3-(4-(7H-吡咯并2,3-d嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈的羟基衍生物、酮基衍生物和葡糖苷酸衍生物

摘要

本发明提供3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈的羟基衍生物、酮基衍生物和葡糖苷酸衍生物。

说明书

相关申请

本申请要求2009年10月9日提交的美国临时申请第61/250,387号和2010 年3月22日提交的美国临时申请第61/316,218号的优先权。这些文件的公开 内容通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明提供3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙 腈的羟基衍生物、酮基衍生物和葡糖苷酸衍生物。

发明背景

蛋白激酶(PK)是调节不同的重要生物学过程的一组酶，所述生物学过程 包括细胞生长、存活和分化、器官形成和形态发生、新血管形成、组织修复 和再生等。蛋白激酶通过催化蛋白(或底物)的磷酸化并由此调节底物在各种生 物学环境中的细胞活性而发挥它们的生理功能。除了在正常组织/器官中的功 能之外，许多蛋白激酶还在大量的包括癌症在内的人类疾病中起到更专门的 作用。蛋白激酶的亚类(也称为致癌蛋白激酶)在失调时，可以引起肿瘤形成和 生长，且进一步促成肿瘤维持和进展(Blume-Jensen P等人，Nature 2001， 411(6835)：355-365)。迄今为止，致癌蛋白激酶代表用于癌症干预和药物开 发的最大且最有吸引力的蛋白靶标组之一。

Janus激酶(JAK)家族在涉及免疫应答的细胞增殖和功能的细胞因子依赖 性调节中起作用。目前，存在四种已知的哺乳动物JAK家族成员：JAK1(也 称为Janus激酶-1)、JAK2(也称为Janus激酶-2)、JAK3(也称为白细胞Janus 激酶；JAKL；L-JAK和Janus激酶-3)和TYK2(也称为蛋白质-酪氨酸激酶2)。 JAK蛋白质的大小范围为120至140kDa并包含七个保守的JAK同源(JH)结 构域；其中之一是功能性催化激酶结构域，另一个是潜在地起到调节功能和/ 或用作STAT的停泊位点的假激酶结构域(Scott，Godshall等人，2002，上文)。

在JAK激酶水平阻断信号转导有希望用于开发人类癌症的疗法。还设想 JAK激酶的抑制在罹患皮肤免疫病症例如银屑病和皮肤敏化的患者中具有治 疗益处。因此，广泛寻找Janus激酶或相关激酶的抑制剂，且若干出版物报 道了有效类别的化合物。例如，包括在下面示出的(R)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈的某些JAK抑制剂在2006年12月12 日提交的美国序列第11/637,545号(US 2007/0135461)；2009年7月16日提 交的美国序列第12/138,082号(US 2009/0181959)中报道；且化合物I的某些 代谢物在2008年6月12日提交的美国序列第12/137,883(US 2008/0312258) 中报道，其中每一个均通过引用整体并入本文。

因此，为了开发新的和更有效的治疗癌症和其它疾病的药物，不断需要 抑制激酶例如Janus激酶的新的或改进的药剂。本文描述的代谢物、组合物 和方法针对这些需求和其它目标。

发明概述

本发明尤其提供式I的化合物的羟基衍生物、酮基衍生物和葡糖苷酸衍 生物：

或其药学上可接受的盐。

因此，在一个方面，本文提供了式I的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

n个C-H基团各自独立地被C-OH取代；或，

一个CH₂基团独立地被C＝O取代；或，

一个C-H基团被以下基团取代：

两个C-H基团各自独立地被C-OH取代，且一个C-H基团被以下基团取 代：

n是1、2、3或4；

条件是所述化合物不选自：

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-羟基环戊基)丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(2-羟基环戊基)丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-氧代环戊基)丙腈；

和其药学上可接受的盐。

在式I的一个实施方案中，

氰基的α位碳原子不被C-OH或C＝O基团取代；和

氰基的β位碳原子不被C-OH基团取代。

在化合物的另一个实施方案中，n个C-H基团各自独立地被C-OH取代。 在另一个实施方案中，n是1。在又一个实施方案中，n是2。在还另一个实 施方案中，n是3。在另一个实施方案中，n是4。

在式I的另一个实施方案中，一个CH₂基团独立地被C＝O取代。在还另 一个实施方案中，一个C-H基团被以下基团取代：

在另一个实施方案中，一个饱和的C-H基团被以下基团取代：

在又一个实施方案中，两个C-H基团各自独立地被C-OH取代，且一个 C-H基团被以下基团取代：

本发明还提供包含本文描述的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种 药学上可接受的载体的组合物。

本发明还提供调节JAK的活性的方法，该方法包括使JAK与本文描述的 某些化合物或其药学上可接受的盐接触。本发明还提供治疗患者疾病的方法， 该方法包括向患者施用治疗有效量的本文描述的某些化合物或其药学上可接 受的盐。在特定的实施方案中，疾病与JAK活性相关联。这样的疾病包括例 如同种异体移植物的排斥或移植物抗宿主病。疾病还可以是自身免疫病，包 括但不限于皮肤病、多发性硬化、类风湿性关节炎、幼年型关节炎、I型糖尿 病、狼疮、炎性肠病、克罗恩病(Crohn’s disease)、重症肌无力、免疫球蛋白 肾病、心肌炎或自身免疫甲状腺病症。自身免疫病还可以是大疱性皮肤病， 例如，寻常性天疱疮(PV)或大疱性类天疱疮(BP)。皮肤病可以是特应性皮炎、 银屑病、皮肤敏化、皮肤刺激、皮疹、接触性皮炎或变应性接触性敏化。

在另一个实施方案中，疾病是病毒性疾病。可以通过本文描述的化合物 治疗的病毒性疾病的实例包括埃-巴二氏病毒(EBV)、乙型肝炎、丙型肝炎、 HIV、HTLV 1、水痘带状疱疹病毒(VZV)或人乳头瘤病毒(HPV)。

在另一个实施方案中，疾病是癌症，例如实体瘤。待治疗的癌症可以是 前列腺癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi′s  sarcoma)、卡斯尔曼氏病(Castleman′s disease)或胰腺癌。在特定的实施方案中， 癌症是前列腺癌。癌症可以是血液癌。癌症还可以是淋巴瘤、白血病或多发 性骨髓瘤。在另一个实施方案中，癌症是皮肤癌，例如，皮肤T细胞淋巴瘤 或皮肤B细胞淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。待治疗 的疾病还可以是由癌症导致或与癌症相关的疲劳、或由癌症导致或与癌症相 关的厌食症或恶病质。

在另一个实施方案中，待治疗的疾病是骨髓增生性疾病，例如，真性红 细胞增多症(PV)、原发性血小板过多症(ET)、骨髓纤维化伴骨髓化生(MMM)、 慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、嗜酸性白 细胞增多综合征(HES)或系统性肥大细胞病(SMCD)。

在另一个实施方案中，待治疗的疾病是炎性疾病。炎性疾病可以是眼部 炎性疾病，例如虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜炎或结膜炎。炎性疾病可以是呼吸 道例如上呼吸道或下呼吸道的炎性疾病。炎性疾病可以是炎性肌病或心肌炎。

在另一个实施方案中，疾病是缺血再灌注或与缺血事件有关。

详细描述

本发明尤其提供3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊 基丙腈的羟基衍生物、酮基衍生物和葡糖苷酸衍生物。在一些实施方案中， 化合物是化合物I的代谢物。在一些实施方案中，化合物是可以调节一种或 多种JAK的活性且可以用于例如治疗与JAK表达或活性相关的疾病的活性代 谢物。在一些实施方案中，本文描述的代谢物化合物的水平被测量并被绘成 曲线以便帮助医师调节式I化合物的剂量水平。

因此，本发明提供式I的化合物：

                            I

或其药学上可接受的盐，其中：

n个C-H基团各自独立地被C-OH取代；或，

一个CH₂基团独立地被C＝O取代；或，

一个C-H基团被以下基团取代：

两个C-H基团各自独立地被C-OH取代，且一个C-H基团被以下基团取 代：

n是1、2、3或4；

条件是所述化合物不选自：

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-羟基环戊基)丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(2-羟基环戊基)丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-氧代环戊基)丙腈；

和其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，n个C-H基团各自独立地被C-OH取代。在一些实 施方案中，n是1。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。

在一些实施方案中，n是4。

在一些实施方案中，一个CH₂基团独立地被C＝O取代。

在一些实施方案中，一个C-H基团被以下基团取代：

在一些实施方案中，一个饱和的C-H基团被以下基团取代：

在一些实施方案中，两个C-H基团各自独立地被C-OH取代，且一个C-H 基团被以下基团取代：

在一些实施方案：

氰基的α位碳原子不被C-OH、C＝O或基团取代；且

氰基的β位碳原子不被C-OH或基团取代。

在一些实施方案中：

氰基的α位碳原子不被C-OH或C＝O基团取代；且

氰基的β位碳原子不被C-OH基团取代。

在另一个实施方案中，本发明提供式II的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中的1、2、3或4个各自独立 地被OH取代；或，

碳h、i、j、k或m中的一个独立地被＝O取代；或，

碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中的一个被以下基团取代：

碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中的两个各自独立地被OH和 以下基团取代：

条件是所述化合物不选自：

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-羟基环戊基)丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(2-羟基环戊基)丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-氧代环戊基)丙腈；

和其药学上可接受的盐。

在式II的一些实施方案中，碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中 的1、2、3或4个各自独立地被OH取代。在一些实施方案中，碳a、b、c、 d、e、f、g、h、i、j、k或m中的一个被OH取代。在一些实施方案中，碳a、 b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中的2个各自独立地被OH取代。在一 些实施方案中，碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中的3个各自独立 地被OH取代。在一些实施方案中，碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或 m中的4个各自独立地被OH取代。

在一些实施方案中，碳h、i、j、k或m中的一个被＝O取代。

在一些实施方案中，碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中的一个 被以下基团取代：

在一些实施方案中，碳f、g、h、i、j、k或m中的一个被以下基团取代：

在一些实施方案中，碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中的两个 各自独立地被OH取代，且碳a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k或m中的一 个被以下基团取代：

在一些实施方案中：

碳m不被OH、＝O或基团取代；且

碳f不被OH或基团取代。

在一些实施方案中：

碳m不被OH或＝O基团取代；且

碳f不被OH基团取代。

前述实施方案中的每一个假定遵守合适化合价规则。

在一些实施方案中，化合物选自：

6-(3-(1-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-2-氰基乙基)环戊 氧基)-3，4，5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(1，2-二羟基环戊基)丙 腈；和

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(1-羟基环戊基)丙腈；

或前述任一种的药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，化合物选自：

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(1-羟基环戊基)丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基-3-羟基丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基-2-羟基丙腈；

3-环戊基-3-(5-羟基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈；

3-环戊基-3-(3-羟基-4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈；

3-环戊基-3-(4-(5-羟基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈；

3-环戊基-3-(4-(6-羟基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈；

3-环戊基-3-(4-(2-羟基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈；

3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(1，2-二羟基环戊基)丙 腈；

3-环戊基-3-(4-(5，6-二羟基-6，7-二氢-5H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑 -1-基)丙腈；和

6-(4-(1-(2-氰基-1-环戊基乙基)-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7- 基)-3，4，5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸；

或前述任一种的药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本文描述的化合物可以包括下面图1-7中示出的化 合物及其对映体、非对映体和外消旋物。

图1

图2

图3

图4

图5

图6

图7

在下面表1示出某些代谢物。结构式意图包括所有可能的立体异构体。

表1

^*括号中的数字是指表2(下文)中化合物数量。

本文描述的化合物是(R)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1- 基)-3-环戊基丙腈的代谢物。本发明的代谢物是从收集自JAK抑制剂 (R)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈(化合物I) 的药代动力学和毒物动力学研究的人、大鼠或狗尿样中分离得到的。某些代 谢物可以是JAK抑制剂，且与化合物I相比，可以具有与在人微粒体中显著 更高的游离级分和更高的代谢稳定性相关的有利性质。相比于化合物I，本代 谢物可有利地在人体内具有更长的消除半衰期。

