65^-/-小鼠的眼中的类视色素含量。

图14(A-C)显示了在间断和每天用乙酸9-顺式-视黄酯治疗56天 以后，Rpe65^-/-小鼠的肝脏中的类视色素分析。

发明详述

描述了适用于类视色素补偿疗法的9-顺式-视黄酯的药物制剂。更具 体地，所述药物制剂包含一种或多种9-顺式-视黄酯和脂质媒介物。

本文使用的“类视色素”表示与与维生素A有关的一类天然的或人工 的化学化合物。在结构上，类视色素具有共同的核心结构，该结构由环 状末端基团、缀合的多烯侧链和极性末端基团组成。天然存在的类视色 素包括，例如，维生素A(11-反式-视黄醇)、11-反式-视黄醛和11-反 式-视黄酸。适用于类视色素补偿疗法的人工的或合成的类视色素包括， 例如，9-顺式-视黄酯(如本文所定义)、9-顺式-视黄醛和9-顺式-视黄醇。

如本文所讨论的，9-顺式-视黄酯可以充当9-顺式-视黄醛的前药形式 的前体或前药，所述9-顺式-视黄醛能够在功能上与视蛋白结合，从而完 成类视色素循环，尽管存在例如RPE65缺乏或突变。

因而，一个实施方案描述了一种药物制剂，其包含：一种或多种9- 顺式-视黄酯和脂质媒介物，所述一种或多种9-顺式-视黄酯悬浮于脂质媒 介物中。

9-顺式-视黄酯

9-顺式-视黄酯表示下述的式(I)一般结构：

其中R是烷基或烯基。

“烷基”表示仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃基，其不含有不饱 和键，具有最多22个碳原子。在某些实施方案中，烷基可以包含12-17 个碳原子(也称作“C_12-17烷基”)。在某些实施方案中，烷基可以包含12-15 个碳原子(也称作“C_12-15烷基”)。在某些实施方案中，烷基可以包含1-8 个碳原子(也称作“C_1-8烷基”)。在其它实施方案中，烷基可以包含1-6 个碳原子(也称作“C_1-6烷基”)。在其它实施方案中，烷基可以包含1-4 个碳原子(也称作“C_1-4烷基”)。所述烷基通过单键与分子的剩余部分相 连，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正 戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非在 说明书中另外特别阐明，烷基可以任选地被一个或多个下述的取代基取 代：卤素(包括-F、-Br、-Cl和-I)、氰基(-CN)、硝基(-NO₂)、氧 代(＝O)和羟基(-OH)。

“烯基”表示仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃基，其含有至少一 个不饱和键(即，C＝C)，具有2至最多20个碳原子。在不同的实施方 案中，R是C_12-17烯基、C_1-8烯基、C_1-6烯基或C_1-4烯基。除非在说明书 中另外特别阐明，烷基可以任选地被一个或多个下述的取代基取代：卤 素(包括-F、-Br、-Cl和-I)、氰基(-CN)、硝基(-NO₂)、氧代(＝O) 和羟基(-OH)。

在某些实施方案中，所述9-顺式-视黄酯是人工类视色素，其充当9- 顺式-视黄醛的前药形式的前体(即，药物前体)。更具体地，所述9-顺 式-视黄酯可以被肝脏转化成代谢的前药形式，即脂肪酸9-顺式-视黄酯， 它们被储存在肝脏的肝脂滴中。脂肪酸9-顺式-视黄酯和视黄醇从肝脏移 动，并进入循环中，它们在循环中移动至眼和RPE。在那里，它们被转 化成9-顺式-视黄醛，后者最终与光感受器视蛋白结合，以形成有活性的 视色素。

一种优选的9-顺式-视黄酯是乙酸9-顺式-视黄酯(即，R是甲基)。 也称作“9-顺式-R-Ac”，乙酸9-顺式-视黄酯是药用药物前体，它们被肝 脏代谢成脂肪酸9-顺式-视黄酯，诸如棕榈酸9-顺式-视黄酯。脂肪酸9- 顺式-视黄酯和视黄醇然后在眼和RPE中被转化成9-顺式-视黄醛，作为 缺乏的生色团(诸如11-顺式-视黄醛)的替代物。

9-顺式-R-Ac可以如下制备：最初，在有钯催化剂(例如，钯盐、氧 化钯)存在下，将乙酸全-反式-视黄酯(Sigma-Aldrich)转化成乙酸9- 顺式-视黄酯和乙酸全-反式-视黄酯的混合物。然后水解乙酸9-顺式-视黄 酯和乙酸全-反式-视黄酯的混合物，以生成9-顺式-视黄醇和全-反式-视黄 醇的混合物。通过选择性重结晶，可以分离出纯的9-顺式-视黄醇，并进 一步酯化成纯的9-顺式-R-Ac。用于制备和纯化9-顺式-R-Ac的方法的详 细描述，可以参见，例如，英国专利No.1452012。

