法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-10-09
授权
授权
2012-09-12
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/63 申请日:20101231
实质审查的生效
2012-07-11
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及GAP启动子在调节S- 腺苷甲硫氨酸代谢途径中的应用。
背景技术
在过去的几十年里，为了提高微生物发酵产量，越来越多的基因工程手段 被应用到代谢工程中。但是大多数情况下，这些尝试都无法达到预期的效果， 有的甚至与预期的结果截然相反。在改造代谢途径的研究中，为了增加特定目 的代谢产物或构建具有过量生产能力且能应用于工业生产的工程菌，常采用过 表达限速反应步骤中相关酶和阻断目的产物分支代谢途径这两个传统的策略。
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)作为所有生物体内的重要 甲基供体，无论是在抑郁症，肝脏疾病还是关节炎治疗领域都具有良好的临床 应用价值。正因为SAM具备如此广泛的应用价值，越来越多的研究人员利用代 谢工程改变细胞的代谢途径以获得高产SAM的菌株。过表达和基因敲除这两个 基因操作手段成功地应用到了SAM高产菌的代谢工程改造中：强化S-腺苷甲硫 氨酸合成酶基因(sam1和sam2)的表达量，提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)的 活性，从而增加SAM的产量；敲除β-胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻断SAM 和L-Met在细胞内转化为半胱氨酸的途径，增加胞内SAM的积累。
野生菌中，MAT酶活是SAM产量提高的限速步骤，提高细胞内部的SAM 合成酶的酶活有利于胞内SAM的累积。有两条途径可以提高重组菌胞内的SAM 合成酶的酶活，即提高胞内SAM合成酶的量或者提高所表达的外源SAM合成酶 的比酶活。对于前者，将外源SAM合成酶基因在适合的宿主菌中进行强化表达， 通过体外添加L-Met来实现SAM的高产。已有研究者将克隆得到的S.cerevisiae 来源的sam2基因置于醇氧化酶-1(AOX1)启动子调控下，整合至毕赤酵母Pichia pastoris，获得了SAM累积量比野生株高30多倍的重组菌。而对于后者，可利 用DNA Shuffling来增强SAM合成酶的酶活。Hu(H.Hu.J.C.Qian.J.Chu.Y. Wang.Y.P.Zhuang.S.L.Zhang.DNA shuffling of methionine adenosyltransferase gene leads to improved S-adenosyl-L-methionine production in Pichia pastoris.Journal of Biotechnology.2009，141：97-103)等为了提高外源SAM 合成酶在重组毕赤酵母胞内的活力，以来源不同的三种SAM合成酶基因为出发 材料，利用DNA Shuffling技术对SAM合成酶进行体外进化。经过筛选获得了一 株整合了编码高酶活SAM合成酶基因的重组毕赤酵母菌株GS115/DS56，在摇瓶 中，GS115/DS56的胞内SAM累积量为1.64g/L，SAM合成酶的酶活达到463U/g DCW，比含来源于母本的SAM合成酶的重组菌分别提高了102％和201％，有效 改善了胞内SAM合成酶的酶活对SAM合成的限制。然而，Hu等还发现， GS115/DS56胞内的SAM合成酶的酶与出发菌株相比提高了2.8倍，但是SAM的 单位菌体产量只提高了13％，胞内SAM合成酶的酶活达到一定水平后，对合成 SAM的促进作用十分有限。实验表明单独增加限速酶量有时并不有效。在过表 达该酶的过程中还可能造成一些细胞生长必需物质的减少，菌体代谢负担加 大，或者是代谢过程所需辅因子的平衡被打破，最终相对于整个代谢网络而言 该途径的通量是减少的，这也是该方法的缺陷所在。很多研究表明，基因的适 度表达比过量表达能达到更好的效果。
将SAM分解代谢途径进行阻断是增加细胞内SAM积累的另一有效策略。敲 除β-胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻断SAM和L-Met在细胞内转化为半胱氨 酸的途径，可以实现胞内SAM积累的增加。L-Met和ATP经SAM合成酶催化反 应生成SAM，SAM通过转甲基反应很容易生成SAH，后者可以通过水解生成同 型高半胱氨酸和腺苷，同型高半胱氨酸有三个流向：一是再次甲基化形成 L-Met，二为在胱硫醚合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)的作用下和丝氨酸 化合生成胱硫醚，三为通过SAH水解酶作用逆反应生成SAH。其中第一、三流 向均为L-Met和SAM闭循环，而第二个流向由于通过CBS将巯基从同型高半胱 氨酸源源不断移出来，影响了SAM的积累浓度。细胞内若存在过量的L-Met， SAM的产量将会提高80倍(F.Schlenk.C.R.Zydek.D.J.Ehninger.J.L.Dainko. The production of S-adenosyl-L-methionine and S-adenosyl-L-ethionine by yeast. Enzymologia.1965，29：283-298)。胱硫醚β-合成酶(CBS)是细胞转硫途径的第1 个酶，催化丝氨酸和高半胧氨酸合成胱硫醚和生成水。理论上，敲除胱硫醚β- 合成酶基因(cys4)，阻断SAM和L-Met在细胞内转化为半胱氨酸的途径，可增加 L-Met合成SAM的代谢途径通量，从而提高SAM的胞内累积量。