表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(rDEVus78Ha)及其构建方法和应用

摘要

本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC NO：V201025，命名为rDEVus78Ha，及其构建方法和应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA插入到鸭病毒性肠炎病毒的US7和US8基因之间的间隔区中，构建获得在US7和US8基因之间插入SV40-HA表达框的粘粒，由其拯救获得表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC NO：V201025。本发明还涉及构建该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，以及该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株用于制备预防鸭病毒性肠炎和禽流感的疫苗的应用。

说明书

技术领域

本发明属于重组病毒疫苗领域，更具体地属于重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗领域。本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025，命名为rDEVus78Ha，及其构建方法和应用。 

背景技术

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又称鸭病毒性肠炎病毒。能引起鸭、鹅和其它雁形目禽类发生急性、热性、败血性为特征的烈性传染病。但对DEV的研究相对于其它疱疹病毒而言相对比较少。故第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疹病毒^[1]，而未能进一步将其进行分类。直到最近，其全序列才被全部测通^[2]。自2007年，本研究室开始了DEV疫苗株基因组的测序工作，通过构建DEV疫苗株全基因组粘粒文库，分段对其进行测序和分析，至2009年中期，已将DEV疫苗株全基因组测序工作完成。几乎同时，Li等也报道了DEV疫苗株全基因组的测序和分析结果，其基因组大小约为158Kb，约编码78个蛋白。通过对DEV疫苗株基因组基因构成及结构分析，DEV被认为是α疱疹病亚科中的中间型病毒，与水痘病毒属成员更为相近^[2]。而同为禽类疱疹病毒的马立克病毒(MDV)和火鸡疱疹病毒(HTV)属于马立克病毒属，鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鹦鹉疱疹病毒(PsHV)为传染性喉气管炎病毒属。 

自上世纪80年代成功利用痘苗病毒为载体表达单纯疱疹病毒的TK基因以来，人们开始尝试用各种不同DNA病毒为载体，表达不同外源基因，并将构建的重组疫苗用于人和各种不同动物疾病的预防。大量的研究结果表明，疱疹病毒因其基因组大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被认为是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。截止目前，已有大量的 相关研究报道。在常见畜禽疱疹病毒疾病中，如以伪狂犬病毒(PRV)为载体，分别在gD、gE、gG和TK等基因中插入CSF的E2等外源基因，并用其免疫猪，取得了良好的免疫效果^[4-11]。用在鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的UL0和UL50中分别插入不同HA基因构建成功的重组病毒免疫鸡，均效果良好^[11-13]。同样，Sakaguchi M(1993；1994)和Sonoda K(1996)等分别在MDV1的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫1日龄无特定病原鸡(SPF鸡)，1周后用vMDV、vvMDV攻毒，其对SPF鸡的保护效率为80～100％^[14-16]；在MDV1的US10中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重组病毒对MDV强毒的保护效率与对照MDV1相当^[17，18]；Tsukamoto K等(2002)以Pec作为传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的启动子插入火鸡疱疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之间成功构建重组病毒，用其免疫的SPF鸡足以抵抗IBDV强毒的攻击^[19]。现在，我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。作为α疱疹病亚科一员，DEV也应该是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。但DEV的基因组成及结构与MDV等有着较大的差异，如MDV的基因组结构为TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS，而DEV基因组的结构是UL-IRS-US-TRS。且DEV与同亚科的另外几种畜禽疱疹病毒在动物体内生长复制的生物学特点也不尽相同。因此，在PRV、MDV、ILTV中可稳定插入外源基因的位点不一定适用于DEV。 

由于对DEV的研究相对滞后，至今为止，国内外关于DEV基因中复制非必需区的研究报道仍是空白。常用于构建疱疹病毒重组病毒的方法有三种。一种是同源重组；第二种是将病毒基因组插入BAC中，然后在BAC上构建突变，用其转染相应细胞拯救出重组病毒；第三种是将含有相互重叠区的疱疹病毒基因片段分别插入粘粒中，并在其相应区段上构建突变，再用其共转染相应细胞拯救出重组病毒。然而对于DEV这种基础研究缺乏、分类不清楚、非必需基因未知的病毒而言，用第一或第二种方法构建重组病毒工作量大，且效率低。而第三种方法的难点在于多粘粒感染性克隆的建立，如果这个平台构建成功，将能快速有效的构建重组病毒。至今，疱疹病毒的这种感染性克隆构建技术已比较成熟，且已见诸报道^[20-27]。 