在其它实施方案中，所述视黄酯是前药(而不是前药的前体)，且 可以直接地在眼和RPE中被转化成9-顺式-视黄醛。9-顺式-视黄酯的前 药形式通常是脂肪酸9-顺式-视黄酯，其中R是C_11-21烷基。本文使用的“脂 肪酸”表示这样的羧酸：其具有长脂族链，所述链可以是饱和的(烷基) 或不饱和的(烯基)。通常，所述脂族链含有至少11个碳，且可以长达 21个碳。示例性的脂肪酸包括、但不限于：月桂酸、棕榈酸、棕榈油酸、 油酸、亚油酸和亚麻酸。

因而，在一个实施方案中，R是C₁₅烷基，且所述式(I)的9-顺式-视 黄酯是棕榈酸9-顺式-视黄酯。

在另一个实施方案中，R是C₁₇烷基，且所述式(I)的9-顺式-视黄酯 是硬脂酸9-顺式-视黄酯。

在其它实施方案中，R是C₁₇烯基，且所述式(I)的9-顺式-视黄酯是 油酸9-顺式-视黄酯。

以与9-顺式-R-Ac的制备类似的方式，使用适当酯化剂，可以从9- 顺式-视黄醇制备本文所述的9-顺式-视黄酯，其方法在本领域技术人员的 知识范围内。

如本文所证实的，在临床上发现低剂量(1和4mg/kg)的示例性的 药物前体9-顺式-R-Ac可安全地且有效地维持Rpe65^-/--小鼠的视觉功能， 这通过ERG记录、眼中的类视色素水平、视网膜组织学和视觉依赖性的 行为研究来评估。该化合物可用于治疗，例如，由类视色素生色团产生 不足造成的视网膜病变患者。

脂质媒介物

通常，9-顺式-视黄酯是油状物，且是亲脂的。因而，所述的药物制 剂可以另外包含脂质媒介物。

因为9-顺式-视黄酯是光和氧敏感的，它们的稳定性对于制剂的效力 和贮存期限而言是关键性的。因此，基于它的稳定化悬浮或溶解在其中 的9-顺式-视黄酯的能力，选择合适的脂质媒介物。

本文使用的“脂质”或“脂质媒介物”表示一种脂肪酸酯或多种脂肪酸 酯的混合物。在不同的实施方案中，所述脂质媒介物包含一种或多种甘 油三酯，当单个甘油被3个脂肪酸酯化时，形成所述的甘油三酯。甘油 三酯包括植物油和动物脂肪。

在描述脂质媒介物的背景下，甘油三酯经常用它们的对应脂肪酸来 简单地表示。甘油三酯的脂肪酸可以是饱和的、单不饱和的和多不饱和 的，这取决于在脂族链中的碳-碳双键(C＝C)的数目。饱和脂肪酸在脂 族链中不含有碳-碳双键。饱和脂肪酸的实例包括，例如，棕榈酸和硬脂 酸。单不饱和脂肪酸在脂族链中含有单个碳-碳双键(C＝C)。单不饱和 脂肪酸的实例包括，例如，油酸和棕榈油酸。多不饱和脂肪酸在脂族链 中含有至少2个碳-碳双键。多不饱和脂肪酸的实例包括，例如，亚油酸 (2个C＝C)和亚麻酸(3个C＝C)。此外，多不饱和脂肪酸包括ω-3 脂肪酸和ω-6脂肪酸，这取决于最后一个C＝C键在脂族链中的位置。例 如，亚油酸是ω-6脂肪酸，而亚麻酸是ω-3脂肪酸。

通常，所述脂质媒介物是脂肪酸的混合物，每种脂肪酸的相对量可 以影响脂质媒介物的总体特征，特别是它的抗氧化能力和稳定化悬浮于 其中的9-顺式-视黄酯的能力。

在某些实施方案中，所述脂质媒介物包含超过50w/w％的多不饱和 脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸包括ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸，它们之比 (按重量计算)小于15。在具体实施方案中，所述脂质媒介物包含亚油 酸甘油三酯和亚麻酸甘油三酯，它们之比(按重量计算)小于15，它们 总计超过脂质媒介物总重量的50％。

在其它实施方案中，所述脂质媒介物可以是包含超过50w/w％的多 不饱和脂肪酸的植物油或油混合物，所述多不饱和脂肪酸包括ω-6脂肪 酸和ω-3脂肪酸，它们之比(按重量计算)小于15。

表1显示了许多植物油和以重量百分比表示的它们的脂肪酸组分(参 见，例如，美国公开申请号2007071872)。

表1

SAFA＝饱和脂肪酸

MUFA＝单不饱和脂肪酸(Monosaturated fatty acids)

PUFA＝多不饱和脂肪酸

ω6∶ω3＝ω-6与ω-3多不饱和脂肪酸之比

大豆油是合适的脂质媒介物，因为它包含约62％的多不饱和脂肪酸 (54％亚油酸和8％亚麻酸)、25％的单不饱和脂肪酸(油酸)和16％ 的饱和脂肪酸(11％棕榈酸和5％硬脂酸)。

大豆油是澄清的且没有气味的油，它可与本文所述的9-顺式-视黄酯 混溶。与含有更低浓度的多不饱和脂肪酸的脂肪酸(例如，芥花籽油 (Canola oil)和橄榄油，它们分别含有约30％和小于20％的多不饱和 脂肪酸)相比，大豆油意外地表现出优良的稳定作用，这通过在2周时 段以后在制剂中保留的更高的纯乙酸9-顺式-视黄酯含量来证实。

