一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应用以及蓖麻碱的毒性评价方法

摘要

本发明涉及一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应用以及蓖麻碱的毒性评价方法，利用磁力加热和搅拌辅助超声波提取技术，以水作为提取溶剂，从蓖麻籽壳和蓖麻老叶提取高纯度蓖麻碱的方法以及利用蓖麻碱防治储粮害虫玉米象和赤拟谷盗，并利用秀丽隐杆线虫对蓖麻碱进行毒性评价，测定线虫致死率、生殖能力、体长和体内酶的活性。本发明操作简单，成本低廉，减少有机试剂使用，保护环境，提取液可直接用于储粮害虫防治，为大规模工业化生产蓖麻碱生物农药提供必要条件。

说明书

技术领域

本发明属于蓖麻碱提取技术领域，尤其是一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应用以及蓖 麻碱的毒性评价方法。

背景技术

玉米象，Sitophilus zeamais(Motschusky)，属鞘翅目象甲科，是我国储粮主要害虫之一， 也是世界性的重要储粮害虫。它寄生于多种食物中，以玉米、小麦、高粱受灾最重。主要危 害贮存2-3年的陈粮，成虫啃食谷粒，幼虫蛀蚀谷粒。目前主要防治方法是利用马拉硫磷诱杀 成虫。已经证明，茴香、八角、黑胡椒粉、红桔油、薄荷脑、樟脑、桉叶油、除虫菊等植物 性提取物对储粮害虫有不同程度的防治效果。

赤拟谷盗Tribolium castaneum(Herbst)，属鞘翅目拟步甲科，别名拟谷盗。主要危害面 粉，使面粉产生霉腥味，其分泌物还含有致癌物--苯醌。主要防治方法为冷冻杀虫、高温杀 虫、磷化铝熏蒸法等。随着可持续植保理论的提出，储粮害虫的治理方法也面临着新挑战， 植物性杀虫剂的研究与开发成为研究热点之一。

在农业领域，我国大部分地区一直沿用化学合成剧毒农药进行防治，是农、林、牧业生 产中杀虫、灭菌的主导产品。化学合成剧毒农药在粮食、瓜果、蔬菜及牧草表面的残留量多、 滞留时间长、不易分解，给人、畜、禽的健康造成了严重的危害。同时，因防治对象中化学 合成农药等有害成分残留量高，给我国的对外贸易造成了巨大损失，并且，化学合成农药毒 性大，害虫易产生抗性。

植物源农药具有对人畜毒性低、在环境中易降解、少残留或无残留等特点，因此，从植 物中提取分离有杀虫活性物质，已成为近年来国内外植物保护工作者研究开发的热点。研究 发现，蓖麻毒素粗提物对天幕毛虫、桃蚜、小菜蛾等虫有不同程度的杀灭作用，其中对小菜 蛾化蛹有较强的抑制作用，化蛹率低于30％。蓖麻碱则表现为胃毒作用，并具有一定拒食效 果。蓖麻碱与Bt结合对甜菜夜蛾也有明显的防治作用。综上所述，蓖麻碱在储粮害虫防治方 面的应用前景广阔。

秀丽小杆线虫Caenorhabditis elegans是一种国际公认的模式生物，为多细胞生物。其结构 简单、遗传背景清楚，生活周期短，可在实验室大量培养，与其他模型生物相比可以避免个 体差异造成的误差，有利于生物毒性评价的标准化与规范化，可用于毒理学研究和毒性评价 体系。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应 用以及蓖麻碱的毒性评价方法，本发明利用磁力搅拌提取技术，以水作为提取溶剂，从蓖麻 籽壳和蓖麻老叶中提取高纯度蓖麻碱，利用蓖麻碱防治储粮害虫玉米象和赤拟谷盗，并利用 秀丽隐杆线虫对蓖麻碱进行毒性评价，测定线虫致死率、生殖能力、体长和体内酶的活性。