鉴于此，He等 (J.He.J.Deng.Y.Zheng.J.Gu.A synergistic effect on the production of S-adenosyl-L-methionine in Pichia pastoris by knocking in of S-adenosyl-L-methionine synthase and knocking out of cystathionine-beta synthase. J Biotechnol.2006，126：519-527)通过基因敲除的方法将过量表达SAM合成酶的 毕赤酵母菌株的CBS合成基因缺失掉，结果SAM积累量提高了两倍多，效果相 当明显；但是，将SAM分解代谢途径β-胱硫醚(CBS)完全阻断，重组菌成为营 养缺陷型，培养基中需外源添加谷胱甘肽(GSH)。因此也导致发酵成本大大提 高。虽然相对要提高的目的代谢物而言，一些支路代谢途径对于细胞生长并不 是必需的，即便完全阻断该途径也不会影响细胞的存活，但是这些代谢途径中 的一些代谢物可能用于维持细胞内的辅因子平衡，或可能调控其他代谢途径中 的代谢物。因此，去除这些旁路可能造成细胞整个代谢能力的减弱，最终也影 响到目的产物的产量提高，这也是完全阻断代谢途径的缺陷所在。
总而言之，在代谢途径中限速步骤往往是由多个基因控制的，因此成功的 代谢工程操作需要对多个基因的表达进行平衡操作才能实现目的。基于细胞内 代谢网络的复杂性，过表达限速步骤关键酶或敲除代谢支路支点的酶这两种传 统方式已远远不能满足代谢工程的要求，科研工作者越来越倾向于对细胞内的 代谢网络进行精确地控制和调节。取而代之，在一宽广的范围内实现对相关基 因的连续微调并找到最佳表达水平(最大化该代谢途径通量或目的产物的对应 基因表达水平)已成为代谢优化必不可少的手段。随后，以同样的方式优化第二、 三……个代谢物的表达水平。因此，只有对代谢途径中多个酶同时进行调控(强 化或弱化相关酶的表达)，才能实现某个代谢途径的通量的增加。这就要求在代 谢工程操作中对基因表达进行连续精细的调控。
为了实现基因表达的连续微调，也有研究人员利用诱导表达系统来调控目 的基因。无论是通过改变诱导剂的浓度来实现基因的连续微调，还是利用温度、 溶氧或pH诱导系统通过改变发酵控制参数来实现基因的微调，这些诱导系统存 在许多缺陷。利用诱导型启动子可以通过不同浓度的诱导剂在一定程度上实现 对基因不同表达强度的控制，但是诱导剂通常比较昂贵，对细胞具有一定的毒 性，而且细胞对诱导剂感应存在非均一性。发酵参数的控制(如温度、溶氧或pH 的控制)难以实现在小范围内的改变，也难以在大规模的发酵体系中快速达到设 定值。而且，诱导表达系统均无法达到基因的稳定表达。因此现有的一些诱导 系统，无论是基于化学试剂还是基于发酵控制参数，都不能实现在大规模工业 生产中基因的精确调控，也无法实现同时对多个基因连续调控。
因此，本领域目前还需要对SAM生产菌株的基因表达调控进行深入研究， 找到改变细胞的代谢途径以获得高产的新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供GAP启动子文库在调节S-腺苷甲硫氨酸分解代谢 途径中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种突变型GAP启动子文库的用途，用于调 控S-腺苷甲硫氨酸分解代谢途径，从而调节S-腺苷甲硫氨酸的产量；
其中，所述的突变型GAP启动子文库包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO： 2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的启动子。
在一个优选例中，所述的调控S-腺苷甲硫氨酸分解代谢途径为：调控S- 腺苷甲硫氨酸分解代谢途径中β-胱硫醚合成酶(CBS)的表达。
在另一优选例中，所述的突变型GAP启动子文库包括选自SEQ ID NO：2 或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的启动子，用于提高S-腺苷甲硫氨酸的产量。
在另一优选例中，所述的GAP启动子通过下调(非阻断)β-胱硫醚合成酶的 表达提高S-腺苷甲硫氨酸的产量。
在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述的构建物包括以下操作性相 连的元件(5’→3’)：β-胱硫醚合成酶的编码基因的5’侧翼序列；抗性选择标记； 选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的启动子； β-胱硫醚合成酶的编码基因。
在另一优选例中，所述的构建物用于整合到S-腺苷甲硫氨酸生产菌的基因 组中，从而调控S-腺苷甲硫氨酸分解代谢途径。
在另一优选例中，所述的β-胱硫醚合成酶的编码基因的5’侧翼序列具有 SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的β-胱硫醚合成酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在本发明的另一方面，提供一种调节S-腺苷甲硫氨酸的产量的方法，包括： 以选自突变型GAP启动子文库的启动子来调节S-腺苷甲硫氨酸生产菌的S-腺 苷甲硫氨酸分解代谢途径中β-胱硫醚合成酶的表达，从而调节S-腺苷甲硫氨酸 的产量；
其中，所述的突变型GAP启动子文库包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO： 2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的启动子。
在另一优选例中，所述方法包括：