在一些实施方案中，本发明的代谢物基本上被分离。所谓“基本上被分离” 是指化合物至少部分或基本上与形成或检测到其的环境分离。部分分离可以 包括例如富集本发明化合物的组合物。基本上分离可以包括包含至少约50重 量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重 量％、至少约95重量％、至少约97重量％或至少约99重量％的代谢物的组 合物。

本发明还包括本文描述的化合物的药学上可接受的盐。如本文使用，“药 学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中通过将现存的酸或碱部 分转化为其盐形式来改性母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限 于碱性残留物例如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残留物例如羧酸的碱性盐 或有机盐；以及类似物。本发明的药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机 酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本发明的药学上可接受的盐可 以由包含碱性或酸性部分的母体化合物通过常规的化学方法来合成。通常， 这样的盐可以通过在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中使这些化合物 的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸反应来制备；通常，非水介质 例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的清单见于 Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿的药物科学)，第17版，Mack  Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页和Journal of Pharmaceutical  Science，66，2(1977)，其中每一个通过引用整体并入本文。

短语“药学上可接受的”在本文用于指在可靠的医疗判断的范围内；适合 用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、变态反应或其它问题 或并发症；与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂 型。

本文描述的化合物是不对称的(例如，具有一个或多个立构中心)。除非另 外指出，否则意指所有的立体异构体例如对映体和非对映体。如何由旋光性 起始材料制备旋光体的方法是本领域已知的，例如通过外消旋混合物的拆分 或通过立体选择性合成。

本文描述的化合物还包括代谢物中存在的原子的所有同位素。同位素包 括具有相同原子序数和不同质量数的那些原子。例如，氢的同位素包括氚和 氘。化合物还可以包括化合物的溶剂化物和水合物或盐形式。

如本文使用的术语“化合物”意图包括所描绘的结构的所有立体异构体、 几何异构体、互变异构体和同位素。

合成

本文描述的化合物(包括其盐)可以使用已知的有机合成技术来制备且 可以根据许多可能合成途径中的任一种来合成。

制备本文描述的化合物的反应可以在合适的溶剂中进行，合适的溶剂可 以由有机合成领域的技术人员容易地选定。合适的溶剂可在进行反应的温度 (例如可以从溶剂的冰点至溶剂的沸点范围内的温度)下基本上不与起始材 料(反应物)、中间体或产物反应。给定反应可以在一种溶剂中或多于一种溶剂 的混合物中进行。根据具体的反应步骤，技术人员可选择用于具体反应步骤 的合适溶剂。

本文描述的化合物的制备可涉及各种化学基团的保护和脱保护。保护和 脱保护的需要和适当保护基的选择可以由本领域技术人员容易地确定。保护 基的化学可以见于例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in  Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，第3版，Wiley & Sons，Inc.，New  York(1999)，其通过引用整体并入本文。

可以根据本领域已知的任何合适的方法来监测反应。例如，产物形成可 以通过光谱方法例如核磁共振光谱法(例如，¹H或¹³C)、红外光谱法、分光光 度法(例如，UV可见)或质谱法，或通过色谱法例如高效液相色谱法(HPLC) 或薄层色谱法来监测。

本文描述的化合物可以根据文献中已知的许多制备途径来制备。例如， 本文描述的化合物可以通过与以下美国专利申请中所述方法类似的方法制 备：2006年12月12日提交的美国序列第11/637,545号(US 2007/0135461)； 2009年7月16日提交的美国序列第12/138,082号(US 2009/0181959)；和2008 年6月12日提交的美国序列第12/137,883号(US 2008/0312258)，其中每一个 通过引用整体并入本文。用于制备本文描述的化合物的示例性合成方法在下 面的方案中提供。

如方案1所示的，化合物32的合成从4-氯吡咯并嘧啶S1开始。S1与吡 唑硼酸盐S2在碱性条件下在Pd(0)催化剂的存在下进行Suzuki偶联可以提供 三环化合物S3，随后使用N-碘代琥珀酰亚胺将三环化合物S3选择性地转化 为碘代化合物S4。碘代化合物S4转化为相应的乙酸酯S5。使用在乙酸中的 4M溴化氢处理S5提供吡咯环中具有所需氧化以及甲氧基脱保护为游离羟基 的S6。通过使用三氯乙酰氯和三乙胺处理S6以实现脱水将在这些条件下水 解为酰胺的氰基重新安装在32中。

方案1

2008年6月12日提交的美国序列第12/137,883中已经报道了单羟基化 化合物42(代谢物8)。此外，在环戊基环上具有羟基的化合物还可按照方案2 合成。例如，市售的外消旋物S14，其中醇被保护，随后将羧酸酯还原为醛， 随后将醛烯化以提供S17。S9至S17在碱性条件下的共轭加成提供S18，依 次从S18除去醇和吡咯环上的保护基以提供非对映体的混合物，然后使用多 重手性HPLC柱分离非对映体的混合物以提供S19的四种非对映体。在一些 实施方案中，本发明提供制备化合物42或其药学上可接受的盐的方法，该方 法包括方案2中的步骤中的一个或多个。

方案2

单羟基化化合物36的另一个实例通过方案3中示出的顺序获得。受保护 的氰醇(cycanohydrin)S31可以用DIBAL还原为相应的醛，随后用膦酸酯 例如S7烯化以提供巴豆腈S33。S9至S33在碱性条件下的共轭加成提供S34， 从S3除去吡咯环上的保护基以提供非对映体的混合物，然后可以使用多重手 性HPLC柱来分离非对映体的混合物，以提供36的单个立体异构体。

方案3

二羟基化代谢物可以如方案4所示的类似方式来获得：环戊烯甲醛S6A 可以用叶立德S7直接处理以产生巴豆腈衍生物S8。腈S8然后可以与吡唑 S9在碱例如DBU的存在下反应以产生非对映体的混合物形式的S10，在除 去SEM基团之后，S10可以用四氧化锇来二羟基化以提供顺式醇，即顺式 S12A。该混合物的单个立体异构体(顺式S12A)可以通过手性色谱法分离以产 生对映体纯的醇。可以通过首先用m-CPBA来使烯烃环氧化，随后在酸性条 件下打开环氧化物来获得反式S12A。该混合物的单个立体异构体(反式S12A) 可以通过手性色谱法分离以产生对映体纯的醇。通过用S6B和S6C代替起始 醛S6A，相同的合成途径可以适合于获得同分异构体S12B和S12C。

方案4

可使用上述方法以及整体并入本文的2006年12月12日提交的美国专利 申请序列第11/637,545号；和2008年6月12日提交的美国专利申请序列第 12/137,883号中所描述的那些方法的组合来获得本发明的三羟基化合物。例 如，本文描述的羟基化合物和二羟基化合物可以在2008年6月12日提交的 美国专利申请序列第12/137,883号中所描述的斯文氧化(Swern oxidation)条件 下被氧化。包含羟基的代谢物的葡糖苷酸可以根据Suzuki等人的工序(Bioorg. Med.Chem.Lett.(1999)，9(5)，659-662，其整体并入本文)来合成。

方法

本文描述的某些化合物可以调节一种或多种Janus激酶(JAK)的活性。术 语“调节”意指增加或降低激酶的JAK家族的一个或多个成员的活性的能力。 因此，本文描述的某些化合物可以用于通过使JAK与本文描述的化合物或组 合物中的任何一种或多种接触来调节JAK的方法中。在一些实施方案中，某 些化合物可以用作一种或多种JAK的抑制剂。在一些实施方案中，本文描述 的某些化合物可以用于刺激一种或多种JAK的活性。在另外的实施方案中， 通过施用调节量的本发明的化合物，某些化合物可以用于调节需要调节受体 的个体中的JAK的活性。

化合物结合和/或调节的JAK可以包括JAK家族的任何成员。在一些实 施方案中，JAK是JAK1、JAK2、JAK3或TYK2。在一些实施方案中，JAK 是JAK1或JAK2。在一些实施方案中，JAK是JAK2。在一些实施方案中， JAK是JAK3。

在一些实施方案中，活性化合物可以是选择性的。所谓“选择性的”是指 相比至少一种其它JAK，化合物分别以更大的亲和力或效力结合或抑制 JAK(例如，对JAK1或JAK2的选择性超过对JAK3和/或TYK2的选择性的 选择性抑制剂)。在一些实施方案中，选择性意指JAK2的选择性抑制(例如， 超过对JAK1、JAK3和TYK2的选择性)。不希望被理论束缚，因为JAK3的 抑制剂可以导致免疫抑制作用，相比于JAK3对JAK2是选择性的且可用于治 疗癌症(例如，诸如多发性骨髓瘤)的化合物可以提供具有较少的免疫抑制副作 用的额外优点。选择性可以是至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至 少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍。 选择性可以通过本领域中的常规方法来测定。在一些实施方案中，选择性可 以每一种酶的Km进行测试。在一些实施方案中，相比于JAK3的对JAK2 的选择性可以通过细胞ATP浓度来确定。

本发明的另一个方面涉及治疗个体(例如，患者)中的JAK相关疾病或病 症的方法，该方法是通过向需要这种治疗的个体施用治疗有效量或剂量的本 文描述的某些化合物或其药物组合物。JAK相关疾病可以包括直接地或间接 地与包括过度表达和/或异常活性水平的JAK的表达或活性有关的任何疾病、 病症或病状。JAK相关疾病还可以包括可以通过调节JAK活性来预防、改善 或治愈的任何疾病、病症或病状。

JAK相关疾病的实例包括涉及免疫系统的疾病，包括，例如，器官移植 物的排斥(例如，同种异体移植物的排斥和移植物抗宿主病)。

JAK相关疾病的另外的实例包括自身免疫病，例如多发性硬化、类风湿 性关节炎、幼年型关节炎、I型糖尿病、狼疮、银屑病、炎性肠病、溃疡性结 肠炎、克罗恩病、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、自身免疫甲状腺病症以及 类似自身免疫病。在一些实施方案中，自身免疫病是自身免疫大疱性皮肤病， 例如寻常性天疱疮(PV)或大疱性类天疱疮(BP)。

JAK相关疾病的另外的实例包括变应性病状，例如哮喘、食物变态反应、 特应性皮炎和鼻炎。JAK相关的疾病的另外的实例包括病毒性疾病，例如埃- 巴二氏病毒(EBV)、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、HTLV 1、水痘带状疱疹病 毒(VZV)和人乳头瘤病毒(HPV)。

JAK相关疾病或病状的另外的实例包括皮肤病，例如银屑病(例如，寻常 性银屑病)、特应性皮炎、皮疹、皮肤刺激、皮肤敏化(例如，接触性皮炎、变 应性接触性皮炎或变应性接触性敏化)。例如，包括一些药物的某些物质当局 部应用时可以造成皮肤敏化。在一些实施方案中，至少一种JAK抑制剂以及 造成不必要的敏化的剂的共同施用或顺序施用可以有助于治疗这样的不必要 的敏化或皮炎。在一些实施方案中，皮肤病通过局部施用至少一种JAK抑制 剂来治疗。

在另外的实施方案中，JAK相关疾病是癌症，包括由以下表征的那些癌 症：实体瘤(例如，前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、 头颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、卡波济氏肉瘤、卡斯尔曼氏病、黑色素 瘤等)、血液癌(例如，淋巴瘤、白血病例如急性淋巴母细胞性白血病、急性髓 性白血病(AML)或多发性骨髓瘤)和皮肤癌例如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和 皮肤B细胞淋巴瘤。示例性皮肤T细胞淋巴瘤包括赛谢综合(Sezary syndrome) 征和蕈样肉芽肿病。

JAK相关疾病还可以包括由以下表达表征的那些：JAK2突变体，例如假 激酶结构域中具有至少一种突变的那些(例如，JAK2V617F)；在假激酶结构 域的外部具有至少一种突变的JAK2突变体；JAK1突变体；JAK3突变体； 红细胞生成素受体(EPOR)突变体；或CRLF2的失调表达。

JAK相关疾病还可以包括骨髓增生性疾病(MPD)例如真性红细胞增多症 (PV)、原发性血小板过多症(ET)、骨髓纤维化伴骨髓化生(MMM)、慢性髓细 胞性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、嗜酸性白细胞增多 综合征(HES)、系统性肥大细胞病(SMCD)以及类似疾病。

