具有改变的Fab唾液酸化的抗体组合物

摘要

本发明涉及从抗体制备物富集的抗体群，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化。此外，本发明涉及从抗体制备物富集抗体群的方法，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化。本发明也涉及用于医学的本发明的抗体群，包括本发明的抗体群的药物组合物和本发明的抗体群在预防和/或治疗动脉粥样硬化，癌和感染例如细菌，病毒或真菌感染中的用途。

说明书

【技术领域】

发明涉及在Fab区具有改变的唾液酸化的抗体群，制备它们的方法，及其用途。

【背景技术】

免疫球蛋白，也被称为抗体，是免疫系统的主要分泌产物。它们一般由基本的结构单元形成-各具有2个重链和2个轻链-以形成具有一个所述单元的单体，具有2个单元的二聚体，具有5个单元的五聚体，或具有6个单元的六聚体。抗体在先天性免疫中起到显著的作用。在针对病原体的天然的免疫应答中，在病原体和抗体之间形成复合物。这些免疫复合物活化宽范围的效应子功能，由此导致病原体的杀伤，去除和破坏。抗体也可与可导致自身免疫疾病及贡献于慢性炎症症状的身体的自身抗原反应。抗体可具有抗-炎症活性，例如通过靶向和中和炎症级联中的各介质。

有5种主要的免疫球蛋白同种型，其发挥不同的作用。IgG提供针对侵袭病原体的大部分基于抗体的免疫，且在以下更详细讨论。IgM以膜结合形式及以溶液出现。在溶液中，其一般形成五聚体，在结合抗原中提供高亲合力。其常首先，在足够的特异性IgG产生之前立即防御感染。IgA通常作为二聚体出现，并见于粘膜区，例如肠，肺和泌尿生殖道。其保护这些表面免于病原体定居。IgE主要涉及过敏性反应。其结合过敏原和引发组胺从肥大细胞及嗜碱性粒细胞释放。IgD主要见于未曾暴露于抗原的B淋巴细胞表面。

在人中，定义了4种亚类的IgG，并根据它们的在正常血清中的相对浓度编号：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，它们分别占血清IgG的约60％，25％，10％和5％，各IgG亚类具有独特的效应子功能。

一般而言，各个体单体免疫球蛋白单元，例如IgG分子，由2个相同的轻链和2个相同的重链组成，其进而包括约110个氨基酸残基的重复结构基序。轻和重链结构域以共价和非共价关联关系成对，由此形成通过柔性的接头，所谓的铰链区连接的3个独立的蛋白部分。这些部分中的2个被称为Fab(抗原-结合片段)区，且为相同的结构。各Fab区形成相同的特异性抗原-结合位点。第3部分是Fc(可结晶化的片段)区，其形成活化清除和转运机理的配体的相互作用位点。

IgG在疾病中起到重要的作用。IgG1-类型抗体是在抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)常被认为是重要的癌免疫治疗中最常使用的抗体。此外，IgG已知通过由它们的Fc片段介导的相互作用介导促炎和抗炎药活性。一方面，Fc和其相应受体之间的相互作用负责免疫复合物和细胞毒性抗体的促炎性质。另一方面，静脉内γ球蛋白(IVIG)和其Fc片段是抗-炎症的且广泛用于抑制炎症疾病。不清楚所述矛盾的性质的精确的机理，但有提示，IgG的糖基化对于调节IgG的细胞毒性和炎症潜力是关键的。

迄今，对于由IgG介导的细胞毒性和炎症效应的调节中糖基化的作用的研究主要集中于Fc区。IgG的糖基化对于通过维持2个重链的开放构象结合全部FcyR是必要的。此对于FcyR结合的IgG糖基化的需求解释去糖基化的IgG抗体不能介导体内引发的炎症应答，例如抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)，吞噬作用和炎症介质的释放。自身免疫状态和IgG抗体的特异性糖基化模式之间的关系已在患类风湿性关节炎和已报告IgG抗体的降低的半乳糖基化及唾液酸化的几种自身免疫血管形成的患者中观察到(Parekh et al.，Nature 316，452(1985)；Rademacher et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，6123(1994)；Matsumoto et al.，128，621(2000))。

国际专利申请WO 2007/117505公开了含至少一个IgG Fc区的多肽，所述多肽相比未纯化的抗体具有更高抗-炎症活性和更低细胞毒性活性。在本申请中发现，富集在Fc片段上N-连接的糖基化位点的增加的唾液酸化的IgG制备物显示增强的体内抗-炎症活性。相反，得出，在此体内测定中Fab片段显示无抗-炎症活性。

由与WO 2007/117505相同的发明人的国际申请WO 2008/057634公开了含至少一IgG Fc区的多肽，其中所述至少一个IgG Fc区经通过α-2，6连接连接到相应末端唾液酸部分的至少一个半乳糖部分糖基化。WO 2008/057634的多肽相比未纯化的抗体具有更高抗-炎症活性。也在此申请中发现，富集在Fc片段上N-连接的糖基化位点的增加的唾液酸化的IgG制备物显示增强的体内抗-炎症活性。相反，得出，在此体内测定中Fab片段显示无抗-炎症活性。还证实，抗-炎症活性是由于Fc片段，而非Fab片段上增加的唾液酸化，由相同的发明人在国际申请WO 2009/079382中提供。

在由Nimmerjahn & Ravetch JEM 204，11～15(2007)的注释中，作者明显教导，Fc区内的唾液酸化对于IVIG的抗-炎症活性是关键的。此外，它们陈述，位于Fab区的抗原结合结构域在IgG的抗-炎症活性中的一般作用可能是，假设在它们的方面，完整的IVIG和其Fc片段具有相当的抗-炎症活性。

国际申请WO 2007/005786针对控制含Fc分子的性质的方法，所述方法包括改变Fc区内寡糖的唾液酸化。在本申请中发现，Fc寡糖的唾液酸化的水平改变重组-产生的对于Fcγ受体的治疗性抗体的亲和性，导致这些抗体的生物学作用的各方面的调节。还发现，唾液酸从Fc寡糖的去除增强重组-产生的治疗性抗体对于它们的靶分子的亲合力。但是，效应被认为是完全Fc介导的，由于观察到在各Fab臂和靶之间的固有的亲和性中无差异。WO 2007/005786的发明人假定，从Fc寡糖的带电的静态基团的去除允许总体抗体结构中更多柔性，由此提供彼此关联的2个结合结构域的更高潜力的相互作用。

由Jefferis(Jefferis，R.；Nat Rev Drug Discov.2009Mar；8(3)：226-34)的新近综述文章讨论作为改善基于抗体的治疗剂的策略的糖基化。根据Jefferis 2009，大致30％的多克隆人IgG分子在IgG Fab区内带有N-连接的寡糖，且观察到IgG Fab相比IgG Fc的更高水平的半乳糖基化及唾液酸化。当存在时，糖基化附接于可变区，且不清楚多克隆IgG的IgG Fab糖基化的功能意义。基于对于单克隆抗体的研究，推测抗体的Fab区内的糖基化可对于抗原结合具有中性，正面或负面影响。无动机进一步研究，也无动机富集Fab区内糖基化的抗体群。

由此，已就预防和治疗各疾病加强研究了在抗体的Fc区具有增加的量的唾液酸化的抗体制备物，并也已讨论了抗体的Fab区的糖基化的潜在作用。但是，虽然许多抗体目前在使用，仍有提供在临床应用中具有更有益有效性的替代性的和/或改良的抗体制备物的需要。

通过提供权利要求中表征的实施方式达到对于此技术问题的解决方案。发明人意外地显示，在Fab区内显示改变的唾液酸化的抗体的富集具有改变的免疫调节性质。

【发明概述】

因此本发明的一实施方式是可通过从抗体制备物富集获得的抗体群，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化，且其中基于Fab区内改变的唾液酸化的富集产生相比富集之前的抗体制备物具有富集的群的改变的免疫调节性质的抗体群。

优选抗体群如下产生：使抗体制备物在西洋接骨木(Sambucusnigra)凝集素柱或其相当物上经历亲和层析，以及(a)收集非结合级分(-SA级分)和/或(b)用酸性乳糖洗脱结合级分(+SA级分)，其中所述-SA级分在Fab区内具有降低的量的唾液酸化，及+SA级分在Fab区内具有增加的量的唾液酸化，且其中在Fab区内具有改变的量的唾液酸化的级分具有改变的免疫调节性质。

进一步优选的实施方式是如上所述的抗体群，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化，其中当测量总检测的糖肽的％唾液酸化的糖肽时，Fc部分内唾液酸化的量富集少于100％(即2倍)，优选少于50％(1.5倍)，更优选少于30％，甚至更优选少于20％。