(1)提供一种表达载体，其中包含所述的构建物；
(2)将(1)所述的表达载体转化S-腺苷甲硫氨酸生产菌，使得所述的构建物 整合到S-腺苷甲硫氨酸生产菌的基因组中，获得重组S-腺苷甲硫氨酸生产菌；
(3)培养(2)所述的重组S-腺苷甲硫氨酸生产菌，从而该菌的S-腺苷甲硫氨 酸的产量相对于基因组中未整合所述构建物的S-腺苷甲硫氨酸生产菌发生改 变。
在另一优选例中，(1)中，还包括以下元件：ori，f1 origin，以及多克隆位 点(酶切位点)，终止子；这些元件在表达载体上操作性相连。
在另一优选例中，所述的抗性选择标记选自(但不限于)：Zeocin或Kan。
在另一优选例中，选自所述的突变型GAP启动子文库的启动子包括：选 自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的启动子，其下调(非阻断)β- 胱硫醚合成酶的表达，从而提高S-腺苷甲硫氨酸的产量。
在本发明的另一方面，提供一种重组的S-腺苷甲硫氨酸生产菌，其基因组 中整合有所述的构建物。
在另一优选例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌是酵母。
在另一优选例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌是重组毕赤酵母。
在本发明的另一方面，提供一种突变型GAP启动子，所述的启动子的核 苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在本发明的另一方面，提供所述的突变型GAP启动子(如SEQ ID NO：3所 示)的用途，用于下调S-腺苷甲硫氨酸分解代谢途径中β-胱硫醚合成酶(CBS)的 表达，从而提高S-腺苷甲硫氨酸的产量。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1、毕赤酵母SAM代谢途径。
图2、启动子G0，G6和G12相对强度。
图3、CBS启动子替换载体pGAP-CBS的构建示意图。
图4、重组质粒验证图。其中，
(A)质粒pGAP-Z-TT的酶切验证。Lane1：质粒经SalI线性化验证；Lane2： 质粒经NotI和SalI双酶切验证；Lane3：DNA Marker。
(B)质粒pET-Z-TT的酶切验证。Lane1：质粒经BamHI线性化验证；Lane2： 质粒经NotI和BamHI双酶切验证；Lane3、4：DNA Marker。
(C)质粒pET-Z-TT-GAP的酶切验证。Lane2：质粒经NotI和SalI双酶切验证； Lane3：质粒经XbaI线性化验证；Lane1、4：DNA Marker。
(D)质粒pGAP-CBS的酶切验证。Lane1：质粒经XhoI和NotI双酶切验证； Lane2：质粒经EcoRI和XbaI双酶切验证；Lane3：质粒经EcoRI线性化验证；Lane4、 5：DNA Marker。
(E)质粒pG0-CBS，pG6-CBS和pG12-CBS的酶切验证；Lane1-3质粒经XbaI 线性化验证；Lane4-6：质粒经XbaI和BamHI双酶切验证；Lane7、8：DNA Marker。
图5、重组菌G0-CBS，G6-CBS和G12-CBS阳性克隆菌落PCR验证
(A)重组菌G0-CBS和G6-CBS用引物GAP F5/CBS R2进行PCR验证。 Lane1-6：重组菌G0-CBS的PCR验证；Lane7-12：重组菌G6-CBS的PCR验证； Lane13：DNA Marker。
(B)重组菌G12-CBS用引物GAP F5/CBS R2进行PCR验证。Lane1-6：重 组菌G12-CBS的PCR验证；Lane7：DNA Marker。
(C)重组菌G0-CBS和G6-CBS用引物PCBS F/TZ R进行PCR验证。Lane1-6： 重组菌G0-CBS的PCR验证；Lane8-13：重组菌G6-CBS的PCR验证；Lane7：DNA Marker。
(D)重组菌G12-CBS用引物PCBS F/TZ R进行PCR验证。Lane1-6：重组菌 G12-CBS的PCR验证；Lane7：DNA Marker。
图6、重组菌G0-CBS、G6-CBS、G12-CBS和对照菌DS16生长比较。
图7、比较重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS与对照菌DS16的SAM产量。
A：重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS与对照菌DS16的SAM单位菌体产 量比较；
B：与对照菌DS16相比重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS的SAM产量增 加百分比。
图8、重组菌G0-CBS、G6-CBS、G12-CBS和对照菌DS16的cys4 mRNA转 录水平、CBS酶活和SAM产量比较。
A：各重组菌CBS转录水平和CBS酶比酶活比较；
B：各重组菌SAM单位菌体产量和CBS酶比酶活比较。
图9、诱导前重组菌G0-CBS、DS16、G6-CBS和G12-CBS胞内L-Met水平比 较。
图10、15L发酵罐中G12-CBS和DS16的SAM产量比较。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，采用组成型启动子文库(突变型GAP启动子文 库)实现了S-腺苷甲硫氨酸分解代谢途径中基因表达的精确调控，找到了提高 S-腺苷甲硫氨酸产量的切实可行的方法。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基 因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子 提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