另外的JAK相关疾病包括炎症和炎性疾病。示例性炎性疾病包括结节病、 眼部炎性疾病(例如，干眼病、虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜炎、结膜炎或相关的 疾病)、呼吸道的炎性疾病(例如，上呼吸道包括鼻和窦，例如鼻炎或窦炎；或 下呼吸道包括支气管炎、慢性阻塞性肺病以及类似疾病)、炎性肌病例如心肌 炎和其它炎性疾病。可通过JAK抑制剂治疗的其它炎性疾病包括全身炎性响 应综合征(SIRS)和败血病性休克。

如本文使用，“干眼症”意图包括干眼病工作组(DEWS)的最近官方报告中 总结的疾病状态，干眼病工作组将干眼病定义为“泪液和眼表的多因子病，其 导致不舒适感、视力障碍和泪液膜不稳定性的症状，具有对眼表的潜在损伤。 其伴有增高的泪液膜的摩尔渗透压浓度和眼表的炎症。”Lemp，“The Definition  and Classification of Dry Eye Disease：Report of the Definition and Classification  Subcommittee of the International Dry Eye Workshop(干眼病的定义和分类：国 际干眼病工作组的定义和分类小组委员会的报告)”，The Ocular Surface，5(2)， 75-92，2007年4月，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，干眼症 选自水液性泪液不足型干眼(ADDE)或蒸发干眼症或其适当的组合。在一些实 施方案中，干眼症是舍格伦综合征干眼(SSDE)。在一些实施方案中，干眼症 是非舍格伦综合征干眼(NSSDE)。

在另外的方面，本发明提供在有需要的患者中治疗结膜炎、葡萄膜炎(包 括慢性葡萄膜炎)、脉络膜炎、视网膜炎、睫状体炎、巩膜炎、巩膜外层炎或 虹膜炎；治疗与角膜移植、LASIK(激光器辅助的原位角膜磨削术)、准分子激 光屈光性角膜切削术或LASEK(激光器辅助的上皮下角膜磨削术)相关的炎症 或疼痛；抑制与角膜移植、LASIK、准分子激光屈光性角膜切削术或LASEK 相关的视力损失；或抑制移植物排斥的方法，该方法包括向患者施用治疗有 效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。

JAK抑制剂还可以用于治疗缺血再灌注损伤或与炎性缺血事件相关的疾 病或病状例如中风或心搏停止。JAK抑制剂还可以用于治疗厌食症、恶病质 或疲劳，例如由癌症导致或与癌症相关的厌食症、恶病质或疲劳。JAK抑制 剂还可以用于治疗再狭窄、硬化性皮炎或纤维化。JAK抑制剂还可以用于治 疗与缺氧或星形胶质细胞增生相关的病状，例如，诸如糖尿病视网膜病、癌 症或神经变性。参见例如Dudley，A.C.等人Biochem.J.2005，390(Pt 2)：427-36 和Sriram，K.等人J.Biol.Chem.2004，279(19)：19936-47.Epub 2004年3月2 日。

JAK抑制剂还可以用于治疗痛风和由于例如良性前列腺肥大或良性前列 腺肥大症而增加的前列腺尺寸。

另外的JAK相关的疾病包括骨吸收疾病，例如骨质疏松症、骨关节炎。 骨吸收还可以与其它病状例如激素不平衡和/或激素疗法、自身免疫病(例如， 骨结节病)或癌症(例如，骨髓瘤)相关。由JAK抑制剂导致的骨吸收的减少可 以是约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％ 或约90％。

如本文使用，术语“接触”是指将指示部分在体外系统或体内系统中组合 在一起。例如，使JAK与化合物“接触”包括将本发明化合物施用至具有JAK 的个体或患者例如人，以及例如将化合物引入到包含含有JAK的细胞或纯化 制剂的样品中。

如本文使用，可互换使用的术语“个体”或“患者”是指任何动物，包括哺 乳动物，优选地小鼠、大鼠、其它啮齿类、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马或 灵长类，且最优选人。

如本文使用，短语“治疗有效量”是指引出由研究者、兽医、医学博士或 其它临床医师正在组织、系统、动物、个体或人中寻找的生物学响应或医学 响应的活性化合物或药剂的量。

如本文使用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指以下中的一种 或多种：(1)预防疾病；例如，预防可能易患疾病、病状或病症但还未经历或 显示疾病的病状或症状的个体中的疾病、病状或病症；(2)抑制疾病；例如， 抑制正经历或显示疾病、病状或病症的病状或症状的个体中的疾病、病状或 病症；和(3)改善疾病；例如，改善经历或显示疾病、病状或病症的病状或症 状的个体中的疾病、病状或病症(即，逆转病状或症状)，例如降低疾病的严重 性。

在将化合物I施用至个体之后代谢物在患者中的水平可以被测量并被绘 成曲线。这样的代谢物曲线然后可以用于调节该个体中的剂量方案(例如，用 于化合物I的施用)。例如，如在给定的时间段之后由各种代谢物的水平显示 的化合物I的较快清除率可以意味着初始剂量应上调。

组合疗法

一种或多种另外的药剂例如诸如化学疗法、抗炎剂、类固醇、免疫抑制 剂以及Bcr-Abl、Flt-3、RAF和FAK激酶抑制剂例如诸如WO 2006/056399 中所描述的那些或其它剂可以与本文描述的某些化合物组合用于治疗JAK相 关的疾病、病症或病状。一种或多种另外的药剂可以被同时地或顺序地施用 至患者。

示例性化学疗法包括蛋白体抑制剂(例如，硼替佐米)、沙利度胺、雷利度 胺和DNA损伤剂例如马法兰、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、依托泊苷、卡 莫司汀以及类似物。

示例性类固醇包括皮质激素类，例如地塞米松或强的松。

示例性Bcr-Abl抑制剂包括美国专利第5,521,184号、WO 04/005281和美 国序列第60/578,491号中公开的种类的化合物和其药学上可接受的盐。

示例性的合适的Flt-3抑制剂包括如WO 03/037347、WO 03/099771和 WO 04/046120所公开的化合物和它们的药学上可接受的盐。

示例性的合适的RAF抑制剂包括如WO 00/09495和WO 05/028444所公 开的化合物和它们的药学上可接受的盐。

示例性的合适的FAK抑制剂包括如WO 04/080980、WO 04/056786、WO  03/024967、WO 01/064655、WO 00/053595和WO 01/014402所公开的化合物 和它们的药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本文描述的一种或多种化合物可以与包括伊马替尼 的一种或多种其它激酶抑制剂组合用于治疗尤其耐伊马替尼或其它激酶抑制 剂的患者。

在一些实施方案中，一种或多种化合物可以与化疗剂组合用于治疗癌症 例如多发性骨髓瘤，且相比对单独的化疗剂的响应，可以改进治疗响应，而 没有加重其毒性作用。用于治疗多发性骨髓瘤的另外的药剂的实例，如可以 包括但不限于马法兰、马法兰加强的松[MP]、阿霉素、地塞米松和Velcade(硼 替佐米)。用于治疗多发性骨髓瘤的还另外的剂包括Bcr-Abl、Flt-3、RAF和 FAK激酶抑制剂。相加或协同效应是本发明的化合物与另外的药剂组合的预 期结果。此外，多发性骨髓瘤细胞对药剂例如地塞米松的抵抗性可以在用本 发明的化合物治疗时逆转。所述药剂可与JAK抑制剂以单一或连续的剂型组 合，或所述药剂可以作为单独剂型同时地或顺序地施用。

在一些实施方案中，皮质类固醇例如地塞米松与至少一种JAK抑制剂组 合施用至患者，其中间歇地而非连续地施用地塞米松。

在一些另外的实施方案中，可以将一种或多种化合物与其它治疗剂的组 合在骨髓移植或干细胞移植之前、期间和/或之后施用至患者。

药物制剂和剂型

当用作药物时，本文描述的化合物可以药物组合物的形式施用。这些组 合物可以制药领域中熟知的方式来制备，且可以通过各种途径来施用，这取 决于期望局部治疗还是全身治疗且取决于待治疗的区域。施用可以是局部的 (包括透皮、表皮、眼和至粘膜，包括鼻内、阴道和直肠递送)、肺(例如，通 过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内或鼻内)、口服或胃肠 外。在一些实施方案中，组合物适合于口服施用。胃肠外施用包括静脉内、 动脉内、皮下、腹膜内、肌肉内注射或输注；或颅内，例如，鞘内或心室内 施用。胃肠外施用可以单一大剂量的形式，或可以例如通过连续灌注泵。用 于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝 胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体，含水的、粉末或油 质碱、增稠剂以及类似物可以是必需的或期望的。涂层避孕套、手套以及类 似物也可能是是有用的。

本发明还包括包含与一种或多种药学上可接受的载体(赋形剂)组合的作 为活性成分的本文描述的化合物中的一种或多种的药物组合物。在制备本发 明的组合物中，活性成分通常与赋形剂混合，通过赋形剂稀释或以例如胶囊、 小袋、纸或其它容器的形式包装在这样的载体内。当赋形剂用作稀释剂时， 其可以是固体、半固体或液体材料，充当活性成分的媒介物、载体或介质。 因此，组合物可以片剂、丸剂、粉末、锭剂、小袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、 乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或以液体介质)、包含例如高达按重量 计10％的活性化合物的软膏、软胶囊和硬胶囊、栓剂、无菌可注射溶液和无 菌包装粉末的形式。

在制备制剂中，在与其它成分组合之前，活性化合物可以被碾磨以提供 适当的粒度。如果活性化合物是基本上不溶的，那么其可以被碾磨至小于200 目的粒度。如果活性化合物是基本上水溶性的，那么粒度可以通过碾磨来调 节，以在制剂中提供基本上均一的分布，例如约40目。

活性成分可以使用已知的碾磨工序例如湿磨法来碾磨以获得适合于片剂 形成和适合于其它制剂类型的粒度。活性成分的细分散(纳米微粒)制剂可以通 过本领域已知的方法来制备，例如参见国际专利申请No.WO 2002/000196。

一些合适的赋形剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖 醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶 纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂可以另外 包括：润滑剂如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐 剂，例如苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和调味剂。可通过使用本 领域已知的工序来配制本发明的组合物，以便在施用至患者之后提供活性成 分的快速释放、持续释放或延迟释放。

所述组合物可配制为单位剂型，各剂量包含约5至约1000mg(1g)，更 通常约100至约500mg的活性成分。术语“单位剂型”是指适合作为人受试 者和其它哺乳动物的单一剂量的物理上分立的单位，每一个单位包含与合适 的药物赋形剂结合的经计算为产生所需的治疗效果的预定量的活性材料。

在一些实施方案中，本发明的组合物包含约5mg至约50mg的活性成分。 本领域普通技术人员应明白，这包括包含约5mg至约10mg、约10mg至约 15mg、约15mg至约20mg、约20mg至约25mg、约25mg至约30mg、 约30mg至约35mg、约35mg至约40mg、约40mg至约45mg或约45mg 至约50mg的活性成分的化合物或组合物。

在一些实施方案中，本发明的组合物包含约50mg至约500mg的活性成 分。本领域普通技术人员应明白，这包括包含约50mg至约100mg、约100mg 至约150mg、约150mg至约200mg、约200mg至约250mg、约250mg至 约300mg、约350mg至约400mg或约450mg至约500mg的活性成分的化 合物或组合物。

在一些实施方案中，本发明的组合物包含约500mg至约1,000mg的活 性成分。本领域普通技术人员应明白，这包括包含约500mg至约550mg、 约550mg至约600mg、约600mg至约650mg、约650mg至约700mg、约 700mg至约750mg、约750mg至约800mg、约800mg至约850mg、约850 mg至约900mg、约900mg至约950mg或约950mg至约1,000mg的活性成 分的化合物或组合物。

活性化合物可以在宽剂量范围内有效且通常以药学有效量被施用。然而， 应理解，实际上施用的化合物的量将通常由医师根据相关的情况来确定，包 括待治疗的病状、所选择的施用途径、施用的实际化合物、个体患者的年龄、 体重和反应、患者的症状的严重程度等。