进一步优选的实施方式是如上所述的抗体群，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化，其中Fab部分内唾液酸化的量相比富集之前抗体制备物中Fab区内的唾液酸化的量改变至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，甚至更优选至少3倍，最优选至少4倍。

本发明的另一实施方式是从抗体制备物富集抗体群的方法，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化，所述方法包括下列步骤：

(a)使抗体制备物经历具有对于唾液酸化的抗体的Fab区的亲和性的亲和层析；

(b-i)收集不在步骤(a)中结合的抗体群(-SA级分)；其中所述抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有更低量的唾液酸；和/或

(b-ii)洗脱和收集在步骤(a)中结合的抗体群(+SA级分)，其中所述抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有更高量的唾液酸，

其中基于改变的Fab区内的唾液酸化的量的富集产生相比富集之前的抗体制备物具有改变的免疫调节性质的抗体群。

优选，步骤(a)中的亲和层析用西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素进行。优选，当测量总糖肽的％唾液酸化的糖肽时，得到的-SA级分或得到的+SA级分的Fc部分内的唾液酸化与在亲和层析之前抗体制备物中的Fc唾液酸化差异少于100％(2倍)，优选少于50％，更优选少于30％，最优选少于20％。

优选，抗体制备物是血浆免疫球蛋白制备物，更优选，血浆免疫球蛋白G制备物，甚至更是人血浆免疫球蛋白G制备物，最优选静脉内免疫球蛋白G(IVIG)或皮下免疫球蛋白G(SCIG)。

在优选的实施方式中，抗体的Fab区内唾液酸化的量经进一步改变，优选酶学地。优选，所述-SA级分中唾液酸化的量通过去除唾液酸残基的酶进一步减少，然而+SA级分中唾液酸化的量通过添加唾液酸残基的酶进一步增加。

一个优选的实施方式是抗体群或产生抗体群的方法，其中唾液酸化的量的改变是Fab区内的唾液酸化的量的减少。

本发明的第二，替代性的优选的实施方式是抗体群或方法，其中唾液酸化的量的改变是Fab区内的唾液酸化的量的增加。

本发明的进一步实施方式是包括本发明的抗体群的药物组合物。任选药物组合物可包括药学可接受的载体，赋形剂和/或稀释剂。

本发明的进一步实施方式是如上所述的在Fab区具有改变的唾液酸化的抗体群，其用于医学。

在优选的实施方式中，本发明的抗体群用于预防和/或治疗动脉粥样硬化，癌和感染例如细菌，病毒或真菌感染。

在另一优选的实施方式中，本发明的抗体群用于预防或治疗炎症病情。优选，炎症病情是自身免疫疾病或神经退行性疾病，例如，自身免疫或神经退行性疾病是类风湿性关节炎，全身性红斑狼疮(SLE)，抗磷脂综合征，免疫血小板减少症(ITP)，川崎病，Guillain Barré综合征(GBS)，多发性硬化(MS)，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)，皮肤发疱病，皮肌炎，多发性肌炎，阿尔茨海默病，帕金森病，与唐氏综合征相关的阿尔茨海默病，脑淀粉样血管病，痴呆伴列维小体，额颞叶退化或血管性痴呆。优选，用于治疗炎症病情的抗体群在Fab区具有增加的唾液酸含量。

【发明详述】

本发明涉及从抗体制备物富集的抗体群，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化。优选，抗体群可通过从抗体制备物富集获得，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化，且其中基于Fab区内改变的唾液酸化的富集产生相比富集之前的抗体制备物具有富集的群的改变的免疫调节性质的抗体群。

根据此实施方式的抗体群也贯穿说明书被称为″本发明的富集的抗体群″。

根据本发明的全部实施方式，术语″抗体群″指一组抗体，其或同源，即包括多个仅一种特异性抗体的分子，或为异源，即包括多种不同的抗体。在任一情况中，抗体群优先由IgG类抗体组成或包括IgG类抗体(也见以下)。但是，其可也包括IgM或IgA类抗体或IgG，IgM和/或IgA类的免疫球蛋白混合物，或由IgM或IgA类抗体或IgG，IgM和/或IgA类的免疫球蛋白混合物组成。

根据本发明，术语″富集的抗体群″指更浓缩到包括更多具有某些目的特征的抗体的抗体群，即相比富集之前的抗体制备物，抗体的Fab区内改变的量的唾液酸化。术语″唾液酸化的量″和″唾液酸的量″在本文中互换使用。如下所述，改变的量的唾液酸化可为抗体的Fab区内唾液酸化的量的增加或减少。由此，富集的抗体群可例如就在Fab区具有唾液酸化的抗体富集，因此产生相比富集之前的抗体群具有增加的量的唾液酸化的群。在另一例中，富集的抗体群也可就在Fab区缺乏唾液酸化的抗体富集，因此产生相比富集之前的抗体群具有降低的唾液酸化的量的群。优选，富集的抗体群与富集之前的抗体制备物差异在于，相比富集之前抗体制备物中Fab区内的唾液酸化的量具有如下唾液酸化的量：至少1.25倍更高或更低，更优选至少1.5倍更高或更低，更优选至少2倍更高或更低，例如至少3倍或至少4倍更高或更低。更优选地，唾液酸化的量相比富集之前抗体制备物中Fab区内的唾液酸化的量为至少5倍更高或更低。术语″倍更高或更低″指当测量总聚糖的％唾液酸化的聚糖时，相比原材料相对增加或减少。例如，如果富集之前的抗体群具有聚糖的15％的唾液酸的量，则具有3倍更高或更低唾液酸的量的富集的抗体群将分别具有45％或5％含唾液酸聚糖。在IgG的情况中，Fc片段的唾液酸化如下确定：用蛋白酶例如胰蛋白酶消化，然后是分析得到的Fc-特异性糖肽(例如如实施例2，方法(a)中所述)，且本文中举例的富集数指总Fc-特异性糖肽中具有一个或多个唾液酸残基的Fc-特异性糖肽的富集倍数或百分率。IgG分子的总唾液酸化(包括Fab和Fc唾液酸化)可通过用N-糖苷酶F消化胰蛋白酶肽，然后是分析释放的聚糖(例如如实施例2，方法(b)中所述)来确定。此情况中，数指总聚糖中具有一个或多个唾液酸残基的聚糖的数或百分率。

富集的抗体群可为依赖于作为用于富集的原材料使用的抗体制备物的选择和依赖于选定的富集方法分离的和/或纯化的抗体群。本文所用的″纯化的抗体群″指包括仅一类抗体，例如IgG的抗体群。抗体群也可纯化至实现含或基本上含(即至多于90％)仅特异性亚类的抗体，例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4，或含或基本上含仅对于抗原的指定的特异性的抗体。本文所用的术语″分离的抗体群″指不包括任何不是抗体的分子的抗体群。

贯穿本发明使用的术语″抗体″含盖，例如，多克隆或单克隆抗体。术语“抗体”也包括仍保留抗原结合特异性的衍生物或其片段。由此，也包括以下实施方式，例如嵌合(人恒定区，非人可变结构域)，单链和人源化的(具有非人CDR的人抗体)抗体，以及抗体片段，如，特别，Fab或Fab’片段。抗体片段或衍生物还包括Fd，F(ab′)₂，Fv或scFv片段；见，例如，Harlow and Lane″Antibodies，A LaboratoryManual″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988和Harlowand Lane“Using Antibodies：A Laboratory Manual”Cold SpringHarbor Laboratory Press，1999。

贯穿本发明使用的术语″Fab区″指由来自抗体的各重和轻链的一个恒定及一个可变结构域组成，且含涉及抗原结合的位点的抗体区。各完整的天然的IgG抗体包括2个Fab区。根据本发明，术语″Fab片段″用于当将抗体用木瓜蛋白酶消化时通常得到的那些抗体片段。木瓜蛋白酶消化导致以上抗体的连接2个重链的二硫桥的切割及，由此，2个个体Fab片段的释放。另一方面，用胃蛋白酶消化导致通过抗体铰链区连接在一起的2个Fab片段，所谓的″F(ab′)₂片段″的释放。关于未通过这些酶消化消化的抗体，术语″Fab区″指如果进行用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的消化将形成Fab和/或F(ab′)₂片段的那些抗体部分。关于通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化得到的抗体片段，Fab区对应于Fab片段。在Fab片段的情况中，相应分子同于Fab区。