如本文所用，所述的“GAP启动子文库”(也称为“突变型GAP启动子文 库”)是指含有本发明的一系列突变型GAP启动子的核酸集合体。较佳地，所 述的“GAP启动子文库”包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO： 3所示核苷酸序列的启动子。
如本文所用，所述的“GAP启动子”简称为pGAP、PGAP或PG。
如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性相连”是指两个或多个 核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子被置于相对于目的基 因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启 动子被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“弱化型GAP启动子”是指相对于野生型GAP启动 子(其序列如SEQ ID NO：4所示)其调控目的基因表达的强度显著弱化，例如弱 化10％以上，较佳的弱化20％以上，更佳的弱化30％以上，如弱化50％以上、 弱化80％以上或弱化100％以上。较佳地，除非另外说明，所述的“弱化型GAP 启动子”是指SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的启动子。
如本文所用，所述的“增强型GAP启动子”是指相对于野生型GAP启动 子其调控目的基因表达的强度显著增强，例如增强10％以上，较佳的增强20％ 以上，更佳的增强30％以上，如增强50％以上、增强80％以上或增强100％以 上。其调控目的基因表达的强度可通过检测目的的基因表达量而得知，表达量 的检测是本领域技术人员熟知的技术。较佳地，除非另外说明，所述的“增强 型GAP启动子”是指SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的启动子。
如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。较佳地， 除非另外说明，所述的“目的基因”是指β-胱硫醚合成酶(CBS)。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核 酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不 是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插 入的细胞或生物体来说是“外源的”。
GAP启动子文库
为了实现对S-腺苷甲硫氨酸分解代谢途径中基因表达的连续微调，本发明 人选择了一组突变型GAP启动子，包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的启动子，构成启动子文库，各启动子调控目的基因表 达的强度呈现梯度分布，用于在不同强度下指导目的基因表达。启动子文库的 获得可保证对所调控的目的基因表达进行梯度调节，实施可控基因扰动和系统 分析。
本发明还包括具有与上述的任一种启动子序列具有80％以上，更优地选 90％以上，最优选地95％以上(如98％、99％)相同性的启动子，它们保留有与上 述启动子相同的功能以及启动目的基因表达的强度。“相同性”是指按照位置 相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同 一性)。
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因前，该目的基因相对于启 动子而言可以是外源(异源)的。所述的目的基因是S-腺苷甲硫氨酸分解代谢途 径中β-胱硫醚合成酶(CBS)。通过调节β-胱硫醚合成酶的表达强度，可以调节 SAM和L-Met在细胞内转化为半胱氨酸的途径，调节L-Met合成SAM的代谢 途径通量，从而改变SAM的胞内累积量。例如：通过弱化β-胱硫醚合成酶的 表达强度，可以弱化SAM和L-Met在细胞内转化为半胱氨酸的途径，增加L-Met 合成SAM的代谢途径通量，从而提高SAM的胞内累积量。
表达载体和宿主细胞
来自于本发明的启动子文库的任何一种启动子和/或目的基因序列可被包 含在构建物或重组表达载体中。
为了改变S-腺苷甲硫氨酸生产菌的代谢途径，使其在本发明的启动子调控 下表达CBS，本发明人设计了构建物。所述的构建物包括β-胱硫醚合成酶的编 码基因的5’侧翼序列；抗性选择标记；选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或 SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的启动子；β-胱硫醚合成酶的编码基因。所述的 构建物用于整合到S-腺苷甲硫氨酸生产菌的基因组中，从而调控S-腺苷甲硫氨 酸分解代谢途径。
当用于转化S-腺苷甲硫氨酸生产菌时，所述的构建物被包含在表达载体 中。用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。术语“表达载体” 指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。 总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。 优选的，所述的表达载体是酵母细胞适用的表达载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或 目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、 体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止 子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择 转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以 及绿色荧光蛋白(GFP)等。