另外，与具有更高的ω-6与ω-3多不饱和脂肪酸之比的脂肪酸相比， 大豆油也表现出优良的稳定作用。例如，葵花子油尽管具有与大豆油相 当的多不饱和脂肪酸总量(61％)，但是具有比大豆油(约7)远远更高 的ω-6与ω-3多不饱和脂肪酸之比(超过600)。如表2(实施例1)所 示，葵花子油的稳定作用与芥花籽油的稳定作用相当，但是二者远远低 于大豆油(美国药典级)。

重要的是，在接近生理条件的温度(例如，40℃)，与其它媒介物 的制剂相比，所述大豆油制剂是最稳定的。满足美国药典专著的高度精 制的大豆油是优选的(例如，由Spectrum Chemicals提供)，因为已经 发现，美国药典级大豆油会提供比商品级大豆油更强的稳定作用(参见， 实施例1)。

此外，大豆油媒介物会提供9-顺式-视黄酯的代谢物的最高血浆水 平。图1显示了9-顺式-R-Ac的相对吸收，和它的活性代谢物(脂肪酸 9-顺式-视黄酯和9-顺式-视黄醇)的血浆保留。

因而证实，大豆油会赋予9-顺式-视黄酯的稳定性和它们的活性代谢 物的高血浆保留，从而为制剂提供协同益处。

在另一个实施方案中，所述脂质媒介物是核桃油，其包含72％的多 不饱和脂肪酸(62％亚油酸和12％亚麻酸)。

在另一个实施方案中，所述脂质媒介物是麦芽油，其包含62％的多 不饱和脂肪酸(55％亚油酸和7％亚麻酸)。

制剂：

一般而言，所述药物制剂可以包括与合适的脂质媒介物相组合的本 文所述的任一种9-顺式-视黄酯。

一个实施方案描述了一种药物制剂，所述药物制剂包含在脂质媒介 物中的一种或多种9-顺式-视黄酯，其中所述脂质媒介物包含超过50 w/w％的多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸包括ω-6脂肪酸和ω-3 脂肪酸，它们之比(按重量计算)小于15。

另一个实施方案描述了一种药物制剂，所述药物制剂包含在脂质媒 介物中的乙酸9-顺式-视黄酯，其中所述脂质媒介物包含超过50w/w％的 多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸包括ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸， 它们之比(按重量计算)小于15。

另一个实施方案描述了一种药物制剂，所述药物制剂包含在脂质媒 介物中的乙酸9-顺式-视黄酯，其中所述脂质媒介物包含亚油酸甘油三酯 和亚麻酸甘油三酯，它们之比(按重量计算)小于15，它们总计超过脂 质媒介物总重量的50％。

另一个实施方案描述了一种药物制剂，所述药物制剂包含在大豆油 中的乙酸9-顺式-视黄酯。

另一个实施方案描述了一种药物制剂，所述药物制剂包含在核桃油 中的乙酸9-顺式-视黄酯。

另一个实施方案描述了一种药物制剂，所述药物制剂包含在麦芽油 中的乙酸9-顺式-视黄酯。

在不同的实施方案中，所述药物制剂包含最高40％(按重量计算) 的9-顺式-视黄酯、最高30％(按重量计算)的9-顺式-视黄酯、最高25％ (按重量计算)的9-顺式-视黄酯、最高10％(按重量计算)的9-顺式- 视黄酯、最高5％(按重量计算)的9-顺式-视黄酯。

任选的组分：

本文所述的药物制剂可以任选地包含增强稳定性和适口性的额外组 分。例如，可以包括一种或多种稳定剂(例如，抗氧化剂)，以提供进 一步的稳定作用。此外，可以将矫味剂加入口服给药的制剂中，以改善 味道。

在本公开内容中采用的抗氧化剂可以是下述的一种或多种：α-生育 酚、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、抗坏血酸基棕榈酸酯和没 食子酸丙酯。可以采用叔丁基对苯二酚(TBHQ)、螯合剂诸如依地酸 二钠和依地酸钙钠。

矫味剂和增味剂会使患者感觉药物制剂更适口。可以包含在本发明 组合物中的、用于药物产品的常见矫味剂和增味剂包括：麦芽酚、香草 醛、乙基香草醛、薄荷醇、柠檬酸、富马酸、乙基麦芽酚和酒石酸。矫 味的油(例如，柠檬油)是优选的，因为它们可与脂质媒介物混溶。可 以加入甜味剂诸如山梨醇、糖精、糖精钠、蔗糖、阿斯巴甜、果糖、甘 露醇和转化糖，以改善味道。

可以将水、表面活性剂或乳化剂加入基于油的制剂中，以形成适合 口服给药(例如，以饮料的形式)或静脉内注射的混合物。合适的表面 活性剂和乳化剂包括，例如，大豆卵磷脂和二棕榈酰磷脂酰胆碱。饮料， 诸如豆奶，也可以直接地加入本文所述的制剂中。