但是，由于Fab区的糖基化位于抗体可变区，在本发明的背景下，Fv区，单链Fv片段或其他含抗体的可变区的片段被认为相当。

根据本发明的全部实施方式，抗体可从血浆提取或可通过本领域已知的各过程任之一产生，例如如Harlow and Lane(1988)and(1999)，loc.cit中所述。由此，抗体可，例如，合成产生，且也可包括肽模拟物。而且，可应用描述用于产生单链抗体的技术(见，特别，美国专利4,946,778)。而且，转基因动物或植物(见，例如，美国专利6,080,560)可用于表达(人源化的)抗体。对于单克隆抗体的制备而言，可使用任何提供通过连续的细胞系培养产生的抗体的技术。所述技术的例为本领域已知，例如如Harlow and Lane(1988)和(1999)，loc.cit.中所述，且包括杂交瘤技术(and Milstein Nature 256(1975)，495-497)，三源杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和用以产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。本发明的背景也考虑术语“抗体”包括可在细胞内表达的抗体构建体，例如可经，尤其，病毒或质粒载体转染的和/或转导的抗体构建体。

根据本发明使用的术语″改变的量的唾液酸化″指抗体群中唾液酸的量的变化，其中唾液酸位于所述群的抗体的Fab区。由此，如果富集的抗体群的抗体的Fab区内总体唾液酸的量不同于富集之前的抗体制备物的抗体的Fab区内总体唾液酸的量，富集的抗体群的唾液酸化的量改变。唾液酸的量的变化可为唾液酸的量的增加或唾液酸的量的降低。确定是否抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化可使用任何本领域已知的各种方法进行。例如，可测定富集之前的抗体制备物和目的抗体群的唾液酸化的量，且可直接比较由此得到的结果。确定唾液酸化的量的方法为本领域熟知。非限制例包括实施例部分详述的方法或目的抗体的胃蛋白酶消化，然后是从Fc片段分离得到的F(ab’)₂和胃蛋白酶片段(例如使用centricon)，并定量这些级分中的唾液酸(例如用HPLC或MS或基于光度测定的酶，可从QA-bio LLC，Palm Desert，Ca：qa-bio.com得到)，如描述于，例如，Current Protocols in ProteinScience：Unit 12.4(Hudson et al)，12.6(Royle et al)and 12.7(Harvey etal)，John Wiley and Sons(2006)。这些方法可用于确定本文中描述的全部实施方式的改变的量的唾液酸化。唾液酸化的增加或减少的量通常表示为总聚糖的％唾液酸化的聚糖，或对于Fc唾液酸化而言是总糖肽的％唾液酸化的糖肽。

根据本发明，术语″唾液酸″指神经氨酸(具有9-碳主链的单糖)的N-或O-取代的衍生物。神经氨酸衍生物的此家族的最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac或NANA)。该家族的其他成员是N-羟乙酰基神经氨酸(NGNA或Neu5Gc)，其中N-乙酰基Neu5Ac被羟化。也被术语唾液酸含盖的是2-酮基-3-脱氧壬酮糖酸(KDN)(Nadano et aI.(1986)J.BioI.Chem.261：11550-11557；Kanamori etaI.，J.BioI.Chem.265：21811-21819(1990))以及9-取代的唾液酸，例如9-O-C-C6酰Neu5Ac如9-O-乳酰-Neu5Ac或9-O-乙酰-Neu5Ac，9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac(Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer Verlag，New York(1992))。

根据本发明，术语“免疫调节性质”指抗体群对免疫系统引发的效应。免疫调节效应可为免疫抑制或免疫刺激。各种体外或体内方法本领域技术人员可用以测量物质(如抗体群)的免疫调节性质。例如，单核细胞-来源的细胞系，例如U937细胞，可用视黄酸或维生素D生长和分化。然后它们可，例如用干扰素-γ或植物凝集素，在测试物质的存在和缺失下刺激。适当的温育后，可在细胞的上清中测量炎症标记物例如IL-8的量，及可例如通过荧光活化的细胞分析(FACS分析)测定U937细胞，例如CD54，CD14或CD45上的细胞表面标记物。具有免疫抑制，例如抗-炎症性质的物质将导致相比对照样品更低量的炎症标记物。物质也可就用所述测定的它们的抗-炎症效应排序；越低量的炎症标记物产生，则越高抗-炎症效应。另一例是使用从人血分离的，用某些物质例如洛索立宾或CpG在测试物质的缺失或存在下刺激的外周血单核细胞(PBMC)的方法。通过测试物质的干扰素-α产生的抑制将是免疫抑制，例如抗-炎症效应的指标。也可用类似测定，测量免疫刺激。例如，可使用如上所述的相同的方法，但不使用通过例如干扰素或植物凝集素或类似刺激物刺激。

根据本发明意外地发现，使用凝集素亲和层析在中性或碱性的pH分离抗体制备物产生显示抗体的Fc区内唾液酸化的量的仅小的差异，但显示抗体的Fab区内唾液酸化的量的高差异的抗体群。如实施例4中所示，这些群具有不同的抗原识别模式，在临床应用，例如在动脉粥样硬化中使用这些级分导致有益效应，其中尤其对于在抗体的Fab区内具有降低的唾液酸的量的群显示保护效应。

本发明也涉及从抗体制备物富集抗体群的方法，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化，所述方法包括下列步骤：(a)使抗体制备物经历具有对于唾液酸化的抗体的Fab区的亲和性的亲和层析；(b-i)收集不在步骤(a)中结合的抗体群(-SA级分)；其中所述抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有更低量的唾液酸，和/或(b-ii)洗脱和收集在步骤(a)中结合的抗体群(+SA级分)，其中所述抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有更高量的唾液酸，其中基于改变的Fab区内的唾液酸化的量的富集产生相比富集之前的抗体制备物具有改变的免疫调节性质的抗体群。优选，步骤(a)中的亲和层析用西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素进行。在优选的实施方式中，当测量总糖肽的％唾液酸化的糖肽时，所述-SA级分或+SA级分的Fc部分内的唾液酸化与抗体制备物中的Fc唾液酸化差异少于100％(2倍)，优选少于50％，更优选少于30％，最优选少于20％。

根据本发明术语″具有对于唾液酸化的抗体的Fab区的亲和性的亲和层析″涉及基于亲和性基质和在抗体的Fab区内存在的唾液酸之间的特异性相互作用分离抗体混合物的层析方法。本领域技术人员已知基于它们的唾液酸分离抗体的几种方法，例如凝集素层析，唾液酸特异性化学配体，离子交换层析(例如AIEX)，疏水或亲水相互作用层析或混合的模式液体层析(例如阴离子-阳离子交换/亲水性相互作用层析)(Mant CT，J Sep Sci.31，2754，2008)。可将这些方法适应于允许基于在Fab区内存在的唾液酸分离抗体，例如如下详述的和如本发明的实施例中所示的。

因为在Fab区内具有低水平的唾液酸化或无唾液酸化的抗体将不被根据本发明的亲和层析结合，不在步骤(a)中结合和在步骤(b-i)收集的抗体群是相比富集之前的制备物具有降低的抗体的Fab区内唾液酸化的量的富集的群。换言之，此抗体群是唾液酸耗竭的群。在步骤(a)中结合和在步骤(b-ii)中收集的抗体群是相比富集之前的制备物在抗体的Fab区内具有增加的量的唾液酸化的富集的群，由于在Fab区内具有高水平的唾液酸化的抗体与亲和层析的结合。由此，将起始抗体群的抗体分离为具有增加的或降低的抗体的Fab区内唾液酸化的量的富集的群。

在本发明的方法的优选的实施方式中，在步骤(b-i)和(b-ii)之间进行至少一个洗涤步骤。适宜洗涤溶液为本领域技术人员熟知，并选自，例如，tris-缓冲的盐水(TBS)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。

在本发明的富集的抗体群或本发明的方法优选的实施方式中，抗体制备物是血浆免疫球蛋白G制备物。

根据本发明的术语″血浆免疫球蛋白G制备物″指从血浆分离的免疫球蛋白G制备物。待从血浆分离的免疫球蛋白G可已被循环B细胞(分泌抗体的浆细胞)分泌。血浆免疫球蛋白G制备物可从哺乳动物例如人得到，而且在非限制例方式中从表达人免疫球蛋白G库的转基因动物，例如猪，山羊，羊或牛得到(见综述Echelard Y and MeadeH.，″Toward a new cash cow.″Nat Biotechnol.2002Sep；20(9)：881-2)。

在更优选的实施方式中，血浆免疫球蛋白G制备物是静脉内免疫球蛋白G(IVIG)。

根据本发明的″静脉内免疫球蛋白G(IVIG)″为本领域技术人员熟知，并指含从超过1000个血供体的血浆提取的合并的IgG免疫球蛋白的血浆制备物。IVIG作为治疗疾病例如免疫缺陷，炎症和自身免疫疾病以及急性感染的静脉内施用的产品用于医学。IVIG的优选的例是Privigen^TM。

在另一更优选的实施方式中，血浆免疫球蛋白G制备物是皮下免疫球蛋白G(SCIG)。

根据本发明的“皮下免疫球蛋白G(SCIG)”为本领域技术人员熟知，并指类似于IVIG的血浆制备物，只是其作为经皮下施用的产品用于医学。SCIG的优选的例是Hizentra^TM。

