公开/公告号CN102481321A
专利类型发明专利
公开/公告日2012-05-30
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申请/专利权人 先进科技及再生医学有限责任公司;
申请/专利号CN200980156986.9
申请日2009-12-19
分类号A61K35/44;C12N5/073;
代理机构中国专利代理(香港)有限公司;
代理人权陆军
地址 美国马萨诸塞州
入库时间 2023-12-18 05:30:07
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-12-19
授权
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2017-10-27
著录事项变更 IPC(主分类):A61K35/51 变更前: 变更后: 申请日:20091219
著录事项变更
2014-07-23
著录事项变更 IPC(主分类):A61K35/44 变更前: 变更后: 申请日:20091219
著录事项变更
2014-07-23
专利申请权的转移 IPC(主分类):A61K35/44 变更前: 变更后: 登记生效日:20140702 申请日:20091219
专利申请权、专利权的转移
2012-07-11
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K35/44 申请日:20091219
实质审查的生效
2012-05-30
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与相关申请的交叉参考
本申请要求于2008年12月19日提交的美国临时专利申请号61/139,169的利益，其内容在此整体引入作为参考。
发明领域
本发明总的来说涉及用于通过施用细胞治疗神经病性疼痛的组合物、方法和试剂盒。具体地，本发明提供对患者局部或全身施用细胞以正常化神经系统的炎症或变性或病理学状态。这种病理学可以在亚细胞、细胞和组织环境下，从而修饰神经元相互作用和减少疼痛。
发明背景
各种专利和其它出版物在整个本说明书提及。这些出版物中的每一个都在此整体引入作为参考。
慢性疼痛大体上是影响全体美国人中30-60%的公众健康问题。在大多数情况下，在客观疾病所见(疼痛区域的X射线、MRI和CT扫描)和主观疼痛报告之间具有很少的到没有相关性。慢性疼痛包括持续超过对于疾病或损伤的正常愈合时间的疼痛，与慢性变性疾病或持续性神经病学状况有关的疼痛，显现或持续甚至复发数月至数年而没有可确认的原因的疼痛，或为与癌症相关的疼痛。
慢性疼痛常常由神经系统障碍引起，也称为神经病或神经病性疼痛。神经病性疼痛一般伴有组织损害，包括被损害、功能障碍或损伤的神经纤维。神经病性疼痛可由多种问题引起，包括病理学损害、神经变性过程、或外周或中枢神经系统的部分的长时期功能障碍。当没有可检测的损害可以被评估或限定时，神经病性疼痛也可以存在。
临床和科学文献指出神经病性疼痛具有两个组分：中枢可塑性和外周神经中的改变。中枢可塑性可以是CNS任何水平的受体群或受体敏感性中的改变的结果。此外，有证据指出，改变发生在神经元中和小胶质细胞中。事实上，近来的数据指出小胶质细胞活性是脊髓的中枢致敏的重要介质。已知这种中枢致敏在介导慢性炎症以及神经病性疼痛中起主要作用。在外周，已知施旺细胞-轴突相互作用中的改变在神经病性疼痛的诱导和维持中起作用。