本发明实现目的技术方案如下：

1.一种蓖麻碱的水提方法，其特征在于：步骤如下：

(1)将蓖麻籽壳∶蓖麻老叶＝5∶1m/m的比例进行混合，按水∶粉碎料＝10∶1加水；

(2)将混合粉碎料在60℃恒温水浴，磁力搅拌，回流提取4h；

(3)用超声波技术再次对上述混合料液进一步提取，过滤，回收提取液；

(4)放入50℃干燥箱内进行干燥；

(5)干燥所得固体加入100mL蒸馏水，加热溶解并用1％的盐酸调pH为2-3，过滤，溶液用 1％氨水调pH为9，过滤，溶液50℃进行真空干燥，得蓖麻碱。

一种由蓖麻碱的水提方法制备的蓖麻碱水提物，步骤如下：

(1)将蓖麻籽壳∶蓖麻老叶＝5∶1m/m的比例进行混合，按水∶粉碎料＝10∶1加水；

(2)将混合粉碎料在60℃恒温水浴，磁力搅拌，回流提取4h；

(3)用超声波技术再次提取蓖麻碱对上述混合料液进一步提取，过滤，回收提取液；

(4)合并步骤(2)和(3)的滤液。

一种蓖麻碱的毒性评价方法，包括如下步骤：

(1)蓖麻碱对储粮害虫的趋避效果测定。采用药膜选择法；

(2)蓖麻碱对储粮害虫熏蒸效果测定，采用广口瓶密闭熏蒸法；

(3)线虫对蓖麻碱水提物的毒性评价，蓖麻碱对秀丽线虫的致死率试验；

(4)蓖麻碱对线虫生殖能力影响的试验；

(5)蓖麻碱对线虫体长影响的试验；

(6)蓖麻碱对线虫体内酶活力的影响的试验。

而且，所述步骤(1)的具体方法如下：用热水溶液做溶剂将蓖麻碱配成不同浓度的药液， 将直径为9cm的圆形滤纸裁成相同的两半，分别滴加0.5mL的蓖麻碱溶液和等量蒸馏水溶液为 对照，待溶剂挥发干后，将两半滤纸用胶纸粘定，置入直径为9cm的培养皿内，每皿接入试 虫30头，将培养皿放入生测室内，温度30℃±1℃，湿度：75％±5％，分别于处理24、48、 72h后观查成虫分布状况，计算其驱避率。

而且，所述步骤(2)的具体方法如下：在1000mL广口瓶，中央悬挂一个3cm x 11cm滤纸片， 接入30头试虫，迅速用微量加样器分别在滤纸上滴加不同体积1mg/mL蓖麻碱溶液，迅速用瓶 塞将瓶口封好，对照用蒸馏水溶剂处理。将各处理瓶置于生测室内，温度30℃±1℃，湿度： 75％±5％，分别于24、48、72h后观查击倒虫数，72h后打开瓶塞，散气后将试虫倒入干净 的培养皿内，计算死亡数。

而且，所述步骤(1)的具体方法如下：将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖 麻碱提取物的NGM板内，实验板中含12.5mg/L5-Fu并置于20℃下培养。每组实验样本数60 条左右，24、48、72、96、120h，并计算死亡率。对线虫死亡判断标准：线虫不无移动及无 吞咽动作，轻触后仍无任何反应。

而且，所述步骤(2)的具体方法如下：挑取L4期线虫至各组单独转入NGM板，每24h移至 新的NGM板，直至线虫产卵期结束；产卵板在20℃培养24h记录子代数目；产卵期为L4期结 束到产卵结束；所有数据连续测定10只以上的秀丽线虫，然后取平均值。

而且，所述步骤(3)的具体方法如下：从空白平板和含有蓖麻碱的实验板中随机挑取同期 化后L1期的线虫，然后用热水将其烫死，在装有视觉透视标度的解剖显微镜下测量其长度； 每24h从培养板中挑取线虫，连续测量5d线虫体长，每次每组三个平行，并记录测量结果。

而且，所述步骤(4)的具体方法如下：将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖 麻碱提取物的NGM板内；

实验板中含12.5mg/L5-Fu并置于20℃下培养，每组实验样本数60条，用无菌水将线虫定 容到200μL，移入匀浆器中置于冰上匀浆，匀浆液定容至500μL，加入1％Chaps buffer至1mL， 冰上置冷5min，4℃，5000r/min离心10min，收集上清液4℃保存；