在另一更优选的实施方式中，血浆免疫球蛋白G制备物是人血浆免疫球蛋白G制备物。

在本发明的方法的另一优选的实施方式中，具有对于唾液酸化的抗体的Fab区的亲和性的亲和层析是在pH8～11的凝集素亲和层析。

根据本发明的术语″凝集素亲和层析″涉及亲和性基质是凝集素的层析。凝集素(lectin)，例如凝集素(agglutinin)，是可特异性结合碳水化合物分子及由此能基于它们的聚糖基分离蛋白的蛋白。适宜用于本发明的凝集素亲和层析的凝集素的非限制例是西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA，西洋接骨木(Sambucus nigra))，小麦胚凝集素(WGA，小麦(Triticum vulgaris)和山槐(Maackiaamurensis)凝集素(MAL，山槐(Maakia amurensis))I和II亚型(Mal I和Mal II)。

根据本发明意外地发现，适应凝集素亲和层析中采用的pH影响对于唾液酸的凝集素的结合能力。然而在中性pH下凝集素结合到Fc片段内的唾液酸，在碱性的pH下几乎观察不到Fc片段与凝集素的结合(如实施例3中所示)。由此，当使用碱性的pH时，基于在抗体的Fab区内的唾液酸的分离成为可能，如实施例中所示。

在更优选的实施方式中，pH值在9和10之间，更优选pH是9.5。

在优选的实施方式中，凝集素是西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素。在此凝集素上的亲和层析可在碱性的或中性或甚至稍微酸性pH下进行。

在本发明的方法的另一优选的实施方式中，具有对于唾液酸化的抗体的Fab区的亲和性的亲和层析使用特异于抗体的Fab区的唾液酸化的配体进行。

根据本发明的″特异于抗体的Fab区的唾液酸化的配体″是如下配体，其首先，特异性结合唾液酸及，其次，特异性结合在Fab区内的唾液酸，但不结合含于抗体的任何其他区的唾液酸。所述特异性配体可通过本领域技术人员熟知的方法得到，例如使用根据分子识别的原理合成产生的受体分子。受体分子通过识别物质混合物中具有期望的糖基化模式(例如唾液酸化)的蛋白斑点靶蛋白，同时在各结合位点结合其及在三级结构中物理上包括其。其后，靶蛋白通过改变洗脱缓冲液的pH值或盐浓度再次释放。

在更优选的实施方式中，特异于抗体的Fab区的唾液酸化的配体选自例如通过组合化学和配体筛选得到的合成产生的配体(Still WC，Acc.Chem.Res.29，155，1996.Brady P，Chem.Soc.Rev.26，327，1997.Patterson S，Tetrahedron Lett.39，3111，1998)。

在本发明的方法的更优选的实施方式中，亲和层析对于唾液酸化的抗体的Fc区相比对于唾液酸化的抗体的Fab区具有更低亲和性，即亲和性对于Fab唾液酸化的选择性的，其强过对于Fc唾液酸化。由此，本发明的方法中采用的亲和性基质将优先结合含于抗体的Fab区内的唾液酸，但不，或仅更小的程度，结合含于抗体的Fc区内的唾液酸。因而，由于分离基于Fab唾液酸化，在步骤(b-ii)中得到的抗体群相比对于具有Fc唾液酸化的抗体，对于Fab唾液酸化的抗体更富集，且，类似地，在步骤(b-i)中得到的抗体群对于无或几乎无Fab唾液酸化的抗体更富集，无关于它们的Fc唾液酸化。优选，当测量总糖肽的％唾液酸化的糖肽时，Fc唾液酸化将差异少于100％，更优选少于50％，甚至更优选少于30％，最优选少于20％。

本发明还涉及抗体群，其中抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化。

确定是否抗体群相比富集之前的抗体制备物，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化可如上所述进行。改变的量的唾液酸化被认为是在目前可用的方法的多血症的检测限之内的不同于IVIG的唾液酸化的量的任何唾液酸化的量。优选，抗体群的唾液酸化的量相比富集之前的抗体制备物中的抗体Fab区内的唾液酸化的量是至少1.25倍更高或更低，更优选至少1.5倍更高或更低，更优选至少2倍更高或更低例如至少3倍或至少4倍更高或更低。更优选地，唾液酸化的量相比富集之前的抗体制备物中的抗体Fab区内的唾液酸化的量是至少5倍更高或更低。如上所述，术语″倍更高或更低″指相比富集之前的抗体制备物中的唾液酸的量相对增加或减少。

在本发明的相比富集之前的抗体制备物在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化的抗体群的优选的实施方式中，抗体群是血浆免疫球蛋白G制备物。

在更优选的实施方式中，血浆免疫球蛋白G制备物是人血浆免疫球蛋白G制备物。

在本发明的抗体群或本发明的方法的优选实施方式中，抗体的Fab区内唾液酸化的量经进一步改变。

在此实施方式中，唾液酸化的量改变至得到在抗体的Fab区内的唾液酸化进一步增加或减少，导致相应抗体群的总体唾液酸化的量的进一步改变。在抗体的Fab区内唾液酸的量的增加以及降低均考虑。优选是，当本发明的抗体群在抗体的Fab区内具有增加的量的唾液酸时，进一步改变是在抗体的Fab区内唾液酸的量的额外的增加。也优选是，当本发明的抗体群在抗体的Fab区内具有降低的唾液酸的量时，进一步改变是在抗体的Fab区内唾液酸的量的额外的降低。

在此实施方式中也考虑唾液酸化模式，即唾液酸的类型和/或它们在抗体的Fab区内的位置被进一步改变。

在更优选的实施方式中，唾液酸化模式的改变以酶学方式实现。

酶促改变可，例如，通过使用唾液酸转移酶及唾液酸的供体进行，以便增加在抗体的Fab区内的唾液酸的量。或者，在抗体的Fab区内的唾液酸的量的降低可例如，通过使用唾液酸酶达到，由此去除唾液酸。

唾液酸转移酶的非限制例是ST3Gal III，也称为α-(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)，及α-(2，6)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.1)。α-(2，3)唾液酸转移酶催化唾液酸向Gal-β-1，3GlcNAc或Gal-β-1，4GlcNAc糖苷的Gal的转移(Wen et al.，J.Biol.Chem.267：21011(1992)；Van denEijnden et al.，J.BioI.Chem.256：3159(1991))，并负责糖肽中天冬酰胺-连接的寡糖的唾液酸化。α-(2，6)唾液酸转移酶的活性产生6-唾液酸化的寡糖，包括6-唾液酸化的半乳糖。存在不同形式的α-(2，6)唾液酸转移酶，并可从不同的组织分离，或可使用重组技术产生。

唾液酸酶(也称为神经氨酸酶，N-乙酰神经氨酸糖原水解酶)的非限制例是唾液酸酶Au，α-(2-3，6，8，9)(EC 3.2.1.18)；唾液酸酶Cp，α-(2-3，6)(EC3.5.1.18)及唾液酸酶Spα-(2-3)(EC 3.5.1.18)。

为了达到选择性在抗体的Fab区内唾液酸化量的改变，抗体的Fc区可通过任何本领域已知的各种方法被保护免于酶活性。例如，可采用特异性Fc-结合配体来掩盖Fc区。所述Fc-特异性配体的非限制例包括化学合成的配体，例如以上描述的那些，或生物学配体，例如可溶性Fc受体，Fc特异性抗体或蛋白A/G。

此外，可改变细胞培养条件来改变细胞培养中产生的抗体的唾液酸化的量。例如，当产率降低，及同渗质量摩尔浓度通常维持在跨约250mOsm～约450mOsm时，得到增加的量的唾液酸。此和其他适宜细胞培养条件描述于，例如，美国专利No.6,656,466。此外，已被Patel等人报告，(Patel等人，Biochem J，285，839-845(1992))，如果抗体作为腹水或在无血清或含血清培养基中产生时，连接抗体的糖侧链中唾液酸的含量显著不同。而且，也显示，细胞生长中不同的生物反应器的使用和培养基中溶解的氧的量影响连接抗体的糖部分中半乳糖及唾液酸的量(Kunkel等人，Biotechnol.Prog.，1.6，462～470(2000))。

在本发明的抗体群或本发明的方法的另一优选的实施方式中，唾液酸化的量的改变是Fab区内的唾液酸化的量的减少，如上所述。

在本发明的抗体群或本发明的方法的另一优选的实施方式中，唾液酸化的量的改变是Fab区内的唾液酸化的量的增加，如上所述。

本发明还涉及用于医学的本发明的抗体群。

本发明还涉及用于治疗炎症病情的本发明的抗体群，所述炎症病情例如自身免疫疾病和/或神经退行性疾病，例如类风湿性关节炎，全身性红斑狼疮(SLE)，抗磷脂综合征，免疫血小板减少症(ITP)，川崎病，Guillain Barré综合征(GBS)，多发性硬化(MS)，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)，皮肤发疱病，皮肌炎，多发性肌炎，阿尔茨海默病，帕金森病，与唐氏综合征相关的阿尔茨海默病，脑淀粉样血管病，痴呆伴列维小体，额颞叶退化或血管性痴呆。优选，用于这些病情的抗体群在Fab区具有增加的唾液酸含量。