为制备固体组合物例如片剂，将主要的活性成分与药物赋形剂混合以形 成包含均一的本发明化合物混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组 合物称为均一的时，活性成分通常均匀地分散在整个组合物中，使得该组合 物可以容易地细分成同样有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊。然后将 该固体预配制剂细分成包含例如约0.1至约1000mg的本发明活性成分的上 述类型的单位剂型。

本发明的片剂或丸剂可以被包衣或以其它方式配混，以提供赋予延长作 用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量组分，后者是 以在前者上的包层的形式。两种组分可以被肠溶层分离，肠溶层用来抵抗在 胃中的崩解并允许内组分完整地进入十二指肠或延迟释放。许多材料可以用 于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括许多聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、 鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的混合物。

可掺入化合物和组合物以供口服或注射施用的液体形式包括水溶液、适 当调味的糖浆剂、水悬浮液或油悬浮液，以及含有食用油例如棉籽油、芝麻 油、椰子油或花生油以及酏剂和类似药物媒介物的调味乳液。

用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的水溶剂或有机溶剂或其 混合物中的溶液和悬浮液以及粉末。液体或固体组合物可以包含如上所述的 合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过口服或鼻呼 吸途径施用，用于获得局部或全身效应。组合物可以通过使用惰性气体来雾 化。雾化溶液可以直接从喷雾装置中呼吸，或喷雾装置可以附接于面罩帐篷 或间歇性正压呼吸机器。溶液、悬浮液或粉末组合物可以口服施用或从以适 当方式递送制剂的装置通过鼻施用。

施用至患者的化合物或组合物的量将根据所施用的药物、施用目的例如 预防或治疗、患者的状态、施用方式等而改变。在治疗应用中，可以足以治 愈或至少部分地控制疾病和其并发症的症状的量将组合物施用至已经罹患疾 病的患者。有效的剂量将取决于待治疗的疾病病状以及主治临床医师根据诸 如疾病的严重程度、患者的年龄、体重和一般状态等因素的判断。

施用至患者的组合物可为上述药物组合物的形式。这些组合物可以通过 常规灭菌技术来灭菌，或可以进行无菌过滤。水溶液可以原样包装使用或被 冻干，冻干制剂在施用之前与无菌水性载体组合。化合物制剂的pH将通常 介于3和11之间，更优选地从5至9且最优选地从7至8。应理解，前述赋 形剂、载体或稳定剂中的某些的使用将导致药物盐的形成。

化合物的治疗剂量可以根据例如用于治疗的特定用途、化合物的施用方 式、患者的健康和状态以及处方医师的判断而变化。化合物在药物组合物中 的比例或浓度可以根据包括剂量、化学特性(例如，疏水性)和施用途径在内的 许多因素而变化，因素。例如，化合物可以在包含约0.1至约10％w/v的化 合物的生理缓冲水溶液中提供，用于胃肠外施用。一些典型的剂量范围是约 1μg/kg至约1g/kg体重/天。在一些实施方案中，剂量范围是约0.01mg/kg至 约100mg/kg体重/天。剂量可能取决于诸如以下的变量：疾病或病症的类型 和进展程度、特定患者的总体健康状态、所选择的化合物的相对生物效力、 赋形剂的配方以及其施用途径。有效的剂量可以从源自体外或动物模型测试 系统的剂量响应曲线外推。

本发明的组合物还可以包括一种或多种另外的药剂，例如化疗剂、类固 醇、抗炎化合物或免疫抑制剂，它们的实例在上文列出。

在一些实施方案中，化合物或其药学上可接受的盐作为眼用组合物施用。 因此，在一些实施方案中，方法包括施用化合物或其药学上可接受的盐和眼 科上可接受的载体。在一些实施方案中，眼用组合物是液体组合物、半固体 组合物、插入剂、膜、微粒或纳米微粒。

在一些实施方案中，眼用组合物是液体组合物。在一些实施方案中，眼 用组合物是半固体组合物。在一些实施方案中，眼用组合物是局部用组合物。 局部用组合物包括但不限于液体和半固体组合物。在一些实施方案中，眼用 组合物是局部用组合物。在一些实施方案中，局部用组合物包括水溶液、水 性悬浮液、软膏或凝胶。在一些实施方案中，眼用组合物局部施用于眼睛前 面、上眼睑下方、下眼睑上和在盲囊(cul-de-sac)中。在一些实施方案中，眼 用组合物是灭菌的。灭菌可以在准备使用时通过已知的技术例如溶液的灭菌 过滤或通过加热安瓿中的溶液来完成。本发明的眼用组合物还可以包含适合 于眼用制剂的制备的药物赋形剂。这样的赋形剂的实例是防腐剂、缓冲剂、 螯合剂、抗氧化剂和用于调节渗透压的盐。

如本文使用，术语“眼科上可接受的载体”是指可以容纳和释放化合物或 其药学上可接受的盐且与眼睛可相容的任何材料。在一些实施方案中，眼科 上可接受的载体是水或水溶液或悬浮液，但还包括油，例如用于制备软膏的 那些和例如用于眼用插入剂中的聚合物基质。在一些实施方案中，组合物可 以是包括化合物或其药学上可接受的盐的水悬浮液。液体眼用组合物，包括 软膏和悬浮液两者，可以具有适合于所选择的施用途径的粘度。在一些实施 方案中，眼用组合物具有在约1,000至约30,000厘泊范围内的粘度。

在一些实施方案中，眼用组合物还可以包括以下中的一种或多种：表面 活性剂、佐剂、缓冲剂、抗氧化剂、张力调节剂、防腐剂(例如，EDTA、BAK(苯 扎氯铵)、亚氯酸钠、过硼酸钠、聚季铵盐-1)、增稠剂或粘度调节剂(例如， 羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、乙二醇400、丙二醇 羟甲基纤维素、羟丙基-瓜尔胶、透明质酸和羟丙基纤维素)以及类似物。制剂 中的添加剂可以包括但不限于氯化钠、碳酸氢钠、山梨酸、尼泊金甲酯、对 羟基苯甲酸甲酯、氯己定、蓖麻油和过硼酸钠。

水性眼用组合物(溶液或悬浮液)通常并不包含生理学上或眼科上有害的 成分。在一些实施方案中，将纯水或去离子水用于组合物中。pH可以通过加 入任何生理学上和眼科上可接受的pH调节酸、碱或缓冲剂来调节至在约5.0 至8.5范围内。眼科上可接受的酸的实例包括乙酸、硼酸、乳酸、磷酸、盐 酸以及类似物，且碱的实例包括氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙 酸钠、乳酸钠、氨基丁三醇、三羟甲基氨基甲烷以及类似物。盐和缓冲剂包 括柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠、氯化铵和前述酸和碱的混合物。

在一些实施方案中，所述方法涉及形成或供应与眼睛的外表面接触的治 疗剂的贮库(depot)。贮库是指不会被泪液或其它眼睛清除机制迅速除去的 治疗剂的供给源。这允许通过单一应用在眼睛的外表面上的流体中存在连续 持久的高浓度治疗剂。不希望受任何理论束缚，据信吸收和渗透可能取决于 溶解的药物浓度以及外部组织与包含药物的流体的接触持续时间两者。当通 过清除眼用流体和/或吸收到眼睛组织中除去药物时，更多的药物从贮库提供 (例如溶解)到补充的眼用流体中。因此，贮库的使用可以更容易地促更难 溶的治疗剂施加到眼组织中。在一些实施方案中，贮库可以保留高达八个小 时或更久。在一些实施方案中，眼用贮库形式包括但不限于水性聚合物悬浮 液、软膏和固体插入剂。

在一些实施方案中，眼用组合物是软膏或凝胶。在一些实施方案中，眼 用组合物是油型递送媒介物。在一些实施方案中，组合物包括其中添加了活 性成分(通常以0.1％至2％)和赋形剂的石油或羊毛脂基质。常见基质可包 括但不限于矿物油、矿脂及其组合。在一些实施方案中，软膏以带的形式施 用到下眼睑上。

在一些实施方案中，眼用组合物是眼用插入剂。在一些实施方案中，眼 用插入剂是生物学惰性的、柔软的、生物可侵蚀的、粘弹性的、在暴露于治 疗剂之后对灭菌稳定的，抵抗来自空气传播细菌的感染、具有生物可侵蚀性、 生物相容性和/或粘弹性。在一些实施方案中，插入剂包括眼科上可接受的基 质，例如聚合物基质。基质通常是聚合物，且治疗剂通常分散在其中或结合 至聚合物基质。在一些实施方案中，治疗剂可以通过溶解或共价键的水解从 基质缓慢地释放。在一些实施方案中，聚合物是生物可侵蚀的(可溶的)，且其 溶解速率可以控制分散在其中的治疗剂的释放速率。在另一形式中，聚合物 基质是生物可降解的聚合物，其例如通过水解分解以由此释放结合至其或分 散在其中的治疗剂。在另外的实施方案中，基质和治疗剂可以被另外的聚合 物包覆层围绕以进一步控制释放。在一些实施方案中，插入剂包括生物可降 解的聚合物，例如聚己酸内酯(PCL)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚氰基 丙烯酸烷基酯、聚氨酯、尼龙或聚(dl-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)或这些中 的任何的共聚物。在一些实施方案中，治疗剂分散到基质材料中或分散到聚 合之前的用于制备基质材料的单体组合物中。在一些实施方案中，治疗剂的 量是约0.1％至约50％或约2％至约20％。在另外的实施方案中，使用生物可 降解的或生物可侵蚀的聚合物基质，使得不必除去用过的插入剂。当生物可 降解的或生物可侵蚀的聚合物降解或溶解时，治疗剂被释放。

在另外的实施方案中，眼用插入剂包括聚合物，包括但不限于在Wagh 等人，“Polymers used in ocular dosage form and drug delivery systems(用于眼用 剂型和药物递送系统的聚合物)”，Asian J.Pharm.，第12-17页(2008年1月)中 所描述的那些，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，插入剂包括 选自以下的聚合物：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物 或共聚物(例如，来自Rohm或Degussa的Eudragit的聚合物家族)、羟甲基 纤维素、聚丙烯酸、聚(酰胺-胺)树状高分子、聚(二甲基硅氧烷)、聚氧化乙烯、 聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇)或聚(富 马酸丙二醇酯)。在一些实施方案中，插入剂包括GelfoamR。在一些实施 方案中，插入剂是450kDa聚丙烯酸-半胱氨酸缀合物。

在一些实施方案中，眼用组合物是眼用膜。适合于此类膜的聚合物包括 但不限于Wagh等人(如上)中所描述的那些。在一些实施方案中，膜是软质隐 形眼镜，例如由与二甲基丙烯酸乙二醇酯交联的N，N-二乙基丙烯酰胺和甲基 丙烯酸的共聚物制成的软质隐形眼镜。

在一些实施方案中，眼用组合物包括微球或纳米微粒。在一些实施方案 中，微球包括明胶。在一些实施方案中，微球被注射至眼睛的后段、脉络间 隙中、巩膜中、玻璃体内或视网膜下。在一些实施方案中，微球或纳米微粒 包括聚合物，包括但不限于Wagh等人(如上)中所描述的那些，其通过引用整 体并入本文。在一些实施方案中，聚合物是壳聚糖、聚羧酸例如聚丙烯酸、 白蛋白微粒、透明质酸酯、聚衣康酸、聚(丁基)氰基丙烯酸酯、聚己酸内酯、 聚(异丁基)己内酯、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)或聚(乳酸)。在一些实施方案中，微 球或纳米微粒包括固体脂质微粒。

在一些实施方案中，眼用组合物包括离子交换树脂。在一些实施方案中， 离子交换树脂是无机沸石或合成的有机树脂。在一些实施方案中，离子交换 树脂包括但不限于Wagh等人(如上)中所描述的那些，其通过引用整体并入本 文。在一些实施方案中，离子交换树脂是部分中和的聚丙烯酸。

在一些实施方案中，眼用组合物是水性聚合物悬浮液。在一些实施方案 中，治疗剂或聚合物悬浮剂悬浮在水介质中。在一些实施方案中，含水的聚 合物悬浮液可以被配制成使得它们在眼睛中保持与其在施用至眼睛之前所具 有的粘度相同的或基本上相同的粘度。在一些实施方案中，它们可以被配制 成使得在接触泪液时凝胶化增加。