本研究室在前期研究中，在鸭病毒性肠炎病毒的基因组中鉴定出可供 外源基因稳定插入的复制非必需区。在此基础之上，本研究将目前中国用于禽流感预防的疫苗株血凝素(HA)基因插入DEV基因组的US7和US8基因之间，用其免疫无特定病原鸭(SPF鸭)能使SPF鸭产生良好的对抗流感的抗体，同时还不影响DEV的免疫效果。 

发明内容

本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC V201025，命名为rDEVus78Ha，及其构建方法和应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将包含禽流感病毒血凝素(HA)基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA(SEQ IDNO：1)插入到鸭病毒性肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)的US7和US8基因之间的间隔区(US7和US8基因之间的间隔区的核苷酸序列见SEQ ID NO：5)中，构建获得在US7和US8基因之间插入SV40-HA表达框的粘粒pFOS5us78SV40HA，由其拯救获得表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025，命名为rDEVus78Ha。本发明还涉及构建该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，以及该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株用于制备预防鸭病毒性肠炎和禽流感的疫苗的应用。 

在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCCV201025，命名为rDEVus78Ha，其于2010年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)。所述表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025在鸭肠炎病毒DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区(SEQ ID NO：5)中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-HA(SEQ ID NO：1)。 

在本发明的一个实施方案中，本发明提供构建表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025的方法，所述方法包括下述步骤： 

(1)构建鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因组的Fosmid文库，并从中 选择用于拯救鸭病毒性肠炎病毒的5粘粒组合系统，将它们分别命名为pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4、pFOS5，其中pFOS5粘粒包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区； 

(2)利用步骤(1)中获得的包含DEV基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区的粘粒pFOS5，在该粘粒的US7和US8基因之间插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段(SEQID NO：1)，构建重组突变粘粒；和 

(3)利用步骤(2)中获得的重组突变粘粒和步骤(1)中获得的5粘粒组合系统中的pFOS1、pFOS2、pFOS3和pFOS4共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，拯救出重组病毒株CCTCC V201025，将其命名为rDEVus78Ha。 

在优选的实施方案中，上述步骤(1)中得到的5粘粒克隆所包含的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段两端都含有Fse I-SbfI-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒全基因组(它们的重叠和覆盖模式可参见图9)。 

在优选的实施方案中，上述步骤(2)中的禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉碱性裂解位点的HA基因，其由2006年从安徽分离的H5N1型禽流感毒株(其详细名称为A/duck/Anhui/106/2006(H5N1)，由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构)扩增得到；上述步骤(2)中的SV40启动子序列来源于包含SV40启动子的质粒，例如，pSI质粒(购自Promega公司)等。 

本发明所用的鸭病毒性肠炎病毒为DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222)(GeneBank EU082088)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，目录编号AV1222；购自中国兽医药品监察所)。 

在本研究中，本发明人发现，HA基因的插入位置不影响所构建的重组疫苗株对鸭病毒性肠炎病毒的免疫效果(数据未显示)。但HA基因插入其他位置，是否会影响其对鸭病毒性肠炎病毒的保护效果需要实验来证明。 

在本发明的一个实施方案中，本发明提供所述表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025的应用，其用 于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病的疫苗。 

在本发明的优选实施方案中，所述鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病包括鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病，例如，由鸭病毒性肠炎病毒DEV引起的鸭病毒性肠炎，由禽流感病毒A/duck/LN/51/2005(H5N1)和A/duck/HuB/49/2005(H5N1)等引起的禽流感等。 

在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括本发明所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025，以及药用佐剂、赋形剂等。本领域技术人员根据所述疫苗的应用目的、进行免疫的禽类等因素，可以容易地选择适合的药用佐剂、赋形剂等。 

在本发明的优选实施方案中，所述疫苗可以有效用于预防由鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病，例如，有效用于预防由鸭病毒性肠炎病毒DEV引起的鸭病毒性肠炎，由禽流感病毒A/duck/LN/51/2005(H5N1)和A/duck/HuB/49/2005(H5N1)等引起的禽流感等。 