因而，一个实施方案提供了一种饮料，其包含一种或多种9-顺式-视 黄酯和脂质媒介物，其中所述脂质媒介物包含超过50w/w％的多不饱和 脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸包括ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸，它们之比 (按重量计算)小于15。

另一个实施方案提供了一种可饮用的配方(drinkable formula)、 乳剂或饮料，其包含乙酸9-顺式-视黄酯、大豆油和可饮用的液体介质。 在某些实施方案中，所述可饮用的液体介质是水包油乳剂(例如，奶或 豆奶)的形式。也可以采用额外的乳化剂，诸如阿拉伯胶、黄蓍胶和甲 基纤维素。

另一个实施方案提供了一种胶囊形式的口服制剂，所述胶囊含有乙 酸9-顺式-视黄酯、大豆油。如本领域技术人员所认识到的，可以包括额 外的赋形剂诸如抗氧化剂。

给药和剂量制剂

通过口服的、胃的或局部的给药，诸如玻璃体内注射和静脉内注射， 可以将本文所述的药物制剂施用给受试者。

通过经口管饲法，或经由可饮用的配方或饮料(其包括一种或多种 9-顺式-视黄酯、脂质媒介物和饮料诸如豆奶)，可以实现口服给药。

通过胃管饲法(例如，胃管)，可以实现胃给药。

使用注射器进行局部给药，诸如玻璃体内的(通过眼)注射和静脉 内注射。

本文使用的“受试者”表示患者，其可以来自任意哺乳动物物种，例 如灵长类动物，特别是人类；啮齿类动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠；兔； 马科动物；牛科动物；犬科动物；猫科动物；等。动物模型，具体地， 遗传操作的动物，对于实验研究而言是有益处的，会提供用于治疗人疾 病(例如，LCA)的模型。

通常，所有剂量的9-顺式-R-Ac在脂质媒介物中是可完全混溶的， 所述脂质媒介物包括大豆油USP(Spectrum Chemicals)。在不同的实 施方案中，描述了单次的、间断的和每天的给药。此外，基于它们的药 理学活性代谢物在血浆中的吸收后水平，使用ERG、视敏度、全视野刺 激试验、视野分析、颜色视觉试验，可以评估9-顺式-视黄酯的剂量和对 应的效力。

如在实施例中所证实的，在Rpe65和Lrat敲除的小鼠(它们是LCA 的2种遗传模型)中，观察到视网膜功能的水平和持续时间的剂量依赖 性的改善。重要的是，在给药后足够长的时段内保持药理学活性，以实 现制剂的柔性的、间断的给药方案。

更具体地，单次剂量的9-顺式-R-Ac(6.25-50mg/kg)会导致ERG 应答的显著剂量依赖性的改善。持续2周的日剂量(1、4和12.5mg/kg) 被较好地耐受，并引起视网膜功能的显著改善。在持续3天每天施用1、 4和12.5mg/kg的9-顺式-R-Ac以后6天，观察到ERG应答的显著剂量 依赖性的改善。以1和4mg/kg/天，每天或间断地给小鼠施用9-顺式-R-Ac 治疗，并在2个月后评价，在8周以后表现出视网膜功能和形态学的剂 量依赖性的改善，而在相当的3月龄对照动物中，视网膜功能恶化。

因而，在一个实施方案中，描述了一种剂量制剂，其适合24小时或 每天将9-顺式-R-Ac施用给有此需要的受试者，所述剂量制剂包含在大 豆油中的约1.25-20mg/mL的9-顺式-R-Ac，其中所述剂量制剂在24小 时时段内会提供约1.25-40mg的9-顺式-R-Ac/m²受试者体表面积。

在另一个实施方案中，所述剂量制剂会在剂量制剂的口服或胃给药 以后约3-6小时，提供达到9-顺式-视黄酯的最大或峰值血浆浓度的时间。 本文使用的“峰值血浆浓度”是用于评估药物产品的生物利用度的药代动 力学量度。血浆药物浓度随吸收程度而增加；当药物清除速率等于吸收 速率时，达到峰值。除了最大(峰值)血浆药物浓度以外，对应的峰值 时间(产生最大血浆药物浓度的时间)和在血浆浓度-时间曲线下的面积， 也是药代动力学参数。

在另一个实施方案中，本文描述了一种剂量制剂，其适合通过给受 试者玻璃体内地施用乙酸9-顺式-视黄酯，进行单次给药，所述剂量制剂 包含在大豆油中的约18-40％mg/mL的乙酸9-顺式-视黄酯。已经发现， 单次剂量的玻璃体内给药可以在受试者的眼中持续数天、甚至数周，可 能是通过持续释放的方式。

9-顺式-视黄酯作为类视色素补偿疗法的应用

本文还描述了使用式(I)的9-顺式-视黄酯作为人类视网膜变性的类 视色素补偿疗法的方法。

进行进行了适当的动物模型，其用于评价9-顺式-视黄酯作为类视色 素补偿疗法的效力和安全性(参见，实施例)。使用的动物模型是Rpe65^-/-小鼠，其缺少视网膜色素上皮-特异性的65kDa蛋白(RPE65)，并发 展为视网膜病变和失明，类似于人类的LCA。