重组载体中除了含有本发明的启动子和编码基因，还可含有一种或多种其 它启动子或编码基因。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或 诱导型的。
作为本发明的一种实施方式，所述的重组表达载体包括(从5’到3’方向)：β- 胱硫醚合成酶的编码基因的5’侧翼序列，pTEF，抗性选择标记(如Zeocin、Kan)， AOX1 TT，选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序 列的启动子，β-胱硫醚合成酶的编码基因，ori，抗性选择标记(如Zeocin、Kan)， f1 origin，以及多克隆位点(酶切位点)，终止子；这些元件在表达载体上操作性 相连。
所述的重组表达载体用于转化S-腺苷甲硫氨酸生产菌，获得重组S-腺苷甲 硫氨酸生产菌。作为本发明的优选方式，所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌是酵母； 更佳地，所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌是重组毕赤酵母。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当 宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后 收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选 用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿 孔、脂质体包装等。
调节S-腺苷甲硫氨酸产量的方法
本发明还提供了一种调节S-腺苷甲硫氨酸的产量的方法，包括：以选自所 述突变型GAP启动子文库的启动子来调节S-腺苷甲硫氨酸分解代谢途径中β- 胱硫醚合成酶的表达，从而调节S-腺苷甲硫氨酸的产量；其中，所述的突变型 GAP启动子文库包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示 核苷酸序列的启动子。
作为本发明的一种优选方式，所述方法包括：
(1)提供一种表达载体，其中包含所述的构建物；
(2)将(1)所述的表达载体转化S-腺苷甲硫氨酸生产菌，使得所述的构建物 整合到S-腺苷甲硫氨酸生产菌的基因组中，获得重组S-腺苷甲硫氨酸生产菌；
(3)培养(2)所述的重组S-腺苷甲硫氨酸生产菌，从而该菌的S-腺苷甲硫氨 酸的产量相对于基因组中未整合所述构建物的S-腺苷甲硫氨酸生产菌发生改 变。
组成型启动子文库应用于基因的连续微调
组成型启动子文库作为基因精确调控的新工具克服了诱导启动子的缺点， 对组成型启动子进行人工进化可以得到不同活性范围的启动子，实现单个或多 个基因同时的精细、稳定调控。代谢控制理论告诉人们：只有对代谢途径中多 个酶同时进行调控，才能实现某个代谢途径的通量的增加。因此，对于SAM代 谢的调控，不仅要调控MAT酶活水平，还要尝试在适度表达MAT的同时减少 SAM分解代谢途径的通量，以实现SAM合成的最大化。
弱化SAM分解代谢途径是增加细胞内SAM积累的另一有效策略。通过基 因敲除的方法将过量表达SAM合成酶的毕赤酵母菌株的CBS合成基因缺失 掉，结果SAM积累量提高了两倍多，效果相当显著；但是，将SAM分解代谢 途径β-胱硫醚(CBS)完全阻断，重组菌成为营养缺陷型，培养基中需外源添加 GSH。因此本发明人在此采用更合理的方案，将CBS酶活降低，以实现CBS 合成途径通量的减少，以维持细胞自身生长所必需的物质，而不是完全将CBS 酶失活以阻断转硫途径。
综上所述，用传统的基因缺失的方式阻断CBS代谢途径，并不明智，而将 其进行弱化，减少SAM的代谢通量更值得研究。因此本发明主要研究了不同 强度启动子调控CBS表达，实现CBS合成途径流量不同程度弱化，以考查其 对细胞内SAM积累的影响。本实验以整合了编码高酶活SAM合成酶基因 ds16(MAT酶活为：1.14U/mg蛋白)的重组毕赤酵母菌株GS115/DS16[1]为出发 菌株，用GAP启动子文库中弱启动子对GS115/DS16的CBS基因进行调控， 以弱化CBS途径，GAP突变启动子包括PG0，PG6，PG12，启动子强度依次降低， 构建的对应重组菌分别为G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、重组质粒pG0-CBS，pG6-CBS和pG12-CBS的构建
CBS启动子替换载体pGAP-CBS的构建过程如图3。首先以质粒pPICZ A(购 自Invitrogen)为模板，用引物TZ F/TZ R(表1)扩增带Zeocin抗性片段 TEF-Zeocin，经限制性内切酶Not I和SalI双酶切并与同样方法酶切质粒pGAPZ A连接获得重组质粒pGAP-Z-TT。重组质粒酶切验证如图4A，pGAP-Z-TT经SalI 单酶切后得到3.7kb的线性化片段；经NotI和SalI双酶切，得到961bp插入的目 的条带与2.7kb的载体片段。
重组质粒pGAP-Z-TT经Not I和BamHI双酶切后约1.2kb片段与经同样方式 酶切的质粒pET 28a连接获得重组质粒pET-Z-TT。重组质粒酶切验证如图4B。 pET-Z-TT经BamHI线性化后为6.56kb；经NotI和BamHI双酶切验证，切下目的 条带为1.2kp，余下载体片段为5.3kb。