通过测定线虫体内黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟 胺成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明利用水提方法从蓖麻籽壳和蓖麻老叶中提取高纯度蓖麻碱，利用磁力搅拌提取 技术，以水作为提取溶剂，提取方法中不适用有机溶剂，保护环境，对下游再生产和利用有 利。

2.本发明操作简单，成本低廉，减少有机试剂使用，保护环境，提取液可直接用于储粮 害虫防治，为大规模工业化生产蓖麻碱生物农药提供必要条件。

3.本发明所制得的蓖麻碱粗提物可作为属植物源农药，具有对人畜毒性低、在环境中易 降解、少残留或无残留等特点。

4.本发明提供了蓖麻碱水提物的另一重要功能，将其应用于农药领域，蓖麻碱水提物对 赤拟谷盗、玉米象等储粮害虫有明显的趋避作用；同时，熏蒸击毙率也较高。

附图说明

图1为蓖麻碱红外光谱图；

图2为蓖麻碱液相色谱图；

图3为本发明不同浓度蓖麻碱提取物对秀丽线虫的致死作用的影响；

图4为发明蓖麻碱提取物对线虫子代数目的影响；

图5为发明蓖麻碱提取物对线虫体长的影响；

图6为发明蓖麻碱提取物对线虫SOD活性的影响；

图7为发明蓖麻碱提取物对线虫CAT活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明做进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说 明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

一种蓖麻碱的水提方法，步骤如下：

(1)将蓖麻籽壳20.0g粉碎过后40目筛，蓖麻老叶4.0g烘干粉碎，用240mL自来水充分混合； 本步骤将蓖麻籽壳∶蓖麻老叶＝5∶1m/m的比例进行混合，按水∶粉碎料＝10∶1加水；

(2)将混合粉碎料在60℃恒温水浴，磁力搅拌，回流提取4h，

(3)用超声波高频振荡技术再次对上述混合料液进行提取30min，过滤，回收提取液；

本发明是在60℃恒温水浴，磁力搅拌，回流提取4h后，没有进行过滤和回收提取液，直 接采用超声波技术再次将混合料液超声30min，过滤，回收提取液。这样做的目的是提高蓖麻 碱的提取效率。)

(4)放入50℃干燥箱内进行干燥；

(5)干燥所得固体加入100mL蒸馏水，加热溶解并用1％的盐酸调pH为2-3，过滤，溶液用 1％氨水调pH为9，过滤，溶液50℃进行真空干燥，得蓖麻碱固体，纯度为91.1％。

利用蓖麻碱防治储粮害虫玉米象和赤拟谷盗研究杀虫效果，并利用秀丽隐杆线虫对蓖麻 碱进行毒性评价，测定线虫致死率、生殖能力、体长和体内酶的活性。

一、蓖麻碱对储粮害虫的趋避效果测定，采用药膜选择法，步骤如下：

用热水溶液做溶剂将蓖麻碱配成不同浓度的药液，将直径为9cm的圆形滤纸裁成相同的 两半，分别滴加0.5mL的蓖麻碱溶液和等量蒸馏水溶液为对照。待溶剂挥发干后，将两半滤 纸用胶纸粘定，置入直径为9cm的培养皿内。重复3次。每皿接入试虫30头，将培养皿放入生 测室内(温度30℃±1℃，湿度：75％±5％)，分别于处理24、48、72h后观查成虫分布状况， 计算其驱避率。

驱避率计算公式为：

驱避率(％)＝[(对照边试虫数-处理边试虫数)/对照边试虫数]×100％

根据驱避率的不同，将驱避效果分为六个等级，分级标准(级别，驱避率)为：

0：无忌避作用；

1：0.1％～20％；

2：20.1％～40％；

3：40.1％～60％：

4：60.1％～80％；

5：80.1％～100％。

具体实例1：用热水做溶剂，将蓖麻碱配制成1mg/mL药液，将直径为9cm的圆形滤纸裁 成相同的两半，分别滴加0.5mL的蓖麻碱溶液0.5mL和等量蒸馏水溶液为对照。待溶剂挥发干 后，将两半滤纸用胶纸粘定后置入直径为9cm的培养皿内。每皿接入玉米象成虫30头，将培 养皿移入生测室内(温度30℃±1℃，湿度：75％±5％)，72h后观查玉米象分布状况，其驱 避率为100％。