如实施例6中所示，在抗体的Fab区内具有改变的量的唾液酸化的抗体群可，例如，用于治疗疾病，如动脉粥样硬化。

本发明也涉及包括本发明的抗体群的组合物。

根据本发明的术语″组合物″涉及组合物，其包括至少从抗体制备物富集的抗体群，其中富集的抗体群相比富集之前的抗体制备物在抗体的Fab区内具有改变的唾液酸化模式；或其包括至少抗体群，其中抗体群相比富集之前的抗体制备物在抗体的Fab区内具有改变的唾液酸化模式。组合物可，任选，还包括能改变本发明的抗体群的特征的分子，由此，例如，降低，稳定，延迟，调节和/或活化抗体的功能。组合物可为固体，或液体形式，且可，特别，为(a)粉剂，(a)片剂，(a)溶液或(an)气雾剂形式。

在优选的实施方式中，组合物本发明的是药物组合物，其任选还包括药学可接受的载体，赋形剂和/或稀释剂。

根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于施用给患者，优选人患者的组合物。本发明的药物组合物包括如上所述的抗体群。药物组合物本发明的可，任选和额外地，包括药学可接受的载体。说道“药学可接受的载体”是指任何类型的非毒性固体，半固体或液体填料，稀释剂，包裹材料或辅助制剂。适宜药物载体的例为本领域熟知，且包括氯化钠溶液，磷酸盐缓冲的氯化钠溶液，水，乳剂，例如油/水乳剂，各类型的润湿剂，无菌溶液，有机酸溶剂等。优选载体是肠胃外载体，更优选与受者血等渗的溶液。载体适宜地含小量的添加剂，例如增强等渗性及化学稳定性的物质。所述物质在采用的剂量和浓度对于受者是非毒性的，及包括缓冲液，例如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸，及其他有机酸或它们的盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)(聚)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白，例如血清白蛋白，明胶或还是免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；对离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如聚山梨酯，泊洛沙姆或PEG。

包括所述载体的组合物可通过熟知的常规方法配制。通常，制剂通过使药物组合物成分均匀及密切地与液体载体或细分的固体载体或两者接触来制备。然后，如果必需，产物成形为期望的制剂。

可将这些药物组合物以适宜剂量施用于受试者。由主治医师和临床因素决定剂量方案。如医学领域所熟知，任何一位患者的剂量依赖于许多因素，包括患者的大小，身体表面积，年龄，待施用的特定化合物，性别，施用时间和途径，一般健康和同时施用的其他药物。对于给定情况的治疗有效量通过常规实验容易确定，且在普通的临床医师或医师的技能和判断之内。药物组合物可用于施用一次，或用于经延长的时间规则施用。通常，药物组合物的施用对于单个剂量，应在例如10μg/kg体重～2g/kg体重范围内。但是，对于单个剂量，更优选的剂量可在100μg/kg～1.5g/kg体重范围内，甚至更优选1mg/kg～1g/kg体重和甚至更优选10mg/kg～500mg/kg体重。本发明的药物组合物的施用可通过不同的方式实现，例如，通过静脉内，腹膜内，皮下，肌内，真皮内，口服，鼻内或支气管内施用。

待用于治疗性施用的药物组合物的成分必需无菌。无菌性通过利用无菌过滤膜(例如，0.2μm膜)的过滤容易实现。

通常将药物组合物的成分储存于单元或多-剂量容器中，例如，密封的安瓿或瓶，作为水溶液或作为用于再构成的冷冻干燥的制剂。作为冷冻干燥的制剂的例，10ml瓶填充有5ml的无菌过滤的1％(w/v)水溶液，并将得到的混合物冷冻干燥。通过使用抑菌注射用水复原冷冻干燥的化合物来制备输注溶液。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如，例如，抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等。药物组合物可依赖于药物组合物的期望的用途包括其他制剂。

药物组合物可尤其有用于治疗疾病，优选以下公开的疾病。

本发明也涉及本发明的抗体群用于预防和/或治疗动脉粥样硬化，癌和感染例如细菌，病毒或真菌感染。

根据本发明，″动脉粥样硬化″指影响动脉血管的慢性疾病。其为动脉壁中的慢性炎症应答，大部分由于巨噬细胞白细胞的蓄积，并被低密度脂蛋白促进，无脂肪和胆甾醇通过有功能的高密度脂蛋白(HDL)从巨噬细胞充分去除。其由动脉内的多个噬斑的形成导致。发炎在动脉粥样硬化的全部阶段是中心，且涉及先天性和适应性免疫-炎症机理。疾病进展相关于针对氧化的脂蛋白的自身抗体的形成和循环细胞因子和炎症标记物的增加。

根据本发明的″癌″指一类疾病或病症表征为不受控的细胞分化和这些通过经侵入直接生长到相邻组织，或通过经转移(其中癌细胞通过血流或淋巴系统运输)移植到远方位点而扩展的能力。

根据本发明，″感染″是宿主生物被外源物种的有害定居。在感染中，感染生物企图利用宿主的资源以便倍增(通常消耗宿主)。宿主针对感染的应答是发炎。

细菌感染，根据本发明包括但不限于细菌脑膜炎，霍乱，白喉，利斯特菌病，百日咳(Whooping Cough)，肺炎球菌肺炎，沙门氏菌病，破伤风，斑疹伤寒，结核，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或尿道感染。

病毒感染，根据本发明包括但不限于单核细胞增多症，AIDS，鸡痘，普通感冒，巨细胞病毒感染，登革热，埃博拉出血热，手足口病，肝炎，流感，风疹，脊髓灰质炎，狂犬病，天花，病毒脑炎，病毒胃肠炎，病毒脑炎，病毒脑膜炎，病毒肺炎或黄热病。

真菌感染根据本发明包括但不限于曲霉菌病，芽生菌病，念珠菌病，球孢菌病，隐球菌病，组织胞浆菌病或脚癣。

尤其优选是，本发明的抗体群可用于预防和/或治疗例如由于发生抗生素抗性而传统治疗方案难以治疗的感染。

本发明还涉及用于治疗炎症病情的本发明的抗体群，所述炎症病情例如自身免疫疾病和/或神经退行性疾病，例如类风湿性关节炎，全身性红斑狼疮(SLE)，抗磷脂综合征，免疫血小板减少症(ITP)，川崎病，Guillain Barré综合征(GBS)，多发性硬化(MS)，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)，皮肤发疱病，皮肌炎，多发性肌炎，阿尔茨海默病，帕金森病，与唐氏综合征相关的阿尔茨海默病，脑淀粉样血管病，痴呆伴列维小体，额颞叶退化或血管性痴呆。优选，用于这些病情的抗体群在Fab区具有增加的唾液酸含量。

术语“炎症病情”指与发炎相关的异常，其成为大量人疾病的基础。发炎是针对有害的刺激的复合物生物学应答，及身体去除有害的刺激和起始治愈的努力。但是，异常可发生，导致炎症病情，例如慢性发炎或自身免疫疾病。

术语“自身免疫疾病”指免疫系统攻击自身-抗原的病情。例包括类风湿性关节炎，多发性硬化，狼疮，重症肌无力，银屑病。

术语“神经退行性疾病”指观察到神经元的结构或功能的进行性损失(包括神经元的死亡)的病情。神经退行性疾病的例包括阿尔茨海默病，帕金森病，多发性硬化，亨廷顿病。

本文中描述的全部疾病为本领域技术人员熟知，且根据现有技术和本领域技术人员的公知常识定义。

对于用于预防和/或治疗动脉粥样硬化而言，尤其优选使用在抗体的Fab区内具有降低的唾液酸的量的抗体群。

图显示：

图1：使用凝集素亲和层析(SNA)的IVIG的分级分离。显示典型的层析谱(A)。IgG中的总唾液酸含量在用SDS-PAGE分离期间，使用非还原性条件(B和C)或还原性条件(D)，用凝集素印迹监控。显示了考马斯染色的凝胶(B)和SNA-生物素探查的印迹(C和D)。可检测重和轻链唾液酸化(D)。

图2：通过LC-MS分析测量IVIG中唾液酸化的N-聚糖(如实施例2和4中所述)。对于不同的IVIG级分计算总N-聚糖，Fc-特异性糖肽及F(ab’)₂-聚糖的相对量。F(ab’)₂-聚糖由IVIG，-SA IVIG和+SA IVIG通过胃蛋白酶消化产生。