药物前体的药代动力学和药效动力学效应指示，在Rpe65^-/-小鼠模型 中，所述药物前体在肝脏中被转化成前药，即大部分转化成棕榈酸9-顺 式-视黄酯(参见，实施例)。此外，在Rpe65^-/-小鼠模型中，观察到9- 顺式-类视色素已经在2个途径中递送至视网膜，即主要地且迅速地从循 环血液中递送，次要地且更缓慢地从储存在肝脏中的9-顺式-类视色素递 送(参见，实施例5)。

通过在Rpe65^-/-小鼠中使用几种不同的方案来评价药物效力和安全 性，证实了9-顺式-视黄酯可以用作合成的类视色素，用于治疗人LCA 患者。观察到视觉功能的剂量和给药时段依赖性的保留，甚至在测试的 最低的1和4mg/kg剂量(图2、4、6、8)。重要的是，观察到药物前 体9-顺式-R-Ac的效力的剂量依赖性的延长。

因而，一个实施方案提供了一种治疗人受试者的勒伯尔先天性黑矇 的方法，所述方法包括：施用药物制剂，所述药物制剂具有在大豆油中 的有效量的一种或多种式(I)的9-顺式-视黄酯。在一个更具体的实施方案 中，所述式(I)的9-顺式-视黄酯是乙酸9-顺式-视黄酯。

另一个实施方案提供了一种方法，所述方法包括：给缺乏11-顺式- 视黄醛的人受试者施用药物制剂，所述药物制剂具有在大豆油中的有效 量的一种或多种式(I)的9-顺式-视黄酯。在一个更具体的实施方案中，所 述式(I)的9-顺式-视黄酯是乙酸9-顺式-视黄酯。

下面的非限制性实施例进一步例证了本文所述的不同实施方案。

实施例

材料、方法和分析

视网膜电流图(ERG)—如在下述文献中所述，在麻醉的小鼠上记 录ERG：例如，Maeda A，等人Role of photoreceptor-specific retinol  dehydrogenase in the retinoid cycle in vivo.J Biol Chem  2005；280：18822-18832；和Maeda T，等人A Critical Role of CaBP4 in  the Cone Synapse.Investigative ophthalmology & visual science  2005；46：4320-4327。

简而言之，在记录之前，首先使小鼠暗适应过夜。然后，在暗室用 灯(safety light)下，通过腹膜内注射20μl/g体重的6mg/ml氯胺酮和 0.44mg/ml赛拉嗪(用10mM磷酸钠pH 7.2稀释，含有100mM NaCl)， 麻醉小鼠。用1％托吡卡胺扩大瞳孔。将接触镜电极放在眼上，将参比电 极和接地电极分别放在耳朵和尾巴上。使用通用测试和电生理学系统 (UTAS)E-3000(LKC Technologies，Inc.)，记录ERGs。

单次快速(single flash)记录—采用在一定强度范围内(-3.7至2.8log cd.s.m^-2)的白光闪烁(flash)刺激，并根据强度调节闪烁持续时间(20 μs至1ms)。在闪烁刺激之间的充分间隔(10s至10min)，做出2-5 次记录，以允许小鼠恢复。通常，将4-8只动物用于记录每个点。将单 因素方差分析(one-way ANOVA)检验用于应答的统计分析。

组织学和免疫组织化学—如Maeda A，等人(同上)所述，进行用 于眼分析的组织学规程。

视黄酸和非极性类视色素的分析—与提取、类视色素衍生化和类视 色素的分离有关的所有实验操作，都在由Kodak No.1暗室用灯滤光片 (透光度＞560nm)提供的淡红光下进行。如以前在例如Batten ML.等 人(同上)中所述，进行从肝脏提取视黄酸。使用Agilent 1100 HPLC 和下述2个串联的正相柱，分析血浆、眼和肝中的极性类视色素：Varian  Microsorb二氧化硅3μm，4.6x 100mm(Varian，Palo Alto，CA)，和 Ultrasphere-Si，5μm，4.6x 250mm柱(Aleman TS，等人，同上)。使 用己烷∶2-丙醇∶冰醋酸(1000∶4.3∶0.675；v/v/v)的等度正相系统在20℃ 进行洗脱，流速为1ml/min，在355nm检测。使用购自Sigma-Aldrich 的全-反式-视黄酸和9-顺式-视黄酸标准品，进行校正。通过正相HPLC (Ultrasphere-Si，5μm，4.6x250mm，Beckman，Fullerton，CA)，使用 10％乙酸乙酯和90％己烷，以1.4ml/min的流速，分析血浆、眼和肝中 的非极性类视色素，通过具有二极管阵列检测器和HP Chemstation  A.03.03软件的HP1100HPLC，在325nm进行检测。