以质粒pGAPZA(Invitrogen)作为模板，利用引物GAP F B/GAP R X(表1)， 扩增得到的GAP启动子片段经BamH I和XbaI酶切，连接经同样方法酶切的载体 pET-Z-TT，获得重组质粒pET-Z-TT-GAP。重组质粒酶切验证如图4C。 pET-Z-TT-GAP经XbaI线性化后为6.9kb；经BamH I和XbaI双酶切验证，切下目 的条带为480bp，余下载体片段为6.4kb。
以毕赤酵母基因组DNA为模板，利用引物PCBS F/PCBS R和引物CBS ORF F/CBS ORF R分别扩增CBS编码序列的上游的304bp片段CBS 5’和CBS编 码序列的469bp片段CBS ORF。先将CBS ORF的469bp片段经BglII和XbaI双酶切 后与同样方式酶切的质粒pET-Z-TT-GAP连接，再将经XhoI和NotI双酶切后片段 CBS 5’插入，最终构建成CBS启动子替换载体pGAP-CBS。重组质粒酶切验证 如图4D。pGAP-CBS经EcoRI线性化后为7.6kb；经XhoI和NotI双酶切验证，切下 目的条带为300bp，余下载体片段为7.3kb；经EcoRI和XbaI双酶切切验证，切下 目的条带为470bp，余下载体片段为7.2kb。
将筛选获得的突变启动子PG0，PG6和PG12作为模板，利用引物GAP F B/GAP R X，扩增得到的PG0，PG6和PG12突变启动子序列经BamH I和XbaI酶切，连接经 同样方法酶切的载体pGAP-CBS，分别获得重组质粒pG0-CBS，pG6-CBS和 pG12-CBS。重组质粒酶切验证如图4E。pG0-CBS，pG6-CBS和pG12-CBS经XbaI 线性化后为7.6kb；经BamH I和XbaI双酶切验证，切下目的条带为480bp，余下 载体片段为7.1kb。
表1、基因克隆及PCR验证实验所用引物
表2、各启动子及基因序列
启动子G0，G6和G12相对强度如图2所示。
实施例2、SAM生产重组菌G0-CBS，G6-CBS和G12-CBS的构建
利用启动子PG0，PG6和PG12调控CBS表达，以弱化CBS途径，如上构建了 CBS替换载体pG0-CBS，pG6-CBS和pG12-CBS。重组质粒pG0-CBS，pG6-CBS 和pG12-CBS经EcoRI和XhoI线性化后，乙醇沉淀纯化回收。将回收的片段电 击转化至SAM高产重组菌DS16(参见H.Hu.J.C.Qian.J.Chu.Y.Wang.Y.P. Zhuang.S.L.Zhang.DNA shuffling of methionine adenosyltransferase gene leads to improved S-adenosyl-L-methionine production in Pichia pastoris.Journal of Biotechnology.2009，141：97-103)，片段重组整合至DS16染色体上，分别构建获 得重组菌G0-CBS，G6-CBS和G12-CBS。涂布YPDS/Zeocin平板，30℃培养3 天以上，至筛选平板上长出单克隆。分别用引物PCBS F/TZ R和GAP F5/CBS R2经菌落PCR验证阳性克隆。扩增出目的条带分别为1.2kb和500bp。实验结 果如图5，筛选的克隆均为阳性克隆，SAM高产重组菌G0-CBS，G6-CBS和 G12-CBS构建成功。对应每个重组菌G0-CBS，G6-CBS和G12-CBS分别挑选 6个克隆接种至装3ml YPG培养基的试管培养16-18h，取1ml培养液保种，余 下菌液接种摇瓶进行下一步的发酵验证实验。
实施例3、代谢途径CBS的弱化及分析
1、重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS生长情况比较
将YPDS/Zeocin平板上的重组菌G0-CBS，G6-CBS和G12-CBS各挑选6 个阳性克隆进行摇瓶发酵实验，出发菌株DS16作为对照菌，每批摇瓶实验做 三个平行。摇瓶甲醇诱导12h开始每间隔24h补入1％L-Met(w/V)，每间隔12 h取样并测定菌体浓度OD600，共诱导96h，发酵结束测定重组菌胞内的SAM 浓度。各重组菌生长曲线如图6，各个不同的菌种在不同的生长时间内的生长 趋势接近，但菌体在放瓶时OD值下降了，表明此时菌体已开始大量死亡，可 能原因如下：1.生长期已结束，菌体开始进入衰亡期，有害代谢产物大量积累， 影响菌体生长，菌体开始自溶；2.发酵液中的各种理化条件，如pH，氮源，碳 源等都远离菌体最适生长条件，使菌体缺少营养而停止生长并开始死亡；3.胞 内积累过量的SAM对菌体的生长产生负面影响；4.蛋氨酸的浓度过高所致，随 着L-Met添加量的增加，在发酵后期浓度过高对菌体生长起到抑制作用。虽然 菌体OD在84h时有所下降，但各重组菌的在整个发酵过程中生长趋势基本一 样，发酵结束菌体量OD600都在40左右，生长范围接近。实验结果表明，虽然 对重组菌的CBS途径做了改造，但是并不影响这些重组菌的生长，并且与阻断 CBS途径的重组菌相比这些重组菌并非营养缺陷型，培养过程不需外源添加谷 胱甘肽，更适合于应用到大规模工业化生产。
2、各重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS的SAM高产菌筛选
通过统计分析各重组菌的SAM产量，结果如图7A所示，各重组菌对应的 SAM高产菌的产量稳定(三次独立实验的误差小于7％)，重组菌G0-CBS、 G6-CBS和G12-CBS的SAM产量分别为92.2±6.4mg/gDCW、125.7±7.8 mg/gDCW和133.2±6.5mg/gDCW。相对出发菌DS16(100.7±5.4mg/gDCW)， G0-CBS的SAM产量降低了9.2％，G6-CBS和G12-CBS的SAM产量分别提高 了23.8％和31.2％(如图7B)。