标记化合物和测定方法

本发明的另一个方面涉及本文描述的某些化合物的标记型式(放射性标 记的、荧光标记的等)，其不仅可用于成像技术，而且还可用于体外和体内测 定两者，用于定位和定量包括人的组织样品中的JAK，和通过抑制标记化合 物的结合来鉴定JAK配体。因此，本发明包括包含这样的标记化合物的JAK 测定。

本发明还包括同位素标记化合物。“同位素标记”或“放射性标记”的化合 物是其中一个或多个原子被具有与通常在自然界中发现的(即，天然存在的) 原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子置换或取代的本文描述的 化合物。可以结合在本文描述的化合物中的合适的放射性核素包括但不限于 ²H(又写为D，氘)、³H(又写为T，氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、 ¹⁸O、¹⁸F、³⁵S、³⁶Cl、⁸²Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I。掺入本发 明放射性标记化合物中的放射性核素将取决于该放射性标记化合物的具体应 用。例如，对于体外金属蛋白酶标记和竞争测定，掺入³H、¹⁴C、⁸²Br、¹²⁵I、 ¹³¹I、³⁵S或的化合物通常会最有用。对于放射成像应用，¹¹C、¹⁸F、¹²⁵I、¹²³I、 ¹²⁴I、¹³¹I、⁷⁵Br、⁷⁶Br或⁷⁷Br通常会最有用。

应理解，“放射性标记”或“标记化合物”是掺入至少一种放射性核素的化 合物。在一些实施方案中，放射性核素选自由³H、¹⁴C、¹²⁵I、³⁵S和⁸²Br组成 的组。

本发明还可以包括用于将放射性同位素掺入本文描述的化合物中的合成 方法。用于将放射性同位素掺入有机化合物中的合成方法是本领域熟知的， 且本领域普通技术人员将容易地识别适用于本文描述的化合物的方法。

本发明的标记化合物可以用于筛选测定以鉴定/评估化合物。例如，可以 通过追踪标记监测其与JAK接触时的浓度变化来评估标记的新合成的或鉴定 的化合物(即，测试化合物)结合JAK的能力。例如，可以评估测试化合物(标 记的)减少已知结合JAK的另一种化合物(即，标准化合物)的结合的能力。因 此，测试化合物与标准化合物竞争结合JAK的能力直接与其结合亲和力相关 联。相反地，在一些其它筛选测定中，标准化合物是经标记的，而测试化合 物是未标记的。因此，监测标记的标准化合物的浓度以评估在标准化合物和 测试化合物之间的竞争，并由此确定测试化合物的相对结合亲和力。

试剂盒

本发明还包括可用于例如治疗或预防JAK相关的疾病或病症例如癌症的 药物试剂盒，其包括容纳包含治疗有效量的活性化合物的药物组合物的一个 或多个容器。如果需要的话，这样的试剂盒还可以包括各种常规的药物试剂 盒部件中的一个或多个，例如，诸如具有一种或多种药学上可接受的载体的 容器、其它容器等，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。试剂盒中也 可包括用作插页或标签的说明书，指示施用组分的量、施用指南和/或组分混 合指南。

将通过具体实施例更详细地描述本发明。以下实施例为了说明的目而提 供，且并不意图以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到， 可以改变或修改各种非关键的参数以产生基本上相同的结果。

实施例

实施例1：(R)-3-环戊基-3-[4-(2-羟基-5-氧代-6，7-二氢-5H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈

步骤1.(R)-3-环戊基-3-[4-(2-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑 -1-基]丙腈

将4-氯-2-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.4g，2.18mmol，Toronto  Research Chemicals)和(R)-3-环戊基-3-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二杂氧戊硼烷 -2-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(0.824g，2.61mmol，如Org.Lett.，2009，11(9)， 1999-2002中所描述的制备)溶解在1，4-二噁烷(4mL)中，并加入水(2mL)中的 碳酸钾(0.903g，6.54mmol)。将混合物脱气并加入四(三苯膦)钯(0)(0.126g， 0.109mmol)。将反应混合物加热至100℃，持续16h。将反应混合物在水和 乙酸乙酯之间分配。水层用乙酸乙酯萃取三次。将合并的萃取物经硫酸钠干 燥、倾析和浓缩。用快速柱色谱法(用二氯甲烷中的0-10％MeOH的梯度洗 脱)纯化产物(670mg，91％)。¹H NMR(300MHz，CD₃OD)：δ8.59(s，1H)，8.35 (s，1H)，7.24(d，1H)，6.81(d，1H)，4.47(dt，1H)，4.04(s，3H)，3.21(dd，1H)，3.10 (dd，1H)，2.62-2.44(m，1H)，2.02-1.86(m，1H)，1.81-1.20(m，7H)；LCMS (M+H)⁺：337.0。

步骤2.(R)-3-环戊基-3-[4-(5-碘-2-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H- 吡唑-1-基]丙腈

向3-环戊基-3-[4-(2-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙 腈(0.532g，1.58mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液加入N-碘代琥珀酰亚胺(0.36g， 1.6mmol)。将反应物搅拌30min并在真空下除去溶剂。残留物通过快速柱色 谱法(用己烷中的0-65％乙酸乙酯的梯度洗脱)纯化以得到黄色固体(250mg， 34％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ10.31(br s，1H)，8.27(s，1H)，8.23(s，1H)， 7.29(s，1H)，4.34-4.21(m，1H)，4.06(s，3H)，3.14(dd，1H)，3.03-2.90(m，1H)， 2.66-2.49(m，1H)，2.02-1.17(m，8H)；LCMS(M+H)⁺：463.0。

步骤3.(R)-4-[1-(2-氰基-1-环戊基乙基)-1H-吡唑-4-基]-2-甲氧基-7H-吡咯 并[2，3-d]嘧啶-5-基乙酸酯

将3-环戊基-3-[4-(5-碘-2-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1- 基]丙腈(0.25g，0.54mmol)的乙酸(3mL)溶液用醋酸银(0.27g，1.6mmol)处理 并加热至70℃，持续16h。将混合物过滤，用MeCN冲洗，将水加入到滤液 中并将该混合物搅拌20min。将固体氯化钠加入到该溶液。通过用三份乙酸 乙酯萃取该含水混合物来获得产物。将合并的萃取物经硫酸钠干燥、倾析和 浓缩。产物的一部分未经进一步纯化便用于水解步骤(步骤4)。¹H NMR(300 MHz，CDCl₃)：δ9.87(br s，1H)，8.39(s，1H)，8.37(s，1H)，7.33(s，1H)，4.22(dt， 1H)，4.06(s，3H)，3.14(dd，1H)，2.94(dd，1H)，2.64-2.47(m，1H)，2.36(s，3H)， 2.03-1.86(m，1H)，1.79-1.12(m，7H)；LCMS(M+H)⁺：395.1。

步骤4.(R)-3-环戊基-3-[4-(2-羟基-5-氧代-6，7-二氢-5H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 -4-基)-1H-吡唑-1-基]丙酰胺

将乙酸(2mL，8mmol)中的4M HBr加入到4-[1-(2-氰基-1-环戊基乙 基)-1H-吡唑-4-基]-2-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基乙酸酯(0.050g，0.13 mmol)，并将反应物搅拌1h。在真空下除去挥发物。将残留物复水，且用制 备型HPLC-MS(用包含0.15％NH₄OH的MeCN/H₂O梯度洗脱)得到纯化产物 (12mg，26％)。¹H NMR(500MHz，d₆-DMSO)：δ9.20(s，1H)，8.69(s，1H)，7.34(s， 1H)，6.75(s，1H)，4.49(dt，1H)，3.89(s，2H)，2.80(dd，1H)，2.64(dd，1H)， 2.36-2.26(m，1H)，1.83-1.74(m，1H)，1.63-1.36(m，4H)，1.32-1.20(m，2H)， 1.15-1.05(m，1H)；LCMS(M+H)⁺：357.0。

步骤5.(R)-3-环戊基-3-[4-(2-羟基-5-氧代-6，7-二氢-5H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 -4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈

向3-环戊基-3-[4-(2-羟基-5-氧代-6，7-二氢-5H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4- 基)-1H-吡唑-1-基]丙酰胺(0.006g，0.02mmol)的包含三乙胺(20TL，0.2mmol) 的二氯甲烷(0.5mL)溶液加入三氯乙酰氯(20TL，0.2mmol)。当反应完成时， 用制备型HPLC-MS(包含0.15％NH₄OH的MeCN/H₂O)得到纯化产物(3mg， 52％)。¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO)：δ11.39(br s，1H)，9.37(s，1H)，8.77(s， 1H)，8.63(s，1H)，4.68-4.59(m，1H)，3.94(s，2H)，3.19-3.15(m，2H)，2.42-2.30 (m，1H)，1.86-1.75(m，1H)，1.69-1.20(m，6H)，1.18-1.05(m，1H)；LCMS (M+H)⁺：339.1。

实施例2：(3R)-3-[(1R，2R)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4- 基)-1H-吡唑-1-基]丙腈和(3S)-3-[(1R，2R)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈以及(3R)-3-[(1S，2S)-2-羟基环戊 基]-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈和(3S)-3-[(1S，2S)-2- 羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈

步骤1.(1S，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊烷甲酸乙酯和 (1R，2S)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊烷甲酸乙酯

向叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(0.524g，3.48mmol)和1H-咪唑(0.473g， 6.95mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(15mL)溶液加入顺式-2-羟基-1-环戊烷甲酸 乙酯(外消旋的，Acros)(0.50g，0.0032mol)。将反应物搅拌16h。将另外的咪 唑(0.40g，5.8mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(0.50g，3.3mmol)分批添 加，并将反应物搅拌另外的24h。产物用己烷萃取。将萃取物用水洗涤，经 硫酸钠干燥，过滤和蒸发以得到外消旋的TBS保护的羟基酯(0.9g)，其未经 进一步纯化即使用。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ4.46(ddd，1H)，4.19(dq，1H)， 4.01(dq，1H)，2.72(dt，1H)，2.22-2.11(m，1H)，1.96-1.49(m，5H)，1.26(t，3H)， 0.84(s，9H)，0.03(s，3H)，0.01(s，3H)。

步骤2.(1S，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊基甲醛和(1R，2S)-2-(叔丁 基二甲基甲硅氧基)环戊基甲醛

在-78℃下，向来自步骤1的(1S，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊烷甲 酸乙酯和(1R，2S)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊烷甲酸乙酯(0.86g，3.2mmol) 的己烷(40mL)溶液滴加1.0M二异丁基氢化铝的甲苯(3.5mL，3.5mmol)溶 液。将反应混合物在-78℃下搅拌1h并通过滴加甲醇(2mL)淬灭该温度。停 止冷却并使混合物达到环境温度。加入罗谢尔盐水溶液。将两相混合物用力 搅拌2h并分离所得到的层。水层用己烷萃取一次，然后用三部分乙酸乙酯 萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，倾析和浓缩以得到外消 旋的醛产物(0.7g，97％)，其未经进一步纯化即使用。¹H NMR(400MHz， CDCl₃)：δ9.74(d，1H)，4.62(ddd，1H)，2.68-2.61(m，1H)，2.22-2.11(m，1H)， 1.95-1.83(m，1H)，1.80-1.57(m，4H)，0.85(s，9H)，0.05(s，3H)，0.04(s，3H)。

步骤3.(E)-3-((1R，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基}环戊基)丙烯腈和 (Z)-3-((1R，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基}环戊基)丙烯腈以及 (E)-3-((1S，2S)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基}环戊基)丙烯腈和(Z)-3-((1S，2S)-2-(叔 丁基二甲基甲硅氧基}环戊基)丙烯腈

向(1S，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊基甲醛和(1R，2S)-2-(叔丁基二 甲基甲硅氧基)环戊基甲醛(0.36g，1.6mmol，来自步骤2)的甲苯(9mL)溶液加 入(三苯基膦)乙腈(0.475g，1.58mmol)，并将反应物加热至80℃，持续2h。 将反应物冷却至室温并加入水。产物用三份乙醚萃取。将萃取物用盐水洗涤， 经硫酸钠干燥，倾析和浓缩以得到E-烯烃同分异构体和Z-烯烃同分异构体的 外消旋混合物，其未经进一步纯化即使用。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ6.82 (dd，1H，反式烯烃)，6.63(dd，1H，顺式烯烃)，5.307(dd，1H，反式烯烃)，5.305 (dd，1H，顺式烯烃)，4.24(ddd，1H)，4.20(ddd，1H)，2.96-2.86(m，1H)，2.53-2.43 (m，1H)，1.95-1.56(m，12H)，0.87(s，9H)，0.86(s，9H)，0.04-0.01(单峰，一共 12H)。