图3：不同的凝集素亲和层析条件的比较。来自IVIG的Fc片段的凝集素印迹分析在pH7.5(A)或pH9.5(B)使用凝集素亲和层析分离。Fc FT：装载的Fc(唾液酸耗竭的级分；-SA Fc)；FcE：洗出液(唾液酸富集的级分；+SA Fc)的流通。

图4：来源及分级的F(ab′)₂片段的聚糖特征。使用凝集素亲和层析分离来自IVIG的F(ab′)₂片段。通过PNGaseF消化从F(ab′)₂释放聚糖，通过C18层析纯化，转变为糖醇，并且用LC-MS以阴性模式，在Agilent Q-TOF上使用用于聚糖分离的石墨化的碳HPLC柱分析。

图5：F(ab′)₂中特异性抗体及唾液酸的分布。基于凝集素的分离中Fab唾液酸化的贡献通过由来自IVIG的F(ab′)₂片段产生的+/-SA级分的表征来确定。使用商业ELISA试剂盒测量相对抗-B19病毒滴度/g F(ab’)₂，并标准化于来自IVIG的F(ab’)₂(A)。从F(ab′)₂级分的LC-MS分析(B)和从用HPLC的释放唾液酸的酸的定量/IgG(Mol/Mol)(C)计算唾液酸化的N-聚糖的相对量。

图6：特异性抗体向唾液酸富集的对比耗竭的IVIG级分中的分布。使用商业ELISA试剂盒测试特异性抗体对于巨细胞病毒(CMV)，破伤风毒素(TetTox)，B19病毒(B19V)，风疹和麻疹的分布(小图A)。通过FACS分析使用荧光-标记的抗人IgG第二抗体测量结合兔，羊和人红细胞。

图7：在自用总IVIG，‘IVIG+SA’或‘IVIG-SA’处理的小鼠和对照小鼠(‘PBS’)中主动脉瓣前尖的外形200，400，600和800μm测量损伤密度。损伤密度代表损伤占据主动脉交叉-截面积的百分率。左上部和右图相当，但是在右图分析的4个水平的平均值。图下的表：Fischer posthoc测试。S：统计学显著。

图8：通过就在Fab区内通过在西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素上亲和层析增加的(+SA)或降低的(-SA)唾液酸化富集的IVIG或相应F(ab’)₂片段级分的由用(a)TLR7激动剂洛索立宾(200μM)刺激的外周血单核细胞的干扰素-α(IFN-α)产生的抑制。

【实施例】

以下实施例旨在阐述但不旨在限制本发明。

【实施例1：使用2，6唾液酸特异性西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)的IVIG的分级分离】

将100ml tris-缓冲的盐水(TBS)中的1g IVIG，pH9～10的0.1mMCaCl₂在100ml西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)柱上再循环1h。流通伴随收集100ml TBS/CaCl₂洗涤。用2×200ml的TBS洗涤后，结合到SNA柱的级分(+SA IVIG)用200ml的0.2M乙酸中的0.5M乳糖洗脱。在柱上运行第2次流通级分，以获得-SA IVIG(图1)。

用SDS-PAGE(非还原性条件)和凝集素印迹监控IgG中的总唾液酸含量(图1)。将得到的IVIG级分用SDS-PAGE使用Nupage 10％BisTris胶分离。将凝胶用考马斯染色，并印迹到硝酸纤维素。将印迹用生物素-SNA和AP-链霉亲和素探查，并用发色底物可视化。在图1D中，用SDS-PAGE在还原性条件下分离重和轻链。在用SNA-生物素探查的凝集素印迹中，两条链明显可见，表明轻链唾液酸化。因此，在+SA IVIG中可检测到显著的Fab唾液酸化。

【唾液酸的定量】

通过酸性水解释放唾液酸，并用1，2-二氨基-4，5-亚甲基二氧基苯二盐酸盐(DMB)进行衍生化。用反相高效液相层析(RP-HPLC)使用N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)作为标准进行定量，并表示为唾液酸/IgG(重量/重量或Mol/Mol)。

用此方法观察到，相比分离之前的IVIG的+SA IVIG中总唾液酸的5倍增加和-SA IVIG中总唾液酸的2倍降低/IgG(Mol/Mol)(数据未显示)。

【实施例2：聚糖分析】

为了研究分离前和后的IVIG的糖基化特征，鉴定及表征源于典型的IVIG制备物的Fc区的胰蛋白酶糖肽，及通过聚糖释放和分析表征IVIG的总N-聚糖群。

【方法】

【(a)通过肽定位的IgG1和IgG2/3 Fc聚糖特征的确定】

胰蛋白酶消化后通过液相层析-质量光谱法(LC-MS)分析IVIG样品，以测定特异于IgG1和IgG2/3 Fc区的聚糖特征。监控IgG2 Fc区的糖肽也可见于IgG3 Fc区，因此它们被称为IgG2/3。基于血清中IgG亚类的已知的相对丰度，对于IgG2/3肽见到的大部分信号期望源于IgG2分子。变性，还原(用胍鎓-HCl和DTT加热)和烷基化(用碘乙酰胺)然后是使用1∶50的酶对底物比的胰蛋白酶消化。在C18固相提取(SPE)旋柱上分离和纯化胰蛋白酶肽，及在管中在真空下干燥。在Agilent Q-TOF系统上使用用于肽分离的Agilent Proshell300SB-C18柱进行LC-MS分析。对于各IgG1和IgG2/3糖肽总和[M+2H]2+和[M+3H]3+信号并使用预测的结构的计算的单同位素质量提取和整合层析谱。分析数据，并使用Agilent MassHunter软件，B.02.00版(Huddleston et al.Anal Chem 65，877，1993)处理。

【IgG糖肽的鉴定】

胰蛋白酶消化的LC-MS分析产生复合物层析谱。为了鉴定潜在糖肽，从Entrez蛋白数据库获得IgG亚类1～4的重链恒定区的序列(登录号分别No.12054072，12054074，12054076和12054078)。电子消化序列。表1所列的肽通过N-连接的糖基化共有序列的存在鉴定为潜在糖肽。也计算偶联到常见的IgG聚糖G0F的这些肽的理论重量，及预测的[M+3H]3+离子。

表1.来自4种IgG亚类的预测的糖肽的列表。N-连接的糖基化共有序列以粗体亮显。给出裸肽，连接到G0F聚糖的肽，及[M+3H]3+离子的计算的单同位素质量。

＊样品制备期间用碘乙酰胺处理样品。含半胱氨酸的肽的计算的质量包括一个羧酰胺甲基的质量，以解释此处理。

【(b)全局聚糖特征的确定】

如下分析样品，以测定全局聚糖特征。将源于250μg的各样品的干燥的胰蛋白酶肽在50μL 100mM NH₄HCO₃中复原，并与250U N-糖苷酶F(PNGase F)于37℃温育过夜。进行第二C18 SPE纯化，以从释放的聚糖分离去糖基化的胰蛋白酶肽。将释放的聚糖使用碱性的硼氢化钠溶液转变为糖醇，于45℃温育过夜。分解其余硼氢化物后，将聚糖糖醇在Dowex 50 WX4-400离子交换树脂旋柱上脱盐和干燥。使用重复的添加和蒸发甲醇中的1％乙酸来去除其余硼酸。在起始的移动相(10mM NH₄HCO₃)中复原聚糖糖醇，并以一式两份通过LC-MS以阴性模式分析。在石墨化的碳高效HPLC柱上使用10mMNH₄HCO₃/乙腈移动相系统进行聚糖分离。提取层析谱，并整合各聚糖，总和来自聚糖糖醇的[M-1H]1-，[M-2H]2-及[M-3H]3-信号的信号。聚糖糖醇的制备和分析类似于之前报告的工作(Karlsson et al.Rapid Commun Mass Spectrom 18，2282，2004)。

【结果】

相比IVIG及-SA IVIG，在+SA IVIG中Fc中的唾液酸化水平不显著更高。如图2中所示，Fc区中总糖肽的％唾液酸化的糖肽变化仅少于20％，即从总糖肽的10.3％到12.1％)。另一方面，总N-聚糖的唾液酸化水平，包括Fab和Fc区中的唾液酸化，在+SA IVIG级分中显著更高(图2)：其增加几乎70％，即从总聚糖的50.0％到84.5％。基于这些结果，可总结，更高分别更低唾液酸化水平主要由于在IVIG的Fab区内不同的唾液酸化。

总之，实施例1中描述的分级分离方法产生相比来源IgG制备物(IVIG)更高唾液酸化(+SA IVIG)或更低唾液酸化(-SA IVIG)的IgG制备物。观察到的更高唾液酸化水平主要由于在IgG的Fab区内更高唾液酸含量。