3、各重组菌对应cys4 mRNA转录水平及CBS酶活比较
为了考察重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS中CBS途径是否弱化，本 实验测定了这些重组菌中CBS编码基因cys4mRNA的转录水平及CBS酶活是 否减弱。用启动子PG0、PG6和PG12调控CBS的表达，若这些启动子强度低于 CBS自身天然启动子强度，则重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS中cys4 mRNA的转录水平低于对照菌DS16，对应的这些重组菌的CBS酶活也低于对 照菌DS16；反之若启动子PG0、PG6和PG12强度高于CBS自身天然启动子强度， 则重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS中cys4 mRNA的转录水平高于对照菌 DS16，对应的这些重组菌的CBS酶活也高于对照菌DS16。
重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS在500ml瓶中诱导24h后，收集 OD600约为15左右的菌液400-500μl。12000rpm离心1min后去上清液，RNA 提取方法参见材料方法。按照TAKARA提供产品说明书，将RNA反转录为 cDNA，然后以cDNA为模板进行荧光定量PCR，定量PCR所用引物参见表1。 定量PCR采集得到的数据统一使用2-ΔΔCt方法处理(K.J.Livak.T.D.Schmittgen. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(T)(-Delta Delta C)method-Methods.2001，25：402-40)。三磷酸甘油醛脱氢酶 基因GAPDH作为内参，cys4基因测得的Ct值都通过内参基因GAPDH校正。 同时为了比较不同重组菌之间cys4基因的相对转录水平，对照菌DS16所有基 因的转录数据都被用作对照，其值被设为1，重组菌G0-CBS、G6-CBS和 G12-CBS基因的转录数据都与之相比。
实验结果如图8，随着启动子强度依次减弱，重组菌G0-CBS、G6-CBS和 G12-CBS的cys4 mRNA转录水平也随之减弱，最终CBS酶活也依次降低。相 对于对照菌DS16(CBS mRNA转录水平设为1)，重组菌G0-CBS、G6-CBS和 G12-CBS的CBS mRNA转录水平分别为1.25±0.23，0.72±0.09和0.03±0.06(表 2)；相对于对照菌DS16(CBS酶活为：269.5±21.3U/g蛋白)重组菌G0-CBS、 G6-CBS和G12-CBS的CBS酶活分别为308.5±23.8U/g蛋白，231.7±24.4U/g 蛋白和73.2±16.7U/g蛋白(表2)。
由图8可以得出结论，重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS的SAM产量 的提高，确实是由于CBS途径的弱化引起。利用不同强度启动子调控CBS的 表达，改变了重组菌中CBS酶活，SAM产量也随之改变。随着启动子PG0、 PG6和PG12强度的逐渐减弱，重组菌G0-CBS、DS16、G6-CBS和G12-CBS中 CBS mRNA转录水平也随之逐渐减少，CBS酶活也依次降低分别为308.5±23.8 U/g蛋白、269.5±21.3U/g蛋白、231.7±24.4U/g蛋白和73.2±16.7U/g蛋白，对 应的CBS途径通量也被依次不同程度改变，最终结果是胞内SAM积累量依次 增加分别为92.2±6.4mg/gDCW、101.5±7.0mg/gDCW、125.7±7.8mg/gDCW和 133.2±6.5mg/gDCW。
相比对照菌DS16，重组菌G0-CBS中调控CBS表达的启动子PG0强度高 于DS16中CBS自身天然启动子，G0-CBS中cys4 mRNA转录水平比DS16的 高出25％，CBS酶活提高了15％，反而强化了CBS的表达，所以重组菌G0-CBS 的CBS途径并未像预期中弱化，最终也导致SAM的产量比对照菌DS16减少 9％。重组菌G6-CBS和G12-CBS中调控CBS表达的启动子PG6和PG12强度低 于DS16中CBS自身天然启动子，G6-CBS和G12-CBS中cys4 mRNA转录水 平分别比DS16的减少了28％和92％，弱化了CBS的表达，将CBS酶活分别 降低了14％和73％，所以重组菌G6-CBS和G12-CBS的CBS途径被不同程度 弱化，最终将SAM的产量分别增长了24％和31％。
4、L-Met消耗比较
CBS的阻断会引起细胞内L-Met和SAH，SAM的积累(J.Martensson.U. Foberg.A.Fryden.M.K.Schwartz.B.Sorbo.O.Weiland.Sulfur amino acid metabolism in hepatobiliary disorders.Scand J Gastroenterol.1992，27：405-411)。 当重组菌G6-CBS和G12-CBS的CBS途径弱化后，CBS酶的表达量被不同程 度减少，对应的细胞内L-Met的积累量也不同程度增加。其次，SAM的产生是 通过外源的添加L-Met和胞内ATP在MAT作用下形成的，因此在重组菌 G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS的发酵过程，外源添加相同量的L-Met时，CBS 途径的不同程度弱化也会影响总L-Met的消耗量。重组菌G0-CBS、G6-CBS 和G12-CBS在摇瓶中YPG培养基培养24小时(即换BMMY培养基诱导前)取 样收集菌体，用玻璃法破碎细胞，测定重组菌胞内L-Met浓度。