步骤4.(3R)-3-[(1R，2R)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4- 基)-1H-吡唑-1-基]丙腈和(3S)-3-[(1R，2R)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈以及(3R)-3-[(1S，2S)-2-羟基环戊 基]-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈和(3S)-3-[(1S，2S)-2- 羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈

向(E)-3-((1R，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊基)丙烯腈和 (Z)-3-((1R，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊基)丙烯腈以及 (E)-3-((1S，2S)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊基)丙烯腈和(Z)-3-((1S，2S)-2-(叔 丁基二甲基甲硅氧基)环戊基)丙烯腈(0.40g，1.6mmol，来自步骤3的粗产物) 的乙腈(20mL)溶液加入4-(1H-吡唑-4-基)-7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲 基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.50g，1.6mmol)和1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7- 烯(DBU，0.24mL，1.6mmol)。将反应物在室温搅拌2h，并加入另外的 DBU(0.24mL，1.6mmol)。将反应物搅拌3天并浓缩。快速柱色谱法(用10-40％ 乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱)用于纯化产物，产物然后用DCM中的20％TFA 处理3h，蒸发并用过量的乙二胺的甲醇溶液处理过夜。当SEM保护基的除 去完成时，通过用EtOH/H₂O/浓HCl(10∶4∶3体积比)搅拌3小时来除去任 何剩下的TBS保护基。完全脱保护的产物通过制备型HPLC-MS(MeCN/H₂O 梯度中的0.15％NH₄OH)来纯化。汇集M+H＝323的所有级分中并蒸发(约80 mg)。使产物经历如下一系列手性色谱纯化：用20％EtOH/80％己烷以25 mL/min的流速洗脱的Chiral Technologies Chiralcel OJ-H(3×25cm，5Tm)以得 到峰1(19mg)，不被收集的以下次峰：峰2(60mg)、峰3(6mg)。峰2是混合 物，其然后使用70％EtOH/30％己烷的梯度以8mL/min的流速洗脱的Chiral  Technologies Chiralpak IA(2×25cm，5Tm)进一步分离为三种组分。这些是标 记的峰2-1(试验2，峰1，32mg)，其是产物混合物；峰2-2(6.5mg)和峰2-3(13.7 mg)。峰2-1使用25％EtOH/75％己烷的梯度以12mL/min的流速洗脱的Chiral  Technologies Chiralpak IA(2×25cm，5Tm)进一步分离为三种组分。分离的产 物是标记的峰2-1-1(10.5mg)；2-1-2(13mg)；和2-1-3(2.3mg)。

峰1：¹H NMR(500MHz，CD₃OD)：δ8.65(s，1H)，8.62(s，1H)，8.37(s，1H)， 7.49(d，1H)，6.95(d，1H)，4.71(ddd，1H)，4.28(br t，1H)，3.26(dd，1H)，3.21(dd， 1H)，2.53-2.45(m，1H)，1.98-1.73(m，3H)，1.62-1.47(m，2H)，1.38-1.29(m，1H)； LCMS(M+H)⁺：323。

峰2-1-1：¹H NMR(300MHz，CD₃OD)：δ8.64(s，1H)，8.59(s，1H)，8.38(s， 1H)，7.49(d，1H)，6.94(d，1H)，4.90-4.78(m，1H)，3.64(br t，1H)，3.21(dd，1H)， 3.07(dd，1H)，2.55-2.40(m，1H)，2.01-1.58(m，6H)；LCMS(M+H)⁺：323。

峰2-1-2：¹H NMR(500MHz，CD₃OD)：δ8.65(s，1H)，8.62(s，1H)，8.37(s， 1H)，7.49(d，1H)，6.95(d，1H)，4.71(ddd，1H)，4.28(br t，1H)，3.26(dd，1H)，3.21 (dd，1H)，2.53-2.45(m，1H)，1.98-1.73(m，3H)，1.62-1.48(m，2H)，1.38-1.26(m， 1H)；LCMS(M+H)⁺：323。

峰2-3：¹H NMR(300MHz，CD₃OD)：δ8.64(s，1H)，8.59(s，1H)，8.38(s， 1H)，7.48(d，1H)，6.93(d，1H)，4.90-4.78(m，1H)，3.64(br t，1H)，3.21(dd，1H)， 3.07(dd，1H)，2.55-2.40(m，1H)，2.01-1.58(m，6H)；LCMS(M+H)⁺：323。

实施例3：外消旋的3-(1-羟基环戊基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4- 基)-1H-吡唑-1-基]丙腈三氟乙酸盐

步骤1.1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]环戊基甲醛

反应以与Tetrahedron，50(9)，2821-30；1994中所描述的工序相似的工序 进行：在-45℃下，向1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]环戊腈(2.25g，12.3mmol，如 在Organometallics，3(11)，1660-5；1984所描述的制备)的甲苯(18mL)溶液滴加 己烷(17.2mL，17.2mmol)中的1.0M二异丁基氢化铝。然后使溶液升温至0 ℃并在该温度搅拌1h。将反应混合物倒入乙醚(25mL)和氯化铵(25mL，饱和 的)的混合物中。在15℃下，向所得到的混合物加入稀硫酸溶液(通过用50mL 水稀释1.53mL浓H₂SO₄来制备)。然后将溶液在5℃的温度下搅拌过夜。混 合物用三份乙醚来萃取，将合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，倾析 和浓缩以得到产物(0.84g，36％)，其未经进一步纯化即用于步骤2。¹H NMR (300MHz，CDCl₃)：δ9.47(s，1H)，1.88-1.46(m，8H)，0.00(s，9H)。

步骤2.(2E)-3-{1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]环戊基}丙烯腈和(2Z)-3-{1-[(三 甲基甲硅烷基)氧基]环戊基}丙烯腈

在0℃下将氰基甲基膦酸二乙酯(0.912mL，5.64mmol)滴加到氢化钠 (0.198g，4.96mmol)的四氢呋喃(10mL)悬浮液中。加入之后，将反应物升温 至室温并搅拌45分钟。将混合物再冷却至0℃并引入四氢呋喃(20mL)中的 1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]环戊基甲醛(0.84g，4.5mmol)。使反应物升温至室温 并搅拌2小时。将水和乙酸乙酯加入反应物中，并分离层。水层用两份乙酸 乙酯萃取。将组合的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，倾析和浓缩以 得到呈烯烃同分异构体混合物的产物，该产物未经进一步纯化即用于步骤3。 ¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ6.80(d，1H，反式/主要产物)，6.53(d，1H，顺式/ 次要产物)，5.52(d，1H，反式)，5.28(d，1H，顺式)，2.06-0.76(m，对于两种同分 异构体总共16H)，0.18(s，9H，次要产物)，0.13(s，9H，主要产物)。

步骤3.外消旋的3-(1-羟基环戊基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基) 甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈

向(2E)-3-{1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]环戊基}丙烯腈和(2Z)-3-{1-[(三甲基 甲硅烷基)氧基]环戊基}丙烯腈(0.94g，4.5mmol)以及4-(1H-吡唑-4- 基)-7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(1.4g，4.5 mmol)的乙腈(20mL)悬浮液加入1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.67mL， 4.5mmol)。将反应物在室温下搅拌6天。蒸发乙腈。使用己烷中的0-80％乙 酸乙酯的梯度洗脱的快速柱色谱法从未受保护的醇和TMS保护的醇产物的 混合物分离所需的不受保护的醇产物(890mg，44％)。¹H NMR(300MHz， CDCl₃)：δ8.87(s，1H)，8.56(br s，1H)，8.35(s，1H)，7.46(d，1H)，6.84(d，1H)， 5.69(s，2H)，4.40(dd，1H)，4.03(s，1H)，3.55(dd，2H)，3.46(dd，1H)，2.97(dd， 1H)，2.04-1.27(m，8H)，0.93(dd，2H)，-0.05(s，9H)；LCMS(M+H)⁺：453.1。

步骤4.外消旋的3-(1-羟基环戊基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H- 吡唑-1-基]丙腈三氟乙酸盐

将外消旋的3-(1-羟基环戊基)-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲 基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(0.100g，0.221mmol)的二 氯甲烷(4mL)和三氟乙酸(1mL)溶液搅拌2小时并蒸发溶剂。将残留物用甲醇 (4.5mL)中的乙二胺(0.1mL，2mmol)搅拌1小时并蒸发。将粗产物在甲醇中复 水，并使用制备型HPLC-MS，通过两个连续的色谱步骤(对于第一操作，用 包含0.15％NH₄OH的乙腈/H₂O梯度洗脱，随后对于第二操作，用包含0.1％ TFA的乙腈/H₂O梯度洗脱)来纯化，得到呈三氟乙酸盐的外消旋产物。¹H NMR (400MHz，d₆-dmso)：δ12.72(br s，1H)，8.94(s，1H)，8.86(s，1H)，8.49(s，1H)， 7.82(s，1H)，7.21(s，1H)，4.80(dd，1H)，3.51(dd，1H)，3.22(dd，1H)，1.79-1.42 (m，7H)，1.25-1.15(m，1H)；LCMS(M+H)⁺：323.1。

实施例A

在药代动力学和毒物动力学研究方面，在施用化合物I之后，从人、大 鼠或狗的尿、血浆或粪便分离代谢物1-39。代谢物的种类在分离代谢物之后 使用HPLC方法来确定。表2中展示了所用方法和相应的代谢物保留时间。 根据阐明结构信息的需要，进行串联MS/MS分析和高阶MSⁿ实验。

化合物I证实在m/z 307处的质子化分子离子，且产物离子光谱在m/z 266、186和159处显示出信号。m/z 266处的碎片离子与腈部分的丢失一致。 m/z 186处的特征碎片离子指示完整环戊基丙腈部分的丢失。m/z 159处的碎 片离子指示环戊基丙腈的丢失以及通过化合物I的吡唑环的开裂。

主要在来自人受试者的尿中观察到代谢物化合物1、2、27和29，且在 血浆中观察到痕量水平的化合物27和29。全扫描质谱法证实m/z 339处的质 子化分子离子，与化合物I的双羟基化一致。对于这些代谢物，这些m/z 339 离子的产物离子碎裂产生实际上相同的光谱，具有在m/z 321、186、159和 154处观察到的离子。m/z 321处的离子与失水一致且表明至少一种羟基化可 以在环戊基环上。m/z 186和m/z 159处的离子与完整的吡唑-吡咯并嘧啶一致。 m/z 154处的离子与整个未修饰的吡唑/吡咯并嘧啶部分的中性丢失一致。m/z  298和m/z 280处的较少的碎片离子表明乙腈成分的丢失，具有和没有容易的 失水，还限制对环戊基部分的羟基化位置。这进一步由m/z 237处的离子支持， m/z 237处的离子与经修饰的环戊基的丢失一致，留下未经修饰的分子剩余部 分。

化合物31存在于人受试者的尿中。全扫描质谱法证实m/z 339处的质子 化分子离子与向化合物I加入32原子质量单位一致。m/z 339离子的产物离 子碎裂产生m/z 311、218和191处的碎片离子。m/z 218处的原碎片(primary  fragment)与向吡唑-吡咯并嘧啶部分加入32原子质量单位一致。m/z 191处 的碎片离子与CHN从假定的双羟基化的吡唑-吡咯并嘧啶的吡唑部分丢失一 致，限制了对吡咯并嘧啶进行修饰的位置。m/z 311处的碎片离子可能起因于 酰胺键的初始开裂，随后是吡咯烷酮的CO丢失。使用单独的质谱法对化合 物31进行结构指定导致不确定的结果，因此将化合物31从人尿分离出并通 过¹H和¹³C NMR分析。31的结构被鉴定为化合物I的饱和的吡咯并嘧啶部 分的酰胺-醇代谢物。31的质子NMR光谱在δ3.56处具有强度为2H的单峰。 该单峰与δ177.9处的碳具有长程相关性，与酰胺一致。此外，H3和H9之间 出现核奥弗豪泽效应(nOe)。