因此，本发明提供下述： 

1.表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC V201025，命名为rDEVus78Ha。 

2.根据第1项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中在鸭肠炎病毒DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段(SEQ ID NO：1)。 

3.根据第1项或第2项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉碱性裂解位点的HA基因，其由H5N1型禽流感毒株A/duck/Anhui/106/2006(H5N 1)扩增得到。 

4.根据第2项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述SV40启动子序列来源于包含SV40启动子的质粒。 

5.根据第4项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述包含SV40启动子的质粒包括pSI质粒。 

6.构建第1项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤： 

(1)构建鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的Fosmid文库，并从中选择用于拯救鸭病毒性肠炎病毒的5粘粒组合系统，将它们分别命名为pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4、pFOS5，其中pFOS5粘粒包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区； 

(2)利用步骤(1)中获得的包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区的粘粒pFOS5，在该粘粒的US7和US8基因之间的间隔区中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40启动子序列的基因片段(SEQ ID NO：1)，构建重组突变粘粒；和 

(3)利用步骤(2)中获得的重组突变粘粒和步骤(1)中获得的5粘粒组合系统中的pFOS1、pFOS2、pFOS3和pFOS4共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，拯救出重组病毒株CCTCC V201025，将其命名为rDEVus78Ha。 

7.根据第6项所述的方法，其中步骤(1)中得到的5粘粒组合系统中的每一个粘粒克隆所包含的DEV DNA片段两端都含有Fse I-SbfI-Pme I接头，相互重叠，且拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒全基因组。 

8.第1项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的应用，其用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病的疫苗。 

9.根据第8项所述的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病包括鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病。 

10.一种疫苗，其包括第1项所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025，以及药用佐剂、赋形剂等。 

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中： 

图1：pCC1Fos粘粒图谱； 

图2：拯救的病毒dDEV与亲本DEV疫苗株病毒基因组分别用BamH I、EcoR I、BbvC I酶切后的脉冲电泳图谱，其中DEV：亲本DEV疫苗株(即用于构建重组病毒的亲本病毒疫苗株)，dDEV：由本发明人构建和筛选的5粘粒系统(参见实施例1-3)拯救出的三株病毒，M1：低范围PFG分子标记(Low Range PFG Marker)；M2：DL15000分子标记；M3：λ-HindIII消化分子标记(λ-Hind III digest Marker)； 

图3：pUC ccdB kan质粒图谱； 

图4：pFOS5us78Kan ccdB粘粒图谱； 

图5：pENTR MCS质粒图谱； 

图6：pSI HA质粒图谱； 

图7：pENTR sv40-ha质粒图谱； 

图8：pFOS5us78SV40HA粘粒图谱； 

图9：鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆拯救重组病毒示意图； 

图10：重组病毒HA基因在CEF中的表达免疫荧光检测及蛋白质印迹(western blot)检测结果图； 

图11：PCR检测外源表达框架在rDEVus78Ha中的情况； 

图12：免疫重组病毒后，在SPF鸭体内诱导HI抗体的情况； 

图13：SEQ ID NO：1：SV40-HA表达框架，其中斜体加粗部分为禽流感血凝素HA基因。 

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。 

实施例1.DEV疫苗株基因组Fosmid文库的构建 

按EPICENTRE公司“CopyControl Fosmid Library Production Kit”试剂 盒说明书构建DEV基因组的Fosmid文库。 

方法如下：将DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222)(GeneBank EU082088)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，目录编号AV1222；购自中国兽医药品监察所)DNA用物理方法即用25号针头(购自上海治宇医疗器械有限公司)抽吸多次进行切断处理，用T4DNA聚合酶(T4DNA Polymerase，购自New England Biolabs)及碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，购自NewEngland Biolabs)对DNA片段进行末端平滑化及去磷酸化处理，脉冲电泳(用Bio-Rad公司CHEF XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为：电泳缓冲液为0.5xTBE，琼脂糖胶浓度为1％，程序为2K-80K)，回收38kbp-48kbp之间的DNA片段。将回收后的DEV DNA片断两端用T4连接酶连接上Fse I-Sbf I-Pme I接头，精制后连接到pCC 1Fos(购自EPICENTRE，图谱见图1)载体上，4℃过夜连接。对混和液进行包装，转染大肠杆菌EPI300-T1(购自EPICENTRE)。对文库滴度进行确认，其试验过程如下：将包装好的混和液进行10倍梯度稀释，分别取10^-2，10^-4，10^-5，10^-6四个稀释度的稀释液10μl感染100μl EPI300-T1细胞，将此菌涂于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板，37℃过夜培养，统计菌落数量，并计算其滴度，结果为3.8x10⁵cfu/lib。即成功构建DEV的fosmid文库。 