具体实例2：用热水做溶剂，将蓖麻碱配制成1mg/mL药液，将直径为9cm的圆形滤纸裁 成相同的两半，分别滴加0.5mL的蓖麻碱溶液0.5mL，等量蒸馏水溶液为对照。待溶剂挥发干 后，将两半滤纸用胶纸粘定后置入直径为9cm的培养皿内。每皿接入赤拟谷盗成虫30头，将 培养皿移入生测室内(温度30℃±1℃，湿度：75％±5％)，72h后调查赤拟谷盗分布状况， 其驱避率为98.7％。

二、蓖麻碱对储粮害虫熏蒸效果测定，采用广口瓶密闭熏蒸法，步骤如下：

在1000mL广口瓶，中央悬挂一个3cm x 11cm滤纸片，接入30头试虫，迅速用微量加样器 分别在滤纸上滴加不同体积1mg/mL蓖麻碱溶液，迅速用瓶塞将瓶口封好。重复3次，对照用 蒸馏水溶剂处理。将各处理瓶置于生测室内(温度30℃±1℃，湿度：75％±5％)，分别于24、 48、72h后观查击倒虫数，72h后打开瓶塞，散气后将试虫倒入干净的培养皿内，计算死亡数。

击倒标准：在100W白炽灯下观察1min，虫体无任何刺激性反应视为击倒。

校正击倒率计算公式为：

校正击倒率(％)＝(击倒率-对照击倒率)/(1-对照击倒率)×100％

校正死亡率计算公式为：

校正死亡率(％)＝[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100％

具体实例1：用热水做溶剂，将蓖麻碱配制成1mg/mL药液，在1000mL广口瓶中央悬挂一 个3cm x 11cm滤纸片，接入30头玉米象成虫，迅速用微量加样器分别在滤纸上滴加1mg/mL蓖 麻碱溶液1mL，迅速用瓶塞将瓶口封好。重复3次，对照用蒸馏水溶剂处理。将测试瓶置于生 测室内(温度30℃±1℃，湿度：75％±5％)，72h玉米象击毙率为80.0％，72h后打开瓶塞， 散气后将试虫倒入干净的培养皿内，玉米象死亡率为72.3％。

具体实例2：用热水做溶剂，将蓖麻碱配制成1mg/mL药液，在1000mL广口瓶中央悬挂一 个3cm x 11cm滤纸片，接入30头赤拟谷盗成虫，迅速用微量加样器分别在滤纸上滴加1mg/mL 蓖麻碱溶液1mL，迅速用瓶塞将瓶口封好。重复3次，对照用蒸馏水溶剂处理。将测试瓶置于 生测室内(温度30℃±1℃，湿度：75％±5％)，72h赤拟谷盗击毙率为77.2％，72h后打开瓶 塞，散气后将试虫倒入干净的培养皿内，赤拟谷盗死亡率为70.1％。

三、线虫对蓖麻碱水提物的毒性评价，蓖麻碱对秀丽线虫的致死率试验，方法如下：

将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖麻碱提取物的NGM板内。实验板中含 12.5mg/L5-Fu并置于20℃下培养。每组实验样本数60条左右，24、48、72、96、120h，并计 算死亡率。对线虫死亡判断标准：线虫不无移动及无吞咽动作，轻触后仍无任何反应。

校正死亡率计算公式为：

具体实例：将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度为2.0mg/mL、1.5mg/mL、 1.0mg/mL、0.5mg/mL蓖麻碱生物农药的NGM板内。实验板中含12.5mg/L5-Fu并置于20℃下 培养。每组实验样本数60条左右，24、48、72、96、120h。如图3所示，在蓖麻碱提取物的 浓度为1.5mg/mL，作用时间为120h时，秀丽线虫的死亡率为100％，蓖麻碱提取物浓度为 2.0mg/mL，作用时间为96h时，秀丽线虫的死亡率为100％。蓖麻碱提取物的浓度增加，秀丽 线虫全部死亡的时间提前，说明蓖麻碱提取物浓度越大，毒性越强。