化合物32存在于人受试者的血浆和尿中。全扫描质谱法证实m/z 339处 的质子化分子离子与向化合物I加入32原子质量单位一致。m/z 339离子的 产物离子碎裂产生m/z 218和191处的碎片离子。m/z 218处的裂变碎片与向 吡唑-吡咯并嘧啶部分加入32原子质量单位一致。m/z 191处的碎片离子与 CHN从假定的双羟基化的吡唑-吡咯并嘧啶的吡唑部分丢失一致，限制了对吡 咯并嘧啶进行改性的位置。使用单独的质谱法对化合物32进行结构指定导致 模棱两可的结果，因此将化合物32从人尿分离出并通过¹H和¹³C NMR分析。 32的结构被鉴定为化合物I的饱和的吡咯并嘧啶部分的酮醇代谢物。32的质 子NMR光谱具有在δ3.82处的单峰，该单峰具有2H的强度并示出与δ191.5 处的碳的长程相关性，与酮一致。从H2至任何其它质子没有观察到核奥弗 豪泽效应(nOe)。

在来自人受试者的血浆和尿中观察到化合物40。全扫描质谱法证实m/z  341处的质子化分子离子与向化合物I加入34原子质量单位一致。m/z 341离 子的产物离子碎裂产生m/z 323、220、202和175处的碎片离子。m/z 323处 的碎片离子起因于吡咯烷二醇的失水。m/z 220和202处的碎片离子与双羟基 化的饱和的吡咯并嘧啶一致，具有和没有观察到的容易的失水。m/z 175处观 察到的离子与在容易的失水之后双羟基化饱和吡唑吡咯并嘧啶的吡唑部分的 CHN丢失一致。化合物40被鉴定为3-环戊基-3-(4-(5，6-二羟基-6，7-二氢-5H- 吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈。

在来自人的尿中观察到具有499的观察的m/z的化合物I的单羟基化代 谢物的共轭物，且还在人血浆中以痕量观察到七种共轭物中的两种。对于这 些代谢物中的六种，初始的产物离子碎裂产生实际上相同的光谱，且m/z 323 处的观察离子与葡糖苷酸共轭物的丢失一致。这些m/z 323碎片离子的产物离 子碎裂(MS³)再次证实实际上相同的质谱，具有在m/z 305、186和159处的碎 片离子。m/z 305处发现的碎片离子与失水(18原子质量单位)一致，表明在分 子的饱和部分上的羟基化和随后碰撞引起的碎裂，限制了对环戊基部分进行 修饰的部位。m/z 186和m/z 159处的碎片离子与未修饰的吡唑-吡咯并嘧啶一 致。另外的较小的碎片离子太弱以致不能以任何确定性来指定它们。这些假 定的代谢物的同一性通过用β-葡糖苷酸酶水解分离的葡糖苷酸共轭物以展示 糖苷配基来证实，糖苷配基然后进行HPLC-MS的分析，其中所释放的糖苷 配基的保留时间和质谱与单羟基化代谢物标准品的保留时间和质谱匹配。这 些葡糖苷酸共轭物代谢物的糖苷配基对应于2-羟基代谢物(代谢物9，表1)和 3-羟基代谢物(代谢物8，表1)。第七葡糖苷酸共轭物代谢物即化合物42的糖 苷配基对应于化合物I的吡唑-吡咯并嘧啶部分的单羟基化代谢物，其并未在 来自人受试者的血浆或尿中独立地观察到。全扫描质谱法证实m/z 323处的质 子化分子离子与向化合物I加入162原子质量单位一致。m/z 323离子的产物 离子碎裂产生m/z 202处的裂变碎片，其与向吡唑-吡咯并嘧啶部分加入16原 子质量单位一致。m/z 175处的碎片离子与CHN从假定的羟基化的吡唑-吡咯 并嘧啶的吡唑部分丢失一致，限制对吡咯并嘧啶进行修饰的位置。代谢物化 合物42的结构被鉴定为化合物I的单羟基化吡咯并嘧啶部分的葡糖苷酸共轭 物。

代谢物化合物41存在于来自人受试者的尿。全扫描质谱法表明m/z 583 处的质子化分子离子与未修饰的化合物I的葡糖苷酸共轭一致。m/z 583离子 的产物离子碎裂产生m/z 307处的裂变碎片，其与完整的葡糖苷酸的丢失一 致。m/z 186和m/z 159处的较小的碎片离子与对于化合物I观察到的那些一 致。m/z 307碎片离子的MS³碎裂还展示m/z 186和m/z 159处的碎片离子。 化合物41被鉴定为化合物I的N-连接的葡糖苷酸共轭物。

表2

方法A1：¹⁴C-化合物I在人、狗和小鼠的血浆、尿和粪便样品中的生物 转化

代谢物谱的样品制备：

血浆：

根据主题和/或根据时间点收集来自所有受试者的血浆样品。将所收集的 血浆样品如下制备用于HPLC-放射性测量分析：将所收集的血浆样品的等分 试样最初用约两等(W/V)体积的在HPLC级乙腈中的1％甲酸萃取，随后用力 涡旋并离心以除去变性的血浆蛋白。将上清液保留并通过预处理的Waters  C-18固相萃取柱体，且保留滤液。保留SPE柱体。剩下的血浆小球然后用 HPLC级乙腈/水(90/10)中的1％甲酸萃取三次，且在每一次萃取之后离心。保 留所有的上清液。每份甲酸/乙腈/水萃取上清液用于洗脱SPE柱体。SPE柱 体然后用甲醇中的1％甲酸冲洗。将所有的洗提液保留，合并，并在30℃于 氮气流下蒸发。将该萃取的剩余部分在约0.6ml的在水中的0.1％甲酸中复水， 涡旋并离心以除去颗粒物质。然后通过HPLC-流动放射测定和HPLC-MS来 分析上清液。

尿：

从各受试者收集约等量的尿等分试样以表示适当时间间隔后的剂量。在 HPLC-放射性测量分析之前，将所收集的各尿样以4,000rpm离心10min以 除去颗粒物质，然后直接分析。

粪便：

从各受试者收集粪便匀浆的等分试样以表示适当时间间隔后的剂量。将 所收集的粪便匀浆样品如下制备用于HPLC-放射性测量分析：

将约5克粪便匀浆的等分试样最初用约两等(W/V)体积的Millipore水萃 取，随后离心除去固体。将上清液保留并通过预处理的Waters C-18固相萃取 柱体。保留SPE柱体。然后将剩下的粪粒用HPLC级乙腈/水(90/10)中的1％ 甲酸萃取三次，且在每一次萃取之后离心。保留所有的上清液。每一个甲酸/ 乙腈/水萃取上清液用于洗脱SPE柱体。将所有的洗提液保留，组合，并在 30℃氮气流下蒸发。将该萃取的剩余部分在约2.0ml的在水中的0.1％甲酸中 复水，涡旋并离心以除去颗粒物质。然后通过HPLC-流动放射测定和 HPLC-MS来分析上清液。

HPLC-流动放射测定分析方法：

所有的样品通过HPLC-流动放射测定或HPLC-MS，使用实际相同的分 析系统来分析。HPLC-流动放射测定系统由Agilent HP1100系列四元泵 (Quaternary pump)、自动取样器和与具有500μL液体闪烁室的Raytest  Ramona-90流动闪烁探测器连接的UV探测器组成。化合物I和其代谢物的 分离使用Waters Symmetry C-18 HPLC柱，4.6×250mm，5μm粒度HPLC柱来 实现。流动相“A”由HPLC级水中的0.1％甲酸组成，且流动相“B”由HPLC级 甲醇/乙腈(1∶1)组成。分析物的洗脱通过使用流动相“B”的线性增加梯度来实 现。根据需要，两种不同的梯度洗脱方法在不同时间采用。在下面在表3和 表4中概述这两种方法的色谱条件。

HPLC-质谱法分析方法：

HPLC-流动放射测定系统由Agilent HP1100系列四元泵和与以正离子探 测模式操作的Applied BiosystemsAPI 4000 Qtrap连接的Leap Technologies  CTC-PAL自动取样器组成。全扫描(MS)和数据依赖性产物离子扫描(MS²)用 于表征化合物I的代谢物。选择MRM转换还用于扫描和确定先前确定的和 表征的代谢物。化合物I和其代谢物的分离使用Waters Symmetry C-18 HPLC 柱，4.6×250mm，5μm粒度HPLC柱来实现。流动相“A”由HPLC级水中的0.1％ 甲酸组成，且流动相“B”由HPLC级甲醇/乙腈(1∶1)组成。分析物的洗脱通过 使用流动相“B”的线性增加梯度来实现。根据需要，两种不同的梯度洗脱方法 在不同时间采用。在下面在表3和表4中概述这两种方法的色谱条件。

表3

表4

方法A2：化合物I的生物转化：代谢物的分离

从人尿分离代谢物：

使用20cc Waters HLB SPE柱体(1克吸附剂)的固相萃取用于浓缩来自所 收集的尿样的化合物I的代谢物。将柱体首先用100％HPLC级甲醇进行处理， 然后用Millipore水处理。然后将柱体立即装载上高达10ml的原状未处理的 尿。随后使用水中的若干浓度的HPLC级甲醇来洗脱柱体(表5)。

表5

  操作   溶剂组成   体积   处理   100％甲醇   10ml   处理   100％Millipore水   10ml   装载   尿   7-10ml   洗脱   水中的5％甲醇   10ml   洗脱   水中的25％甲醇   10ml   洗脱   水中的50％甲醇   10ml   洗脱   水中的75％甲醇   10ml   洗脱   水中的100％甲醇   10ml

对于存在化合物I和目标代谢物，通过LC-MS来分析初始尿的等分试样、 最后的装载体积和每次洗涤/洗脱体积。不存在体积为Millipore水中的高达 25％甲醇的装载体积或在洗涤体积/洗脱体积中任一种的显著量的化合物I或 其代谢物。在100％甲醇洗脱等分试样中未发现显著量的药物或代谢物。从 50％和75％甲醇洗脱的洗脱体积各自使用Genevac离心蒸发器来减少体积并 在连续注射到LC-MS上之前复水至～2mL的最终体积，用于目标代谢物的级 分收集。

分析条件：

通过LC-MS使用与由Sil-HTC自动取样器和系统控制器以及两个Sil  10ADVp高压LC泵组成的Shimadzu二元HPLC堆连接的Finnigan LCQ Deca  XP Plus来分析样品。质谱以正离子探测模式操作，使用数据依赖性扫描以产 生MS和数据依赖性MS²数据。Shimadzu UV探测器Sil SPD10AVp以254nm 的探测波长用于监测与质谱仪一致的HPLC洗提液。

流动相“A”由用甲酸(约0.1体积％)将pH调节至pH 3.2的5mM甲酸铵 组成。流动相“B”由90％乙腈/10％甲醇组成。所使用的HPLC柱是Zobax XDB  C-18，3.0mm×150mm，5.0μm粒度。分析物的洗脱是通过使用流动相“B”的线 性增加梯度。在下面在表6概述分析规模分析的色谱条件。

表6

半制备型分析条件：

如上通过LC-MS分析样品，具有以下变化：

所使用的HPLC柱是Phenomenex Polar RP 10mm×150mm 5μm粒度。

初始的分级使用中性乙酸铵作为“A”相来进行，且单个收集峰的第二提纯 步骤使用水中的0.025％甲酸作为“A”相来进行。流动相“B”由90％乙腈/10％ 甲醇组成。

分析物的初始洗脱和自动级分收集是通过使用流动相“B”的线性增加梯 度。在下面在表7概述初始的半制备型分析的色谱条件，但在第二提纯步骤， 根据每一种单独代谢物的需要来优化％B。

表7

^*在第二分级步骤，对每一种单独代谢物进行优化

半制备型分析的洗脱剂流使用PEEK三通和管道来分流，且～1.65ml/min 的洗脱剂流用于级分收集，且剩余部分转到质谱仪。洗脱剂流组成通过MS 和选择的MS-MS实验来监测。包含目标分析物的部分通过利用与部分收集 器一致的转换阀来自动收集。