用于慢性疼痛的标准治疗过程涉及阶梯方法，其开始于非-阿片样镇痛剂并从中度阿片剂进展到强力阿片剂。阿片剂常常联合其它试剂使用。以此方式，医生能够监控和调整试剂的剂量，以限制阿片样物质的不希望的副作用，其包括镇静状态、认知缺损、肌阵挛、成瘾、耐受性和呼吸压低。然而，阿片样物质也也可以引起恶心、便秘、意识错乱(confusion)、呼吸压低和依赖性。此外，阿片剂耐受性是被充分证明的在慢性疼痛患者中观察到的副作用。
用于治疗慢性疼痛的其它试剂包括既抗炎又镇痛的非类固醇消炎药(NSAIDs)、抗抑郁药、抗惊厥剂、局部试剂、大麻素、肉毒杆菌毒素、NMDA拮抗剂、抗癫痫药、抗抑郁药和膳食补充剂。然而这些化合物都有副作用，其可以是虚弱，包括CNS抑郁、心血管作用、胃肠紊乱、溃疡、肾损害、性欲减低和超敏反应。此外，这些化合物必须重复采用，一般地，多于每日一次，并且一些化合物随着时间过去变得无效，从而导致耐药。
此外，目前的治疗在许多临床上严重的慢性神经病性障碍诸如糖尿病性神经病、颈神经根病、神经痛性肌萎缩、HIV 神经病、神经痛性肌萎缩或带状疱疹后神经痛中不能减轻疼痛。目前的医学策略难处理的其它慢性状况与外周和/或中枢疼痛相关，诸如脊髓后损伤、肌营养不良、三叉神经痛、幻肢痛、纤维肌痛综合征、灼痛、以及糖尿病性和酒精性多发性神经病。由多发性硬化或脊髓损伤造成的脊髓起源的痉挛状态是常常抵抗目前的治疗并且可以导致慢性疼痛的另一种状况。
目前，对于在神经损害位点使用移植的细胞以帮助神经细胞损害的修复或逆转具有兴趣。例如，一些研究者已将神经细胞移植到患有感觉神经通路障碍或损伤的患者的损伤位点。参见，美国专利申请号09/163,684。其它研究者集中于干细胞移植以重建靶组织，从而恢复生理学和解剖学功能性。例如，Klass向神经病性疼痛模型施用含干细胞群的骨髓单核细胞以发现疼痛是否减少。参见Klass等人, Anesth Analg., 2007; 104:944 – 49。目前不存在施用细胞来减少神经病性疼痛的可行且可靠的方法。
已知在治疗慢性和神经病性疼痛中的目前的限制，对于用不需要在每日基础上施用的治疗来减轻个体中的慢性和神经病性疼痛存在需求。
发明概述
呈现的问题通过本文描述的说明性实施方案的组合物、方法和试剂盒得到解决。这些实施方案提供用于通过施用细胞群治疗慢性和神经病性疼痛的方法。虽然不希望受到任何作用机制的束缚，但发明人认为施用的细胞具有正常化施旺细胞-轴突相互作用和/或小胶质细胞-神经元相互作用处的炎症或变性的细胞和组织环境以减少疼痛的能力。进一步地，施用的细胞可阻断异位神经元发放，从而减少疼痛。本发明至少部分基于下列发现：可以将细胞，包括来自人脐带组织的细胞，局部或全身地施用给需要慢性疼痛治疗的患者。
本发明的特定实施方案涉及神经细胞的直接修复、再生、置换，或神经细胞的修复、再生或置换的支持，用于治疗神经损害、损伤和/或疼痛。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗患有神经损害、损伤和/或疼痛的受试者的方法，其通过施用有效量的细胞群以至于所述损害、损伤和/或疼痛得以治疗而实现。在各种实施方案中，施用的细胞是脐带组织来源的细胞。
在一些实施方案中，细胞群被局部施用到疼痛区域和/或神经损害位点。施用位点可为医学专业人员确定为最有效的任何位点，并且因而可接近或远离疼痛或神经损害位点。细胞施用可通过任何方式，包括但不限于皮下，盘内(intra-discal)，神经内，或肌内，经由具有针和/或导管的注射器递送，以及用液体、水凝胶或支架植入。而且，在一些特定实施方案中，细胞群用水凝胶施用。进一步的实施方案针对特定的水凝胶，诸如胶原、去端肽胶原(atelocollagen)、血纤蛋白构建体和凝血酶-血纤蛋白构建体。此外，一些实施方案包括平行、顺序注射或直接配制到水凝胶中的一种或多种生长因子的应用。