四、蓖麻碱对线虫生殖能力影响的试验，方法如下：

挑取L4期线虫至各组单独转入NGM板，每24h移至新的NGM板，直至线虫产卵期结束。 产卵板在20℃培养24h记录子代数目；产卵期为L4期结束到产卵结束。所有数据连续测定10 只以上的秀丽线虫，然后取平均值。

具体实例：挑取L4期线虫至各组单独转入含有0.5mg/mL蓖麻碱生物农药的NGM板内。每 24h移至新的NGM板，直至线虫产卵期结束。产卵板在20℃培养24h记录子代数目；产卵期为 L4期结束到产卵结束。如图4所示，空白组每条虫产出的子代数目均高于蓖麻碱提取物组每条 虫产出的子代数目。线虫在性成熟后第二天和第三天进入生殖高峰期，表明蓖麻碱提取物使 秀丽线虫的机体生殖能力降低或丧失，为蓖麻碱制取生物农药提供了一定的理论依据。

五、蓖麻碱对线虫体长影响的试验，方法如下：

从空白平板和含有蓖麻碱的实验板中随机挑取同期化后L1期的线虫，然后用热水将其烫 死，在装有视觉透视标度的解剖显微镜下测量其长度；每24h从培养板中挑取线虫，连续测量 5d线虫体长，每次每组三个平行，并记录测量结果。

具体实例：从空白平板和含有0.5mg/mL蓖麻碱的实验板中随机挑取同期化后L1期的线 虫，然后用热水将其烫死，在装有视觉透视标度的解剖显微镜下测量其长度；每24h从培养板 中挑取线虫，连续测量5d线虫体长，每次每组三个平行，并记录测量结果。如图5所示，第1d 空白组与蓖麻碱组差异不明显，第2d以后，空白组的线虫增长的快，到第6d时差异显著，由 此我们推测蓖麻碱提取物可能对秀丽线虫有限食(热量限制)作用，对其寿命产生影响，甚 至致死。

六、蓖麻碱对线虫体内酶活力的影响的试验，方法如下：

将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖麻碱提取物的NGM板内。实验板中含 12.5mg/L5-Fu并置于20℃下培养，每组实验样本数60条左右。用无菌水将线虫定容到200μL， 移入匀浆器中置于冰上匀浆。匀浆液定容至500μL，加入1％Chaps buffer至1mL，冰上置冷5min， 4℃，5000r/min离心10min，收集上清液4℃保存。

通过测定线虫体内黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O^2-·)，后者 氧化羟胺成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。1个SOD 活力单位(U)定义为每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量。

计算公式：

过氧化氢酶(CAT)分解H₂O₂的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H₂O₂与钼酸 铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，计算出CAT的活力。1个酶活力 单位(1U)被定义为：每毫克组织蛋白每秒钟分解1μmol的过氧化氢的量。

计算公式：

注：*271为斜率的倒数

具体实例：将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度为2.0mg/mL、1.5mg/mL、 1.0mg/mL、0.5mg/mL蓖麻碱生物农药的NGM板内。实验板中含12.5mg/L5-Fu并置于20℃ 下培养，每组实验样本数60条左右。用无菌水将线虫定容到200μL，移入匀浆器中置于冰上 匀浆。匀浆液定容至500μL，加入1％Chaps buffer至1mL，冰上置冷5min，4℃，5000r/min 离心10min，收集上清液4℃保存。在给线虫喂食受试物48h以后，测定了给药48h前后秀 丽线虫体内最具有代表性的两种酶类：过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)这两 种酶的活性变化情况。对虫体的健康起着监测作用。由图6和图7可知，随着蓖麻碱提取物 浓度的增加，虫体的SOD和CAT的活性逐渐降低，线虫死亡率逐渐提高。由此可知，蓖麻 碱对虫体的致死率和两种酶的活性降低有一定关系。