实施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的选择 

文库构建成功后，挑取286个克隆提取粘粒，用碱裂解法^[5]提取粘粒，送大连宝生物公司对插入pCC1Fos中的DEV DNA片段末端进行测序，测序引物序列如下： 

Primer 1：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ 

Primer 2：5’-GCCAAGCTATTTAGGTGAGA-3’ 

经过末端测序的分析，共得到插入片段两端都连接有完整Fse I-SbfI-Pme I接头的克隆250个。从这250个克隆中选取多组用于拯救DEV的5粘粒组合。其中每组中克隆的DEV DNA片段两端都含有Fse I-SbfI-PmeI接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组。 

实施例3.病毒拯救 

用Qiagen公司的中量提取试剂盒提取所选择的粘粒的DNA。用Fse I、SbfI或Pme I内切酶(均购自New England Biolabs)对所选择的粘粒进行线性化处理，反应条件如下：SbfI内切酶20U(也可以使用Fse I或Pme I内切酶)，粘粒10μg，37℃作用1小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制备转染用DEV DNA。 

参照Reddy SM(2002)的磷酸钙方法将5段DEV DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF)^[28]，经多次重复，其中有3组5粘粒组合转染4-6天后可见CEF出现DEV病毒典型病变，选取重复性较好的一组5粘粒组合进行后续实验。收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为dDEV，用此dDEV与亲本DEV病毒(即用于构建该感染性克隆的亲本病毒)分别接种次代CEF。 

CEF的制备方法如下：取9-10日龄SPF鸡胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部位，脱碘后无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，并去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎。用0.25％的胰酶(4mL/胚)在37℃水浴中消化4-5分钟，弃去胰酶，用Hank’s液洗涤2次。加入适量的含血清与双抗(青霉素100u/mL，链霉素100mg/mL)的M199营养液(购自HyClone)，吹打使细胞分散，用四层纱布过滤后制成10⁶-10⁷细胞/毫升的细胞悬液，最后分装于培养转瓶中37℃旋转培养。36-48小时后，按毒种∶细胞培养液体积为1∶1000将病毒接种于CEF。待细胞病变达到100％时，收集培养液；4℃6000g离心10分钟，去除细胞碎片；取上清50000g离心2小时富集病毒；然后经20％和60％蔗糖密度梯度离心，50000g离心2小时，回收20％和60％中间层；之后经50000g离心2小时超速离心脱糖处理获得纯化好的病毒。提取病毒全基因组DNA^[29]，分别用BamH I、EcoR I和BbvC I(均购自New EnglandBiolabs)对原疫苗株DEV和dDEV进行酶切。反应条件如下：分别取BamHI、EcoR I和BbvC I各20U，分别与DEV基因组DNA 8μg混和，于50μl体系中37℃作用1小时。用Bio-Rad公司CHEF XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为：电泳缓冲液位0.5x TBE，琼脂糖胶浓度为1％，程序为2K-70K。 

拯获的病毒酶切图谱和亲本病毒相同，如图2所示。说明所选择的5 粘粒组成功拯救DEV病毒。本发明人将所选择的5粘粒组成员分别命名为pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4、pFOS5，该5粘粒克隆所包含的DEVDNA片段两端都含有Fse I-SbfI-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组(它们的重叠和覆盖模式可参见图9)，并且其中pFOS5包含DEV基因组的US7和US8基因以及它们之间的间隔区(US7和US8基因之间的间隔区的核苷酸序列参见SEQ ID NO：5)。关于该5粘粒系统本发明人已经申请专利，申请号为201010207207.8，题目为“鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆系统及其构建方法和应用”，申请日期为2010年6月13日。 