实施例1

不同制剂的稳定性实验

制备了9-顺式-R-Ac的几种不同的基于脂质的制剂，以测试不同脂 质媒介物所提供的稳定性。由于认为9-顺式-R-Ac是光敏感的，在可能 的时候，使用琥珀色瓶，并在金荧光灯下操作化合物。从-20℃冰箱取出 9-顺式-R-Ac，并在室温温热30分钟。在氩气流下进行化合物操作，将 化合物转移进预先称重的琥珀色瓶中，并重新称重，以计算化合物的量， 然后给瓶回充氩，并在-20℃保存备用。

使用装有准确称重的化合物的琥珀色瓶，制备9-顺式-R-Ac(1.4-8 mg/mL)在不同载体/媒介物中的混合物。给样品瓶回充氩，并通过涡旋 进行混合。将聚氧乙烯(35)蓖麻油样品加热至60℃。将每个样品分成2 份，并在4℃或40℃保存。在制备后(第0天)和在最多2周的时间点， 通过HPLC，分析样品的乙酸9-顺式-视黄酯含量。

在THF中，将用于HPLC分析的样品稀释至大约0.1mg/mL。立即 分析样品，或在-20℃或-70℃保存最多1周以备分析。相对于在第0天时 的制剂浓度(通过HPLC)，计算回收百分比。

意外地，含有和不含BHT的大豆油(美国药典，USP)会提供最稳 定的9-顺式-R-Ac悬浮液，特别是在生理温度(约40℃)，正如在第7 天和第14天时制剂中的9-顺式-R-Ac含量的数量百分比所指示(表2)。

表2

实施例2

乙酸9-顺式-视黄酯代谢物的血浆保留

制备了几种不同的基于油的制品，以测试9-顺式-R-Ac在血浆中的 吸收水平。更具体地，通过胃管饲法，将单次50mg/kg剂量的悬浮于4 种不同的媒介物油中的的乙酸9-顺式-视黄酯(50mg/kg)施用给5周龄 C57/B16小鼠，然后测定血浆中的类视色素水平(对于每组中的每个时 间点，n＝5)。

与芥花籽油和菜籽油相比，9-顺式-R-Ac在大豆油或葵花子油中的溶 液，会提供9-顺式-R-Ac的最佳吸收，正如脂肪酸9-顺式-视黄酯和9-顺 式-视黄醇(9-顺式-R-Ac的两种活性代谢物)的最高血浆水平所证实的 (图1A、C、11)。在约3h时，观察到这些9-顺式-类视色素的最高血 浆水平。全-反式-视黄醇和脂肪酸全-反式-视黄酯的血浆水平没有显著差 别，无论是在实验媒介物中，还是在23h实验期中，这表明，顺式-类视 色素没有被转化成全-反式-类视色素(图1B、D)。

图10显示了通过HPLC测得的血浆中的类视色素。在洗脱期早期 (a、b、c)，检测到脂肪酸视黄酯，其由9-顺式(a、c)的4个峰和全 -反式(b)异构体的2个峰组成。9-顺式-视黄醇(d)和全-反式-视黄醇 (e)更晚地洗脱。

实施例3

单次剂量的9-顺式-R-Ac对Rpe65^-/-小鼠的视网膜功能的影响

将单次剂量(2-50mg/kg)的在大豆油中的9-顺式-R-Ac施用给5周 龄Rpr65Rpe65^-/-小鼠，以测试前药前体(pre-prodrug)9-顺式-R-Ac是 否能够将人工生色团递送至眼。

小鼠没有表现出明显的临床副作用，甚至在接受50mg/kg的最高剂 量以后。在管饲法后暗适应3天以后，记录暗视的单次快速ERGs，并 收集眼，用于评估9-顺式-视黄醛水平。

治疗的小鼠的暗视的ERGs表现出a-波和b-波振幅的剂量依赖性的 增加(图2A、B)；在高强度刺激以后提供显著改善的最低测试剂量是 6.25mg/kg。类似地，在治疗的小鼠的眼中发现了9-顺式-视黄醛的剂量 依赖性的积累，其与视网膜功能的改善相关联(图2C)。在任一只分析 的眼中，没有检测到脂肪酸9-顺式-视黄酯，而脂肪酸全-反式-视黄酯的 水平范围是约1至1.6nmol/眼，且在4个治疗组之间没有显著差异。此 外，脂肪酸全-反式-视黄酯水平与关于未治疗的5周龄Rpe65^-/-小鼠所报 道的1.2nmol/眼类似。

仅在以50mg/kg给药的小鼠的眼中，检测到9-顺式-视黄醇(43pmol/ 眼)，而全-反式-视黄醇水平(在14-22pmol/眼变化)在4个治疗组之 间没有显著差异。在任一只眼中，没有检测到11-顺式-类视色素。

因而，结果提示，9-顺式-视黄醛与视蛋白重组，以形成异视紫红质。 重要的是，更低剂量的9-顺式-R-Ac(2和4mg/kg)会诱导积极的ERG 效应，尽管在眼中仅检测到痕量水平的9-顺式-视黄醛(图2)。