方法A3：化合物I在人和大鼠血浆和尿样中的生物转化

样品制备：

在单一剂量和/或多剂量研究之后，从已经口服化合物I的动物和人受试 者获得血浆和尿样。通过时间加权平均收集来收集每一个受试者的剩余血浆 样品。将所收集的血浆样品的等分试样(150μL)用两体积的乙腈来沉淀，涡旋 混合并然后离心。将上清液除去并用于LC-MS分析。对于人，从研究中的每 一个个体收集尿样以表示临床研究的第1天(单一剂量研究)和第10天(多剂量 研究)的0-12小时。在分析之前将尿样以～15000×g离心10分钟并直接注入。

样品分析：

使用电喷雾离子化LC-MS，通过以正电离模式操作的Thermo Finnigan  LCQ Deca-XP Plus Ion-Trap质谱仪(Thermo-Fisher Scientific Waltham MA， USA)来测定样品。数据依赖性扫描用于产生初始的MS至MS²数据。根据阐 明结构信息的需要，进行高阶MSⁿ实验。质谱仪连接至与Shimadzu LC-10A 二元梯度泵系统(Shimadzu Scientific Instruments，Columbia，MD，USA)组合的 Shimadzu Sil HT-C组合的自动取样器/控制器。梯度条件在表8中描述。化合 物I和其代谢物的分离使用Zorbax XDB C-18 HPLC柱(3.0×150mm，3.5μm) (Agilent，Santa Clara，CA USA)以300μL/min的流动相流速来实现。流动相“A” 由已经用甲酸将pH调节至pH 3.2的在Millipore水中的5mM甲酸铵组成。 流动相“B”由90％乙腈/10％甲醇组成。

表8.HPLC梯度洗脱方案

  时间  ％流动相B   0.0   10   1.0   10

  45.0   40   50.0   90   54.0   90   54.1   10   60.0   10

方法A4：大鼠胆汁、血浆和尿的代谢物表征方法

从施用化合物I的大鼠收集尿、粪便和胆汁样品。每个时间点收集每一 个样品的约30％，使得来自一个大鼠的排泄剂量的90％被包含在单个样品中。 单独地分析来自每一个大鼠的样品。粪便样品使用乙腈来萃取，且萃取回收 率通过萃取物的液体闪烁计数(LSC)和未被萃取的粒料的燃烧和LSC来确定。 当可用时，使用代谢物标准品确认结构。除非另外指出，否则不报道代表＜5％ 施用剂量的峰。

通过HPLC和质谱法来分析尿、粪便、胆汁和/或血浆样品以确定任何放 射性标记的代谢物的分子量并获得这些代谢物的结构信息。

方法A5：分离方法

同时从相同物种，即狗或大鼠的单个动物收集来自化合物I药代动力学 和毒物动力学研究的尿样。尿样用乙酸乙酯以1比1的体积比萃取三次。收 集乙酸乙酯萃取部分并使用旋转蒸发器除去挥发物。将所得到的残留物溶解 在乙腈∶水(1∶1v/v)中，并对溶液进行制备型HPLC纯化。每一种代谢物的分 离通过以相继次序使用以下三种HPLC条件来实现。

通过使用由水中的0.1％TFA(溶剂A)和乙腈中的0.1％TFA(溶剂B)组成 的流动相，在Zobax SB C18柱(19×150mm，5μm)上，使用5％至60％溶剂B 的梯度和15mL/min的流速经20分钟对浓缩的萃取物进行纯化。

1.然后通过使用由水中的0.1％TFA(溶剂A)和甲醇(溶剂B)组成的流动 相、在柱Zobax SB C18柱(9.6×150mm，5μm)上，使用5％至95％溶剂B的 梯度和4mL/min的流速经25分钟进一步纯化从第一HPLC纯化收集的级分。

2.对从第二次纯化收集的具有[M+H]⁺＝321和323的每一个级分进行采 用由15％乙醇和85％己烷或30％乙醇和70％己烷组成的流动相，在采用15 mL/min的流速的手性柱(ChiralCel OD-H，20×250mm，5μm)上的手性分离。

方法A6：分析方法

35、37和38的保留时间从使用以40℃柱温的Zorbax SB C18柱(4.6×150 mm，803.5μm)、使用由水中的0.05％TFA(溶剂A)和乙腈中的0.05％TFA (溶剂B)组成的流动相、采用1mL/min的流速、使用表9中示出的梯度洗脱 方案的HPLC分析获得。在220nm进行在线UV探测。

表9.梯度洗脱方案

 时间(min)  ％ACN   0   5   15   95   18   95   18.5   5   24   5

方法A7：替代分析方法

40、41和42的保留时间从使用Waters AtlantisT-3 HPLC柱(4.6×150mm， 3.5μm)(Waters Corporation，Milford，MA，USA)、采用400μL/min的流动相流 速的HPLC分析获得。流动相“A”由已经用甲酸将pH调节至pH 3.2的在 Millipore水中的5mM甲酸铵组成。流动相“B”由100％甲醇组成。初始的流 动相条件是90％流动相“A”/10％流动相“B”，且在一分钟内梯级梯度至27％流 动相“B”。初始的梯度然后在57分钟内以线性方式进展至52％流动相“B”，随 后在10分钟内第二线性梯度至95％流动相“B”。接着发生以95％流动相“B” 的五分钟柱冲洗时间并随后返回至起始条件和在下一个分析注射之前的8分 钟柱再平衡。100％的柱洗脱剂被引导通过监测λ254nm的Shimadzu固定波长 UV探测器SPD-10Avp(Shimadzu Scientific Instruments，Columbia，MD，USA)。 在离开UV探测器之后，洗脱剂流使用PEEK三通来分流以允许约100μl的 洗脱剂经由电喷雾电离化被引入质谱仪。电喷雾源电压被设置在4.5kV，具 有325℃的毛细管温度，外壳和吹扫气分别被设置在50和30(任意单位)。初 始的数据依赖性MS/MS设置包括2.0原子质量单位的分离宽度和42的碰撞 能量设置。所有的其它仪器设置和电位被优化以实现化合物I的最大信噪比。

方法A8：化合物I的葡糖苷酸代谢物的酶促水解。

化合物I的分离的葡糖苷酸共轭物代谢物用β-葡糖苷酸酶温育，且在所 有情况下反应进行至完成，产生相关的糖苷配基，其使用上述相同的LC-MS 方法来分析。将释放的糖苷配基的保留时间和质谱与化合物I的单羟基化代 谢物标准品的保留时间和质谱进行比较以确定共轭物的同一性。

实施例B：

假定具有323的分子量的代谢物样品包含羟基的代谢物并被溶解在200 μL的从Isotec获得的CD₃OD中。假定具有分子量321的样品由包含酮部分 并被溶解在200μL的从Isotec获得的CDCl₃中。将具有不同于上述分子量的 分子量的样品溶解在200μL的也从Isotec获得的DMSO-d₆中。在溶解之后， 将每一个样品放入从Wilmad Glass获得的3mm NMR管。在分析之前立即制 备样品。

样品使用对于¹H在500MHz操作和对于¹³C在125MHz操作的Varian  INOVA NMR分光计来分析。使用3mm三重共振逆探测梯度探针。在进行所 有的数据采集时间期间将样品保持在30℃。对于每一个样品，将探针锁定并 调整。进行其它NMR实验以获得确定结构所需要的数据。

化合物31¹H(500MHz，DMSO-D₆)：δ8.58(s，1H)，8.23(s，1H)，4.47(td， 1H)，3.56(s，2H)，3.18(dd，1H)，3.13(dd，1H)，2.35(m，1H)，1.79(m，2H)， 1.59-1.39(m，4H)，1.29(m，2H)。

化合物32¹H(500MHz，DMSO-D₆)：δ9.24(s，1H)，8.66(s，1H)，4.56(td， 1H)，3.82(s，2H)，3.17(dd，1H)，3.11(dd，1H)，2.35(m，1H)，1.79-1.12(m，4H)， 1.61-1.45(m，4H)。

化合物35¹H(500MHz，DMSO-D₆)：δ12.25(s，1H)，8.82(s，1H)，8.73(s， 1H)，8.37(s，1H)，7.64(m，1H)，7.08(m，1H)，4.93(dd，J＝11.6，3.3，1H)，3.76(d， J＝4.8，1H)，3.52(dd，J＝17.2，11.7，1H)，3.08(dd，J＝17.4，3.6)，2.04(m，1H)，1.76 (m，1H)，1.63(m，1H)，1.54(m，2H)，0.95(m，1H).

化合物37¹H(500MHz，CDCl₃)：δ8.71(s，1H)，8.17(s，1H)，8.00(s，1H)， 4.22(td，J＝9.6，3.7，1H)，3.71(s，2H)，3.09(dd，J＝17.0，9.1，1H)，2.91(dd，J＝16.8， 3.7，1H)，2.55(m，1H)，1.94(m，1H)，1.80-1.45(m，5H)，1.27(m，1H)，1.19(m， 1H).

化合物38¹H(500MHz，DMSO-D₆)：δ11.35(s，1H)，8.60(s，1H)，8.54(s， 1H)，8.09(s，1H)，4.55(td，J＝9.8，3.8，1H)，4.10(m，1H)，3.79(s，2H)，3.19(dd， J＝16.9，9.5，1H)，3.13(dd，J＝17.5，4.5，1H)，2.39(m，1H)，2.01(m，1H)，1.58(m， 1H)，1.48-1.07(m，4H)。

实施例C：

可以将代谢物1-39的活性数据以及游离级分和固有清除率数据与母体化 合物即化合物I的活性数据以及游离级分和固有清除率数据进行比较。在下 面描述JAK活性测定、游离级分测定和固有清除率测定。可以获得代谢物1-39 的单个立体异构体的数据点。代谢物可以是JAK1、JAK2和JAK3的有效抑 制剂，例如化合物I。

体外JAK激酶测定

可以根据在Park等人，Analytical Biochemistry 1999，269，94-104中描述的 以下体外测定测试本文描述的化合物对JAK靶的抑制活性。具有N-端His 标记的人JAK1(a.a.837-1142)、JAK2(a.a.828-1132)和JAK3(a.a.781-1124) 的催化域可以使用昆虫细胞中的杆状病毒来表达并纯化。JAK1、JAK2或 JAK3的催化活性可以通过测量生物素基化肽的磷酸化来测定。磷酸化肽可以 通过均相时间分辨荧光(HTRF)来探测。可在包含具有100mM NaCl、5mM DTT和0.1mg/mL(0.01％)BSA的50mM Tris(pH 7.8)缓冲液中的该酶、ATP 和500nM肽的反应物中测量化合物对各激酶的IC₅₀。反应物中的ATP浓度对 于Jakl可以是90μM，对于Jak2可以是30μM且对于Jak3可以是3μM。反 应可以在室温下进行1hr，然后采用测定缓冲液(Perkin Elmer，Boston，MA)中 的20μL45mM EDTA、300nM SA-APC、6nM Eu-Py20来中止。可将与铕标 记抗体的结合进行40分钟，且HTRF信号可以在Fusion板读数器(Perkin Elmer， Boston，MA)上测量。对于任何上述JAK靶具有10μM或更低的IC₅₀的化合物 可被视为具有活性。

游离级分测定

使用来自Harvard Apparatus(Holliston，MA)的Dianorm系统，通过平衡渗 析来测定测试化合物的蛋白结合。渗析可以37℃人血清中进行2hr。可以将 代谢物以3μM温育，且化合物I以3和10μM温育。可通过LC/MS/MS分 析，测定渗析后血清和缓冲液中的化合物浓度。游离级分被定义为缓冲液对 血清浓度的比率。

固有清除率测定

可以通过在37℃下在人混合性别肝微粒体(0.5mg/mL蛋白)中在1mM  NADPH的存在下温育1μM的测试化合物来确定固有清除率。测试化合物的 消失可以通过LC/MS在0、5、10、20和30min来监测。通过采用文献中报 告的标准方法，将化合物浓度下倾的斜率用于计算人的固有清除率。

根据前述描述，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对本领域 技术人员将是显而易见的。这样的修改还意图落在所附的权利要求的范围内。 本申请中所引用的各个参考文献通过引用整体并入本文。