实施例4.在DEV基因组的US7、US8基因之间的间隔区中插入SV40-HA表达框架(SEQ ID NO：1)的重组突变粘粒的构建 

基于上述实施例1-3结果，在所选择的5粘粒组成员pFOS5中DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区(SEQ ID NO：5)中，具体地，US7和US8基因之间的间隔区共223bp，本研究中，该间隔区缺失了其中第108至111位的四个核苷酸，代之以插入SV40-HA表达框架(SV40-HA表达框架的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其中包含SV40启动子，也参见图13，其中斜体加粗部分为HA基因(SEQ ID NO：4))，构建1个重组突变粘粒，pFOS5us78SV40HA(该突变粘粒的图谱如图8所示，其构建模式可参见图9)。在本研究中，本发明人发现，HA基因的插入位置不影响其对鸭病毒性肠炎病毒的免疫效果。但HA基因插入其他位置，是否会影响其对鸭病毒性肠炎病毒的保护效果需要实验来证明。 

FOS5us78SV40HA粘粒的构建过程简述如下： 

4.1pUC ccdB kan的构建： 

用表1所示的三对引物(由TaKaRa公司合成)分别对Invitrogen公司Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2T 1Competent Cells试剂盒中提供的“RfA”(其中基因为aatR1-氯霉素-ccdB-aatR2)基因(SEQ ID NO：2)进行多重PCR扩增。 

表1：用于克隆“Rfkan”(其中基因为aatR1-卡那霉素-ccdB-aatR2)基因的PCR引物 

其具体过程简述如下：分别用tR1和tR2，以及ccdB1和ccdB2这两对引物从Reading Frame Cassette A中扩增得到aatR1基因及ccdB-aatR2基因，其反应条件为：95℃5min-35*(94℃45s-54℃45s-72℃45s)-72℃10min。然后用P6K1和P6K2这对引物从pMOD6质粒(购自EPICENTRE公司)中扩增到卡那霉素抗性基因，其反应条件为：95℃5min-35*(94℃45s-54℃45s-72℃45s)-72℃10min。分别纯化这三个片段DNA，并以此三个片段共同作为模板，以tR1和ccdB2作为引物，扩增得到RfKan基因(SEQ ID NO：3)，即其基因为aatR1-卡那霉素-ccdB-aatR2，其反应条件为：95℃5min-35*(94℃45s-54℃45s-72℃1.5min)-72℃10min。 

并将得到的“RfKan”片段利用XbaI和HindIII克隆入pUC18载体(购自TaKaRa公司)中，获得pUC ccdB kan，如图3所示。 

4.2pFOS5us78Kan ccdB粘粒的构建： 

用表2所示的引物US78ccd1和US78ccd2(由TaKaRa公司合成)从上述构建的pUC ccdB kan中扩增带有重组臂的ccdB基因，其PCR反应条件为：95℃5min-35*(94℃45s-54℃45s-72℃2min)-72℃10min。用Gene Bridges公司的Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒将所 扩增的片段克隆入pFOS5粘粒中，获得pFOS5us78Kan ccdB粘粒，即在pFOS5粘粒的US7和US8基因间插入ccdB和卡那霉素抗性基因，如图4所示。 

表2：用于从pUC ccdB kan中扩增带有重组臂的ccdB基因的引物 

4.3pENTR MCS质粒的构建： 

为方便后续试验，本研究将Invitrogen公司Gateway Vector ConversionSystem with One Shot ccdB Survival 2T1Competent Cells试剂盒中提供的pENTR-gus质粒(购自Invitrogen公司)做了以下改造：将pENTR-gus中的gus基因删除，而加入了BamHI、BglII、EcoRI、EcoRV、SacI、SalI、KpnI和XbaI八个酶切位点。用表3所示的两条引物MCS1和MCS2，用点突变克隆试剂盒(购自Invitrogen公司)将pENTR-gus改造成pENTRMCS，如图5所示。 