【实施例3：在pH7.5或9.5的凝集素亲和层析的比较】

为了比较应用于凝集素亲和层析的不同的pH条件对于唾液酸化的Fc的结合亲和力的效应，将IVIG用木瓜蛋白酶消化(木瓜胶乳，0.7U/mg IgG于37℃持续2小时)。Fc片段使用蛋白A，大小排阻层析(SEC)和蛋白L纯化(如描述于，例如，Current protocols inImmunology：Unit 2.7and 2.8(Andrew et al)John Wiley and Sons(1997))。将由IVIG产生的Fc片段装载到SNA柱，并使用如上所述的方法分离，除了使用pH7.5或pH9.5的TBS之外。将相等份的得到的级分用SDS-PAGE(Nupage 10％BisTris胶)分离，并印迹到硝酸纤维素，将印迹用生物素-SNA和AP-链霉亲和素探查，并用发色底物可视化(图3)。

在中性pH(pH7.5)进行凝集素层析导致唾液酸化的Fc片段的显著的富集(图3A，洗出液，E)。另一方面，使用碱性条件(pH9.5)导致几乎不可检测的量的更高唾液酸化的Fc，如图3B中所示(洗出液，E)。这些发现与实施例2的结果一致，其中可检测到+SA级分和-SA级分之间的Fc唾液酸化无显著的差异。随着碱性pH条件的使用，导致对于唾液酸化的Fc的凝集素层析中非常低的结合亲和力，但尽管如此，总N-聚糖的增加的唾液酸化水平，这表明此唾液酸化在Fab区内。

此外，此实验显示，当将分离的Fc片段使用凝集素亲和层析分离时，这产生相比完整的IgG分子分离具有不同的Fc-唾液酸化水平的级分。此可用凝集素结合Fab区的缺失解释。

【实施例4：F(ab’)₂和+/-SA F(ab’)₂的聚糖分析】

F(ab′)₂通过IVIG的胃蛋白酶消化产生。将IVIG于37℃用乙酸盐缓冲液(pH4.0)中的胃蛋白酶(0.5mg/g IVIG)消化2小时。②的通过添加2M Tris碱停止反应，直到达到pH8。使用Centricon(30’000Mw截止值)进行从小的消化产物浓缩和纯化和与PBS缓冲液交换(如描述于，例如，Current protocols in Immunology：Unit 2.7 and2.8(Andrew et al)John Wiley and Sons(1997))。通过凝集素亲和层析使用SNA-琼脂糖产生唾液酸富集的和耗竭的F(ab′)₂。将F(ab’)₂(12ml TBS中80mg，0.1mM CaCl₂，pH9.5)在12ml的SNA-琼脂糖上装载1小时。收集流通级分，并命名为-SA F(ab′)₂。用2×的24ml的TBS洗涤后，将+SA F(ab′)₂级分用24ml的0.2M乙酸中的0.5M乳糖洗脱。

胰蛋白酶消化后通过LC-MS分析样品。物质的变性，还原和烷基化然后是如上所述的胰蛋白酶消化。如上所述分析样品(实施例2)以测定全局聚糖特征。

【全-IVIG聚糖和F(ab′)₂聚糖的表征】

聚糖释放和转变为糖醇后对于样品进行16种不同的聚糖种的相对定量。一般而言，凝集素-结合级分显示，相比未分级的样品，非唾液酸化的聚糖降低和唾液酸化的聚糖增加。相反，未结合的级分相比未分级的样品在唾液酸化的聚糖中更低和在非唾液酸化的聚糖中更高。凝集素-结合F(ab′)₂几乎不含非唾液酸化的聚糖。(图4，图5B和C)

【F(ab′)₂中特异性抗体及唾液酸的分布】

基于凝集素的分离中Fab唾液酸化的贡献通过由来自IVIG的F(ab′)₂片段产生的+/-SA级分的表征来确定。在+SA F(ab′)₂中，用LC-MS分析观察到更高相对唾液酸化的量的N-聚糖，且当用HPLC定量释放唾液酸的酸时检测到更高量的总唾液酸(Figue 5B和C)。抗-B19病毒滴度的差异表明+SA对比-SA F(ab′)₂级分具有不同的抗原识别模式(图5A)。

【实施例5：特异性抗体向IVIG的唾液酸富集的对比耗竭的级分中的分布】

使用商业ELISA试剂盒测量对于巨细胞病毒(CMV)，破伤风毒素(TetTox)，B19病毒(B19V)，风疹及麻疹的特异性抗体的分布(图6A)。通过FACS分析使用荧光-标记的和抗人IgG第二抗体测量与兔，羊和人红细胞的结合。

结果显示，不同的相对抗体滴度见于对于测量的抗原/g IgG的3种IVIG级分(图6)。在不同的临床应用中使用+SA IVIG或-SA IVIG级分，此IVIG级分的抗原识别模式中的差异可导致增强的效应。

【实施例6：富集Fab的唾液酸化的IVIG级分与耗竭Fab的唾液酸化的IVIG级分的动脉粥样化调节活性的体内比较】

动脉粥样硬化是涉及先天性和适应性免疫炎症机理的动脉壁的慢性疾病。发炎在动脉粥样硬化的全部阶段是中心。当内皮活化时其牵涉早期脂纹的形成，且表达趋化因子，且粘接分子导致单核细胞/淋巴细胞募集和浸润到内皮下膜。其也作用于不利的临床血管事件的起始，当噬斑内活化的细胞分泌降解细胞外基质蛋白及减弱纤维帽的基质蛋白酶时，导致破裂及血栓形成。疾病进展相关于针对氧化的脂蛋白的自身抗体的形成和循环细胞因子和炎症标记物的增加。

【动脉粥样硬化和IVIG】

多克隆免疫球蛋白制备物(IVIG)抑制动脉粥样硬化(Nicoletti，Clin.Invest.102：910-918，1998)。在先天性和适应性免疫起到中枢作用的载质蛋白E敲除(ApoE KO)小鼠，胆甾醇-诱导的动脉粥样硬化的遗传模型中进行展示。显示，5天期间用IVIG注射7周龄的雄性apo E敲除小鼠，使经2-mo时期胆甾醇摄食的脂纹形成减少35％。通过摄食处理4个月诱导的纤维脂肪损伤在摄食2个月后接受IVIG的小鼠中减少50％。而这些结果已确证及被几个研究组查看，IVIG赋予动脉硬化保护的精确的机理仍不甚清楚。

【材料和方法】

使用如上实施例1所述得到的IVIG的3种制备物：总IVIG(‘IVIG总’)，唾液酸富集的IVIG级分(‘IVIG+SA’)及唾液酸耗竭的IVIG级分(‘IVIG-SA’)。将这些制备物以10mg/小鼠/注射的剂量腹膜内注射。小鼠(6～7周龄)连续5日接受注射。在对照小鼠中注射盐水(‘PBS’)。总共，每小鼠组包括10个ApoE KO小鼠(n＝10/组)。首次注射2个月后处死小鼠。注意到小鼠响应任何注射的产物无异常反应。

【结果】

在主动脉根水平评定动脉粥样硬化发展。主动脉的总表面积无统计学差异表明IVIG注射不诱导主要血管重塑。但是，在用IVIG制备物处理的小鼠中损伤尺寸显著降低。赋予了类似保护的总IVIG和IVIG+SA以平均25％降低这些小鼠组中的损伤密度。接受更低-唾液酸化的IVIG(IVIG-SA)制备物的小鼠多数被保护和发展了对照尺寸的一半的损伤(图7)。

【实施例7：Fab唾液酸化对体外细胞刺激测定中测试的抗-炎症活性的效应】

在各种自身免疫和神经退行性疾病中，炎症病情与疾病相关。在体外细胞培养测定中，对体内观察到的炎症病情建模，以测试不同的唾液酸富集的和耗竭的IVIG和Fab级分的抗-炎症活性。

许多全身性红斑狼疮(SLE)患者具有与疾病活性和严重性相关的I型“IFN签名”(Bengtsson et al，(2000)Lupus 9(9)664-671)。含RNA或DNA核蛋白的免疫复合物(IC)可被胞吞，以刺激Toll-样受体(TLR 7，9)，导致IFN-α产生(Vollmer et al(2005)J.Exp.Med.2002(11)，1575-1585)。在此实验中，目标是确定在人细胞的TLR7/TLR9刺激后唾液酸化的(SA+)IgG是否和如何调节IFN-α产生。