实施例4

持续14天每天施用的9-顺式-R-Ac的影响

在重复每天施用9-顺式-R-Ac以后，测试了Rpe65^-/-和C57B1/6小鼠 的视网膜功能。为了直接测试该功能，以1、4或12.5mg/kg的剂量，持 续14天每天通过管饲法给5周龄Rpe65^-/-小鼠施用在大豆油中的9-顺式 -R-Ac。在治疗的最后11天期间，将小鼠暴露于交替的黑暗和荧光灯(亮 度范围为500-1500lux)环境。记录暗视的单次快速ERGs，并测量眼 中的类视色素水平(图3)。

ERGs表明，与基线5周龄Rpe65^-/-小鼠相比，在治疗的小鼠中，a- 波和b-波的振幅剂量依赖性地增加(图4A、B)。甚至1mg/kg的最低 每天实验剂量引起了视网膜功能与对照组相比的显著改善。

在敲除的动物的眼中，可容易地检测到9-顺式-视黄醛，但是脂肪酸 9-顺式-视黄酯和9-顺式-视黄醇都不存在(图11A-C)。但是，脂肪酸 9-顺式-视黄酯确实以剂量依赖性的方式积累在C57B1/6和Rpe65^-/-小鼠 的肝中(图11D)。9-顺式-视黄醛在这些小鼠的眼中的存在，提示视网 膜功能的改善，正如在Rpe65^-/-小鼠的单次剂量研究中所观察到的。在治 疗的小鼠的眼中，也存在9-顺式-视黄醛的剂量依赖性的积累(图4C)。 在基线和1mg/kg治疗组的眼中，没有检测到9-顺式-视黄醛，而在每天 4和12.5mg/kg组中，分别测量到38±4和95±14pmol。在4和12.5mg/kg/ 天组中，脂肪酸9-顺式-视黄酯的水平较低(1pmol/眼)，在来自其它组 的眼中不可发现(图4D)。在任何组中都没有发现全-反式-视黄醇和9- 顺式-视黄醇。在暴露于9-顺式-R-Ac的小鼠的眼中，脂肪酸全-反式-视 黄酯(主要是棕榈酸酯、硬脂酸酯和油酸酯)的水平的范围是1.2-1.4nmol/ 眼，且与对照眼中的水平(1.2nmol/眼，5-周龄)没有显著差异。

ERG应答指示提高的效力和9-顺式-R-Ac的剂量依赖性方式的动力 学。与基线5周龄Rpe65^-/-小鼠相比，最低剂量(1mg/kg)显著改善了 ERG应答，尽管在眼中没有检测到9-顺式-视黄醛和脂肪酸9-顺式-视黄 酯(图4)。这提示，9-顺式-视黄醛随着光暴露(8h照明/16h黑暗) 而消失，并且脂肪酸9-顺式-视黄酯被替代性地用于再生异视紫红质。实 际上，在肝样品中检测到脂肪酸9-顺式-视黄酯的剂量依赖性的方式的积 累，这提示，脂肪酸9-顺式-视黄酯的肝脏储存可以充当蓄池，以在眼中 产生9-顺式-视黄醛和异视紫红质。

在该14-天研究中，1、4、12.5和50mg/kg的每日剂量都被5周龄 C57B1/6和Rpe65^-/-小鼠良好地耐受，证实了9-顺式-R-Ac的安全性。

实施例5

在3日剂量的9-顺式-R-AC以后改善的视网膜功能的持续时间

9-顺式-视黄醇(以脂肪酸9-顺式-视黄酯的形式)积累在Rpe65^-/-小 鼠的肝脏中，所述小鼠被施用至少12.5mg/kg重复剂量的9-顺式-R-Ac 持续2周(参见，图11D、实施例4)。

为了评估小鼠的储存9-顺式-类视色素并在以后在类视色素循环中 利用它们的能力，以1、4或12.5mg/kg/天的剂量，通过管饲法给保持在 暗处的5周龄Rpe65^-/-小鼠施用在大豆油中的9-顺式-R-Ac，每天1次， 连续3天。然后使小鼠暴露于下述周期：亮度范围为500-1500lux的8h 荧光灯，随后在暗处16h。

在光暴露的第1天(第4天)、第2天(第5天)、第4天(第7 天)和第6天(第9天)结束时，进行ERGs和类视色素分析(图5)。 记录至最多第9天的ERG应答的a-和b-波振幅(图6A-F)在每个时间 点是剂量依赖性的，并随着光暴露次数而下降。最高测试剂量(12.5 mg/kg/天)一直到第9天显著改善了在高强度刺激下的a-和b-波(图6A -B)，而4mg/kg和1mg/kg的剂量一直到第9天和第7天分别表现出 a-波振幅的改善，一直到第9天表现出b-波振幅的改善(图6C-F)。眼 中的9-顺式-视黄醛的水平也是剂量依赖性的，并随着时间下降(图12)。 在第4天时在所有治疗的小鼠的视网膜中检测到该化合物(图12)，但 是在第5天时仅在暴露于4和12.5mg/kg的小鼠的视网膜中检测到，在 第7天时仅在12.5mg/kg组中检测到。在第9天之前，在治疗或对照小 鼠的视网膜中没有发现9-顺式-视黄醛。因而，不需要每天施用9-顺式 -R-Ac来向眼递送9-顺式-R-Ac和维持Rpe65^-/-小鼠的视网膜功能的改善。