表3：用于将pENTR-gus改造成pENTR MCS的引物 

4.4pSI HA质粒的构建： 

用表4所示的引物pHaO31和pHa ORF2，扩增已缺失掉碱性裂解位点的HA基因(SEQ ID NO：4)，该HA基因来源于2006年从安徽分离的 H5N1型禽流感毒株(其详细名称为A/duck/Anhui/106/2006(H5N1)，由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构)，也就是目前用于禽流感防治的5系苗的种毒HA基因。用Not I和Nhe I(购自New England Biolabs)酶切将该已缺失掉碱性裂解位点的HA基因连入pSI质粒(购自Promega公司)中，成功构建pSI HA，如图6所示。其中pSI质粒包含SV40启动子(见图6)。 

表4：用于构建pSI HA的引物 

  引物名称   序列   pHaO31 5’-AAT GCT AGC CGC CAC CAT GGA GAA AAT AGT GCT TCT-3’  pHa ORF2 5’-GAT GGC GGC CGC TTAAAT GCAAAT TCT GCA TT-3’

4.5pENTR sv40-ha质粒的构建： 

用表5所示的引物entryha1和entryha2，从上述构建成功的pSI HA中扩增HA基因，并用BamHI酶切位点将其克隆入已构建的pENTR MCS中(BamHI酶购自New England Biolabs公司)，获得pENTR sv40-ha，如图7所示。 

表5：用于构建pENTR sv40-ha的引物 

  引物名称   序列   entryha1   5’-TGA GGA TCC GGG CGG AGC CTA TGG AAAA-3’   entryha2   5’-CGA GGA TCC CAG CCC GGA TCC TTA TCG A-3’

4.6pFOS5us78SV40HA粘粒的构建： 

将pFOS5us78Kan ccdB和pENTR sv40-ha利用Invitrogen公司Gateway Vector Conversion  System  with  One  Shot  ccdB  Survival  2 T1Competent Cells试剂盒的作用，使pENTR sv40-ha中的sv40-ha表达框架替换pFOS5us78Kan ccdB中的kan ccdB基因，从而获得在US7和US8之间的间隔区中插入sv40-ha表达框的粘粒pFOS5us78SV40HA，如图8所示。具体地，所述sv40-ha表达框架替换所述DEV基因组US7和US8 之间的间隔区(SEQ ID NO：5)的第108到111位的四核苷酸片段。 

实施例5.重组病毒的拯救 

用Qiagen公司的中提试剂盒提取pFOS 1、pFOS2、pFOS3、pFOS4(由实施例1-3构建和筛选)和pFOS5us78SV40HA(由实施例4构建)五个粘粒DNA。用Fse I或Sbf I内切酶(购自New England Biolabs公司)将所用粘粒线性化处理，其反应条件如下：Sbf I内切酶20U(也可以使用Fse I或Pme I内切酶)，粘粒10μg，37℃作用1小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，制备转染用DEV DNA。参照Reddy SM(2002)的方法分别将五个粘粒共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF^[28]。pFOS 1、pFOS2、pFOS3、pFOS4和pFOS5us78SV40HA与DEV基因组的关系如图9所示。 

其中CEF的制备方法如下：取9-10日龄SPF鸡胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部位，脱碘后无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，并去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎。用0.25％的胰酶(4mL/胚)在37℃水浴中消化4-5min，弃去胰酶，用Hank’s液洗涤2次。加入适量的含血清与双抗生素(青霉素100u/mL，链霉素100mg/mL，二者购自Sigma公司)的M199营养液(购自HyClone)，吹打使细胞分散，用四层纱布过滤后制成10⁶-10⁷细胞/毫升的细胞悬液，最后分装于培养瓶中37℃培养。然后，参照Reddy SM(2002)的方法分别将上述五个粘粒共转染次代CEF^[3]，转染6-9天后可观察到细胞圆缩等典型病变的出现。拯救出重组病毒株，命名为rDEVus78Ha，该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株于2010年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC V201025。 

实施例6.重组病毒HA表达免疫荧光及蛋白质印迹(western blot)鉴定 

将拯救的重组病毒rDEVus78Ha和亲本病毒DEV分别接种次代CEF。待80％细胞出现病变时用间接免疫荧光和蛋白质印迹(western blot)检测方法检测HA基因的表达情况。 