通过在Ficoll-Paque(Amersham Biosciences)上的密度-梯度离心从健康自愿者的肝素化的静脉血分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC培养物(在96-孔圆底组织培养板中5×10⁵/孔，Nunc，总体积150μL)用洛索立宾(200μM，Invivogen)或CpG 2216(200nM，Invivogen)刺激，并用IVIG(如实施例1中所述的富集的或耗竭的唾液酸化的级分)或相应F(ab’)₂部分以500μg/ml浓度的IgG或等摩尔量的F(ab’)₂片段(333μg/ml F(ab’)₂)处理。20±2h后收集上清，且通过室内ELISA使用可商购的抗体如所述定量IFN-α(Santer et al.，(2009)J.Immunol 182，1192-1201)。结果表示为相对于未接受IVIG处理的细胞的IFN-α的抑制的百分率。

可见到，以等摩尔浓度F(ab’)₂制备物给出与它们的全IgG对应物相同的水平的抑制(或或许甚至稍更抑制)，表明其为负责更大的IFN-α抑制的具有增加的唾液酸化的Fab部分。

【实施例8：使用人单核细胞细胞系U937的Fab唾液酸化对体外抗-炎症活性的效应】

根据由ATCC提供的使用说明在培养物中生长U937细胞(ATCC)。在用视黄酸(0.5μM)及/或维生素D实验的前一天分化细胞。

通过以400×g离心和用含1％人白蛋白的PBS重悬浮来收获分化的U937细胞。然后将细胞用50～500U的干扰素-γ(IFNγ)或0.1～2μg植物凝集素(PHA)刺激。在刺激期间或添加刺激制剂之前将唾液酸增强的和耗竭的IVIG和其片段加入细胞。

于37℃温育20+/-2h后，通过利用对于来自Becton Dickinson(BDBiosciences)的人炎症细胞因子的商业ELISA试剂盒或珠阵列测量上清中的炎症标记物来监控刺激。使用ELISA试剂盒(Biosource/Demeditec diagnostics)测量IL-8及新蝶呤。

通过FACS分析使用对于BD FACS CantoII(BD Bioscience)的荧光标记的抗体(BD Pharmingen)定量表面标记物(CD54，CD14，CD45)。

相比未分级的IVIG和相应F(ab’)₂片段，观察到通过+SAIVIG级分和通过等摩尔量的由+SA级分制备的F(ab’)₂片段的炎症标记物的减少，表明免疫球蛋白的抗-炎症性质就在Fab区内增加的唾液酸化富集。

【实施例9：单核细胞来源的树突细胞(moDC)刺激测定】

【人单核细胞的分离和未成熟的单核细胞-来源的树突细胞(iMoDC)的分化】

从血沉棕黄层(Blutspendedienst SRK，Bern，CH)(含一个供体的全血捐助的细胞部分)通过密度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。将血沉棕黄层在PBS中1/1稀释。将25ml的稀释的血沉棕黄层装于15ml Ficoll Plaque(GE Healthcare Europe GmbH，Otelfingen，CH)，并离心35min(RT，400g，无半途停止)。收集和合并含PBMC的细胞层。洗涤后(在50ml PBS中两次)，将单核细胞通过磁性细胞分选(MACS)使用CD14-MACS珠(Miltenyi Biotech GmbH，BergischGladbach，GER)分离。在MACS缓冲液(PBS，0.5％BSA，2mMEDTA)中取正确的数的PBMC(10×需要的单核细胞数)，并与抗-CD14mAb-包被的MACS珠(80μl/10⁷ PBMC；Miltenyi BiotechGmbH)在冰上温育20min(避光)。用MACS缓冲液洗涤后(以200g离心10min)，将珠-标记的细胞装于预先洗涤的(3ml MACS缓冲液)LS MACS柱(Miltenyi Biotech GmbH)，洗涤(用3ml MACS缓冲液3次)，并在将柱从磁场移开后用5ml MACS缓冲液冲洗。用PBS洗涤后，在含10％iFCS(Biochrom AG，Berlin，DE)，10`000U/ml青霉素及链霉素(Amimed，BioConcept，Allschwil，CH)和10mMHEPES的RPMI-1640中取新鲜分离的单核细胞，及以0.5×10⁶单核细胞/ml的浓度平铺于24-孔(0.5×10⁶单核细胞/孔(ml))或48-孔板(0.25×106单核细胞/孔(0.5ml))(BD Biosciences)上。通过FACS分析通过CD14染色评定分离的单核细胞的纯度。FACS分析的细节在下文中描述。

随后6天期间，单核细胞在50ng/ml GM-CSF(R&D SystemsEurope Ltd.，Abingdon，UK)和20ng/ml重组人IL-4(PeproTech ECLtd.，London UK)的存在下分化为未成熟的单核细胞-来源的树突细胞(iMoDC)。分化期间，每隔2天，去除一半培养基，并取代为完全补充的(见以上)新鲜培养基。6天后，通过光学显微镜和通过FACS分析分析细胞的DC-表型。评定CD14，DC-SIGN(CD209)，CD11c和CD1a(全部是来自BD Biosciences的单克隆Ab)的细胞表面表达。下文描述FACS分析的细节。

【新鲜分离的单核细胞，分化的iMoDC及成熟的MoDC的FACS分析】

将50μl FACS缓冲液(PBS，2％iFCS)中约60,000～100,000细胞用1～2μl的即用mAb(抗-CD14，CD11c，CD1a，DC-SIGN，HLA-DR，CD80，CD86，CD83，CD64，CD32和CD16；全部Ab是BD Biosciences的直接标记的单克隆Ab)染色和于4℃温育30min(避光)。细胞用PBS洗涤和取得50μl PBS，固定到350μl 1×BD CellFix(BDBiosciences)和避光储存于4℃，直到获取。每样品，用FACS Calibur获取10,000细胞，并通过BD CellQuest软件(both BD Biosciences)分析。

【通过免疫复合物的iMoDC的刺激】

将未成熟的(i)MoDC与不同的量的IVIG级分和F(ab’)₂片段预温育3h，如所示。将iMoDC用0.1～100μg/ml LPS刺激，如所示。将0.5×10⁶ iMoDC，在24孔板中在完全补充的RPMI(incl.50ng/mlGM-CSF&20ng/mlIL-4)中分化，于37℃与LPS温育24h，5％CO₂。就IC-介导的刺激(成熟)的分析而言，进行FACS分析和细胞因子测量。通过将它们从经移液孔底部洗去来收获细胞。收集细胞悬浮液，并立即储存在冰上。离心(300g，10min，4℃)后，收集上清，并保存于-20℃用于后续细胞因子测量。在50μl的FACS缓冲液(PBS，2％iFCS)中取细胞，并如上所述进行FACS分析。测量2种共-刺激性分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的细胞表面表达，以及DC-特异性成熟标记物CD83(全部直接标记的mAbs，BD Biosciences)。

【细胞培养上清中的细胞因子测量】

将iMoDC-刺激实验的细胞培养上清收集和保存于-20℃，直到细胞因子测量。根据制造商的使用说明通过来自Becton Dickinson(BDBiosciences)的用于人炎症细胞因子Cytometirc珠阵列(CBA)测量IL-12p70，IL-10，IL-6，IL-8，TNF-α和IL-1β。

相比未分级的IVIG和相应F(ab’)₂片段，观察到通过+SAIVIG级分和通过等摩尔量的由+SA级分制备的F(ab’)₂片段的炎症标记物的减少，表明免疫球蛋白的抗-炎症性质就在Fab区内增加的唾液酸化富集

【实施例10：在EAE小鼠模型中唾液酸化的IVIg相比常规IVIg的有利效果的评定】

可在自身免疫模型中观察到IVIG+SA的抗-炎症效应的评定，和可研究作为基础的机理。在此模型中，其显示，IVIG通过扩展调控T细胞引发其抗-炎症效应。使用EAE，进行Sial Fc，唾液酸化的F(ab’)₂，唾液酸化的完整的IVIg和IVIg之间的比较。从第0天到疾病峰或到第5天施用不同的剂量的这些制备物。测定临床分值和存活率。

EAE的诱导：小鼠的C57BL/6J株用于诱导EAE。根据对于动物实验的伦理规定进行实验。将10～12周龄雌性小鼠用在含800μg的非活力的干燥的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA的CFA(1v/1v)中乳化的200μg MOG₃₅～₅₅肽(＞95％纯度)免疫。将最终体积200μl在4个位点过侧翼皮下注射。此外，在相同的天和2天后i.v.给予300ng的百日咳毒素。利用以下评分系统每天评定EAE的临床迹象：0-无迹象；1-尾麻痹；2-后肢虚弱和尾麻痹；3-后肢和尾麻痹；4-后肢和尾麻痹和前肢虚弱；5-morbidum；6-死亡。从第10天开始观察到EAE症状及免疫约21～25天后是峰，有3的平均临床分值。

相比未分级的IVIG和相应F(ab’)₂片段，观察到通过IVIG的+SA级分和通过等摩尔量的由+SA级分制备的F(ab’)₂片段的临床症状减小，表明免疫球蛋白的抗-炎症性质就在Fab区内增加的唾液酸化富集。