因而，已经证实，ERG振幅以通常剂量依赖性的方式得到改善，且 该积极效应维持至治疗后最多4-6天。此外，关于在这些动物的眼中发 现的9-顺式-视黄醛水平，观察到类似的模式。重要的是，在停止治疗以 后，在4mg/kg剂量水平的ERG应答的改善持续了4-6天，这时在眼中 不再能够发现9-顺式-视黄醛。这些结果指示，视网膜中的痕量水平的9- 顺式-视黄醛(其稳定化ROS)会保留9-顺式-R-Ac治疗的积极效应，而 在对照组中的ERG应答已经恶化。然后在光暴露以后的暗适应期间，检 查了眼中的类视色素水平的动力学。重要的是，在暗适应期间，眼中的 脂肪酸9-顺式-视黄酯和9-顺式-视黄醛得到恢复。

实施例6

在间断地和每天施用9-顺式-R-Ac持续8周以后Rpe65^-/-小鼠的视网 膜功能

因为3次低日剂量的9-顺式-R-Ac改善了6天光暴露以后的ERG应 答(图6A-F)，进行延长的8-周间断给药方案。

将Rpe65^-/-小鼠分成2组(间断组，和每天给药组)，各自用1或4 mg/kg的9-顺式-R-Ac治疗共8周。在8-周方案的每个周中，间断组在 前3天每天给药，随后停药4天。每天给药组每天给药，持续整个8周 时段。给药方案如图7所示。将小鼠暴露于下述的每天周期：8h亮度范 围为500-1500lux的荧光灯，继之以16h黑暗。在第28天时记录ERGs， 并在第56天时再次记录，此后收集组织，用于眼和肝脏的类视色素分析 以及眼的组织学。

在第28天和第56天时，在间断组和每天给药组中的治疗的小鼠的 ERG应答显著优于对照组的那些，并在9-顺式-R-Ac治疗的小鼠和对照 小鼠中，观察到在第28天和第56天之间振幅的和缓变窄。间断给药和 每天给药方案都在第28天和第56天时引起了a-波和b-波的振幅的剂量 依赖性的增加(图8A-D)。与间断给药组相比，每天给药组中的应答更 显著。无论何种治疗方案，与处于高强度刺激的对照组相比，更低的剂 量(1mg/kg)足以造成ERG应答的显著改善。另外，a-波和b-波的振 幅在第28天和第56天时是类似的，这提示，一方面，9-顺式-视黄醇的 摄入和贮存之间已经达到平衡，另一方面，它在视网膜中的活动化会支 持类视色素循环。与这些ERG结果相一致，在眼中以剂量依赖性的方式 检测到9-顺式-视黄醛，其中在每天给药的小鼠中的水平更高(图13A)。 也在两组治疗的动物的眼中，发现了在低可变水平的脂肪酸9-顺式-视黄 酯(图13B)。不论何种方案，也在治疗的小鼠的眼中观察到脂肪酸全- 反式-视黄酯的剂量依赖性的轻微增加。在肝脏中，9-顺式-视黄醇以剂量 和方案依赖性的方式主要以脂肪酸9-顺式-视黄酯的形式储存(图14A， B)。这些方案没有显著影响脂肪酸全-反式-视黄酯的水平，尽管在接受 4mg/kg 9-顺式-R-Ac的小鼠中，可能已经存在轻微增加。9-顺式-R-Ac 的长期给药对视网膜具有剂量依赖性的保护作用，这通过光感受器外段 的长度(图9A、C)和外核层中的核的数目来评估(图9B、D)。这些 效应在上部视网膜中比在下部视网膜中更显著。在用4mg/kg每天给药 或4mg/kg间断给药方案治疗的小鼠中，视网膜横截面的更高倍放大图 像显示出视杆外段(ROS)形态学的改善和在上部视网膜和下部视网膜 的部分区域中更少的油滴样结构(图9E、F)。但是，与对照小鼠的视 网膜(图9I)相比，在通过任一个方案施用1mg/kg 9-顺式-R-Ac剂量的 小鼠的视网膜中，没有观察到显著变化(图9G，H)。

重要的是，在第56天时，在1和4mg/kg剂量组之间，用9-顺式-R-Ac 间断治疗的小鼠的ERG应答没有表现出显著差异，这提示，如果连续给 药，更低的1mg/kg剂量可能具有类似的效力。如图9所示，观察到ROS 的形态学改善，使得在用4mg/kg治疗的小鼠的上部视网膜中的ROS长 度明显更长，而在施用1mg/kg剂量的动物中没有观察到显著变化。这 些观察结果强烈地提示，1和4mg/kg的治疗方案都会维持Rpe65^-/-小鼠 的视网膜功能，且没有显著的临床毒性或类视色素在眼和肝脏中的异常 积累。

在本说明书中提及的和/或在申请数据表单中列出的所有上述美国 专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和 非专利出版物，都通过引用整体并入本文中。

从前述内容应当理解，尽管为了例证目的，本文已经描述了本发明 的具体实施方案，可以做出不同的修改，而不偏离本发明的精神和范围。 因此，本发明仅受所附权利要求书的限制。