其中间接免疫荧光步骤简述如下：待感染了rDEVus78Ha和DEV的次代CEF 80％细胞出现病变，用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS洗3 次，加入用1％BSA封闭液按1∶100的比例稀释的鸡抗HA抗体(由本发明人所在的国家禽流感参考实验室制备并保存)，37℃作用1小时。用PBST洗3次，每次10分钟。用绿色荧光蛋白(GFP)标记的羊抗鸡IgG抗体(购自Sigma公司)在37℃作用1小时。用PBS洗3次，观察并拍照。 

蛋白质印迹步骤简述如下：分别收集80％细胞出现病变的感染了重组病毒rDEVus78Ha和亲本DEV的次代CEF。进行SDS-page电泳，用转膜液浸泡尼龙膜(购自Sartorius公司)和滤纸10分钟，进行湿转，转膜条件为电压20mA/cm2，4℃过夜。用PBS洗膜2次，每次5分钟。将尼龙膜放在平皿中，加5％脱脂乳封闭液浸膜，37℃摇荡1小时。加入用1％BSA封闭液按1∶100的比例稀释的鸡抗HA抗体(由本发明人所在的国家禽流感参考实验室按常规方法制备并保存)(作为一抗)，按每平方厘米加0.1ml的比例加入一抗液体，室温摇荡1小时。用PBST洗膜3次，每次10分钟。加入用1％BSA封闭液按1∶1000的比例稀释的过氧化物酶标记的抗鸡IgG抗体(购自Sigma公司)(作为二抗)，按每平方厘米加0.1ml的比例加入二抗液体，室温摇荡1小时。用PBST洗膜3次，每次10分钟。最后用准备好的增敏二氨基联苯胺(DAB)(购自碧云天公司)显色并照相。 

实施例7.遗传稳定性检测 

将重组病毒rDEVus78Ha在CEF中连续传20代，提取亲本DEV病毒和重组病毒rDEVus78Ha的DNA，用PCR方法鉴定，所用引物为Pus78d1：5’-ACG CAAATTATG TCG TTG TT-3’；Pus78d2：5’-TTG AGG TTC CGTAGT CTG G-3’。并对其进行测序分析。 

实施例8.血凝抑制实验抗体效价(HI抗体)诱导情况 

将重组rDEVus78Ha和亲本DEV分别按10⁶TCID₅₀感染4周龄的SPF鸭(由哈尔滨兽医研究所动物房提供，公母各3只，体重约500克)6只，每周采血，分离血清，测其血凝抑制抗体(HI抗体)。 

步骤如下：于96孔血凝板中倍比稀释血清，之后加入4单位抗原(即禽流感病毒)，所述抗原用A/duck/Anhui/106/2006(H5N1)毒株(由本发明 人所在国家禽流感参考实验室保存)制备，室温下作用30分钟，之后加入25微升鸡红细胞(由本研究室按常规方法制备)。观察结果。 

实施例9.动物实验 

将亲本DEV病毒与重组病毒rDEVus78Ha分别以10⁵TCID₅₀免疫4周龄SPF鸭，每组10只(由哈尔滨兽医研究所动物房提供，公母各3只，体重约500克)。3周后分别用100DLD₅₀的DEV强毒(CVCC AV1222，购自中国兽医药品监察所)；和A/duck/LN/51/2005(H5N1)、A/duck/HuB/49/2005(H5N1)两株流感病毒(由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构)攻击，观察重组病毒对DEV强毒及流感的保护效果。 

结果 

1.HA基因表达检测 

用第四代重组病毒rDEVus78Ha感染CEF后，待80％细胞出现病变时用间接免疫荧光和蛋白质印迹检测方法检测HA基因的表达情况。其结果如图10所示。重组病毒能在CEF中良好的表达HA蛋白。 

2.遗传稳定性检测 

将重组病毒连续传20代，提取亲本DEV病毒和重组病毒的DNA，用PCR方法鉴定。如图11所示。并对其进行测序分析(测序结果未显示)，未见缺失或突变的发生。 

3.HI抗体持续期实验 

重组rDEVus78Ha和亲本DEV分别按10⁶TCID₅₀感染4周龄的SPF鸭6只，每周采血测其HI抗体。其结果如图12所示。第一周的HI抗体效价平均为0，第二、三、四周的平均效价分别为2.83、3.67和4.67。作为对照的用亲本DEV感染SPF鸭的HI抗体均为0(结果未显示)。 