在没有外源添 加L-Met的情况下，L-Met水平不受胞外(发酵上清)中L-Met影响，其浓度取 决于胞内自身代谢产生的L-Met。从图9的实验结果可以看出，各重组菌胞内 的L-Met浓度呈现显著差异，随着调控CBS启动子强度的依次减弱，重组菌 G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS胞内L-Met浓度依次增加，分别达到：1.02±0.31 mg/L，7.16±0.31mg/L和12.24±0.84mg/L。其中重组菌G0-CBS与对照菌 DS 16(0.95±0.28mg/L)相比，胞内L-Met水平基本一致；而G6-CBS和G12-CBS 胞内L-Met水平与对照菌DS16相比分别提高了7.5倍和12.3倍。实验表明， 转硫途径中CBS酶活的减少确实能引起胞内L-Met的积累。
表2、重组菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS与出发菌株DS16的比较
本发明利用GAP启动子文库对胱硫醚合成途径中的关键酶β-胱硫醚合成酶 (CBS)进行连续梯度的调控，将β-胱硫醚合成酶表达水平不同程度的减少以考查 不同程度弱化CBS合成途径对胞内SAM积累作用。CBS途径通量的减少，能一 定程度上增加L-Met合成代谢通量，而L-Met作为SAM合成的前体物质，L-Met 浓度的增加能相应增加SAM合成的代谢通量，最终实现SAM细胞内积累量的增 加。
以上实验例，首先，通过摇瓶实验考查了重组菌G0-CBS、G6-CBS和 G12-CBS中SAM的产量，证实了对SAM旁路代谢途径CBS合成途径不同程度的 弱化直接影响细胞内SAM的浓度并且重组菌中CBS酶活低至73.2±16.7U/g蛋白 水平对细胞生长都没有负面影响。
其次，考查了各重组菌CBS转录水平和酶活水平。实验表明重组菌G0-CBS、 G6-CBS和G12-CBS中CBS的酶活水平依次降低确实是由于对应的cys4基因转 录水平降低引起，而cys4基因转录水平是分别由启动子PG0、PG6、PG12调控，也 证明了通过不同强度启动子调控cys4基因表达，实现了CBS酶活水平的梯度调 控。
CBS作为转硫途径中关键酶，CBS酶表达量的减少，会引起胞内L-Met水平 的提高(J.Fernandes.(Ed.).Inborn metabolic diseases：diagnosis and treatment. 2006)。L-Met是菌体内部重要的含硫化合物，除了用做合成蛋白质的原料之外， 还参与许多重要的生理代谢。L-Met最重要的生理作用是合成细胞内的活性甲 基供体SAM，在对植物Lemna pausicostata的研究中，发现合成SAM所消耗的 L-Met占全部L-Met的80％。正因为L-Met直接参与细胞中SAM的合成，越来越 多的研究者关注L-Me水平与SAM合成的关系。但大多数文献报道都是在摇瓶发 酵中添加L-Met对合成SAM的影响。朱闪等通过中心组合优化得到摇瓶中L-Met 的适合添加量为5.8g/L(分3次添加)。也有文献报道在诱导型重组毕赤酵母摇瓶 发酵中添加1g/L已经足够，并且在不大于8g/L范围内，硫酸铵的加入能够作为 L-Met的竞争性底物来提供菌体生长和维持所需的氮源，从而提高L-Met的转化 率。张建国等认为在组成型重组毕赤酵母生产SAM的摇瓶发酵中需要添加 L-Met的量为50mmol/L(7.46g/L)，并且需要在摇瓶中维持一定浓度的L-Met才能 保证SAM的持续合成(张建国.蔡瑞.李新华.发酵重组Pichia pastoris生产腺 苷甲硫氨酸的研究.工业微生物.2004，34：1)。刘沛溢等比较了五种不同的补 加前体L-甲硫氨酸的方式。结果表明在菌体干重达到高密度的情况下(120g/L) 补加前体L-甲硫氨酸进行转化生产S-腺苷-L-甲硫氨酸能达到比较好的效果：一 次性补加9g L-甲硫氨酸，SAM的积累量在补加后的18h达到最高，为4.31g/L； 采取流加方式补加L-甲硫氨酸，流加速率为2g/h，共流加5h，流加结束28h后 SAM达到最高积累量后者达到4.98g/L。两者最终的生物量均可达到130g/L以。
在考查不同重组菌L-Met水平时，本发明人首先考查了在没有外源添加 L-Met并且没有诱导表达MAT时各重组菌胞内的L-Met水平。结果如图9，随着 调控CBS启动子强度的依次梯减，重组菌胞内L-Met水平依次梯增。实验表明， 随着CBS途径通量的减少，重组菌胞内的L-Met浓度相应增加。
实施例4、放大规模生产
本实施例将摇瓶结果在15L全自动发酵罐上进行放大。首先进行分批培养， 待基础培养基中的甘油耗尽以后开始流加50％(v/v)的甘油直至细胞干重达到 45-50g DCW/L(约5h)。饥饿30min后开始流加甲醇进行诱导，启动SAM合成 酶的表达，维持DO＞25％。在甲醇诱导12h后开始以12.5mL/L/h的速率流加浓 度为16g/L的L-Met溶液，即L-Met的流加速率分别为0.2g/L/h(体积以初始装 液量7L计算)，提供底物使得菌体累积SAM，直至发酵结束，发酵过程重组菌 G12-CBS和DS16的SAM体积产量如图10。
15L发酵罐的实验结果表明，重组菌G12-CBS的SAM产量达到13.4g/L， 与DS16相比产量提高了2.2倍，因此重组菌G12-CBS无论是在提高产量还是 降低发酵成本(无需外源增加培养成分GSH)上都更具优势，也为工业化大规模 生产SAM提供保障。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
机译： S-腺苷甲硫氨酸调节代谢途径及其在诊断和治疗中的应用
机译： S-腺苷甲硫氨酸对代谢途径的调控及其在诊断和治疗中的应用
机译： S-腺苷蛋氨酸调节代谢途径及其在诊断和治疗中的应用