4.动物实验结果 

将亲本DEV病毒与重组病毒rDEVus78Ha分别以10⁵TCID₅₀免疫4周龄SPF鸭，每组10只。3周后分别用100DLD₅₀的DEV强毒(CVCCAV1222)和A/duck/LN/51/2005(H5N1)、A/duck/HuB/49/2005(H5N1)两株流感病毒攻击，观察重组病毒对DEV强毒及流感的保护效果。结果不论是针对鸭病毒性肠炎还是针对禽流感，用重组病毒rDEVus78Ha免疫的鸭子得到100％保护。其结果如表6所示。 

表6：动物实验结果表 

注：其中Aiv1：A/duck/LN/51/2005(H5N1)；Aiv2：A/duck/HuB/49/2005(H5N1)；DEV强毒：CVCC AV1222；保护结果的表示方式(*/10)为10只受试SPF鸭中得到保护的SPF鸭的数目；其中PBS用作阴性对照。 

讨论 

本研究通过利用鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆的平台(即，本发明人构建的DEV病毒5粘粒组，参见实施例1-3，也可参见本发明人的申请号为201010207207.8的发明专利申请)，成功获得重组禽流感HA基因的鸭病毒性肠炎病毒，在国内外尚属首次。 

通过对重组病毒rDEVus78Ha在体内和体外生长特性的检测来看，本研究首次证明在DEV基因组的US7和US8之间的间隔区能稳定插入以 SV40为启动子的HA基因表达框架。该重组病毒能在体外良好表达HA基因。用其对鸭进行一次免疫后不但能提供与原疫苗株DEV相当的免疫效果，且HA基因在SPF鸭体内能得到良好的表达，能诱导良好的免疫效果，能抵抗禽流感强毒的攻击。 

由此可见，本发明获得的表达禽流感病毒HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025(其命名为rDEVus78Ha)可以用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒引起的传染病的疫苗，用于预防鸭病毒性肠炎病毒和禽流感病毒在鸭、鹅和其它雁形目禽类中引起的传染病。 

因此，本发明还提供包括表达流感病毒HA基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025(亦即，本发明所述的rDEVus78Ha)、以及药用佐剂、赋形剂等的疫苗。本领域技术人员根据所述疫苗的应用目的、进行免疫的禽类等因素，可以容易地选择适合的药用佐剂、赋形剂等。。 

我国有悠久的食用鸭肉和鸭蛋的历史，其在我国的食品消费中占有重要的地位。同时，我国是世界上最大的鸭生产国。根据联合国粮农组织(FAO)统计，2002年我国鸭存栏量6.61亿只，分别占世界和亚洲鸭总存栏量的69.7％和78.3％^[30]。近年来，鸭的蛋、肉和绒还出口到其他国家，为部分地区增加农民收入起到了重要作用。虽然我国是养鸭大国，但饲养水平不高，鸭的疾病控制及不同时期蛋、肉鸭饲料营养需求等研究相对于其它家畜家禽滞后。鸭等水禽是所有亚型流感病毒的天然储存库，同时，禽流感还会引起大量的鸭死亡^[31，32]。鸭瘟与禽流感、鸭肝炎是目前威胁养鸭业最为重要的三种的病毒病。目前，鸭肝炎的预防主要靠给雏鸭注射抗体，至今没有疫苗。用于禽流感预防的是与鸡相同的灭活苗。但从本研究室每年对水禽的流行病学调查结果来看，流感免疫状况并不理想。而由于DEV的高死亡率，大部分养殖户都会对鸭群进行DEV的免疫，因而DEV的免疫普及率要高于禽流感。本疫苗不但能给免疫鸭提供良好的对DEV的免疫效果，还能提供良好的对禽流感的免疫效果。活疫苗较之目前用于鸭流感防治的灭活疫苗价格要便宜很多，且在细胞免疫水平能也较之灭活疫苗要好。因此，本疫苗的研制不但具有重要理论及实践意义，同时也有非常重要的经济和公共卫生意义。 

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。 

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