在其它实施方案中，细胞被全身施用。在这些实施方案中，细胞可通过允许全身分配细胞的任何方式施用，包括但不限于，肌内，静脉内或动脉内递送，其通过带有针和/或导管的注射器、带有或没有泵设备来实施。在一些特定实施方案中，细胞群用水凝胶施用。进一步的实施方案针对特定的水凝胶，诸如胶原、去端肽胶原、血纤蛋白构建体、凝血酶-血纤蛋白构建体。此外，一些实施方案包括包括平行、顺序注射或直接配制到水凝胶中的一种或多种生长因子的应用。
在一些实施方案中，细胞群被体外诱导，以分化成特定类型的细胞。在其它实施方案中，细胞被基因工程改造以产生促进慢性疼痛治疗的基因产物。
在一些实施方案中，细胞群连同至少一种其它试剂施用，包括但不限于，选择的细胞外基质组分、抗凋亡试剂、抗炎化合物、免疫抑制剂或免疫调谐剂、局部麻醉剂和其它血管生成因子。其它试剂可以与细胞群同时、先于细胞群或在细胞群之后施用。在一个实施方案中，组合物进一步包括试剂或选自神经营养因子的因子中的至少一种。在一个实施方案中，细胞群连同生长因子和/或促进细胞分化成预定的所需神经细胞的其它试剂施用。在另一实施方案中，所需的神经细胞能够分泌一种或多种神经递质。
本发明的其它实施方案特征在于用于治疗患有慢性疼痛的患者的组合物和试剂盒，其包括至少细胞群和药学上可接受的载体。其它组合物和试剂盒实施方案可包括其它试剂、生长因子、和化合物以促进组织生长和/或愈合，以至于慢性疼痛在严重性和时间方面减少。药物组合物和试剂盒被设计和/或配制用于实践如上文和下文概述的本发明的方法。
参考附图和下文的详述，说明性实施方案的其它目标、特征和优点将变得显而易见。
附图简述
图1是显示在构建体中植入4日后hUTC细胞生存力的彩色照片。
图2是显示局部注射对分成构建体、载体和损伤组的动物的作用的图。
图3是显示全身注射对分成构建体、载体和损伤组的动物的作用的图。
图4是显示应用胶原(Colbar)的结果的图。施用对受侵袭侧(左)局部执行。神经病性疼痛的变化是(施用后测试日的分数 - 神经病性疼痛的分数/神经病性疼痛的分数 x 100)。
图5是显示应用胶原(Colbar)的结果的图。施用对对侧(右)局部执行。神经病性疼痛的变化是(施用后测试日的分数 - 神经病性疼痛的分数/神经病性疼痛的分数 x 100)。
图6是显示应用Evicel (Omrix)的结果的图。施用对受侵袭侧(左)局部执行。神经病性疼痛的变化是(施用后测试日的分数 - 神经病性疼痛的分数/神经病性疼痛的分数 x 100)。
图7是显示应用Evicel (Omrix)的结果的图。施用对对侧(右)局部执行。神经病性疼痛的变化是(施用后测试日的分数 - 神经病性疼痛的分数/神经病性疼痛的分数 x 100)。
图8是显示hUTC结果的图。施用是全身的并且神经病性疼痛的变化是(施用后测试日的分数 - 神经病性疼痛的分数/神经病性疼痛的分数 x 100)。
图9是显示hUTC结果的图。施用是全身的并且神经病性疼痛的变化是(施用后测试日的分数 - 神经病性疼痛的分数/神经病性疼痛的分数 x 100)。
图10A-C包含关于图4的统计学结果。
图11A-C包含关于图5的统计学结果。
图12A-C包含关于图6的统计学结果。
图13A-C包含关于图7的统计学结果。
图14A-C包含关于图8的统计学结果。
图15A-C包含关于图9的统计学结果。
图16是对实施例4中的测试程序的操作和处理的示意性描述。
图17提供关于各组的平均体重。
图18是Chung外科手术和通过全身施用的hUTC治疗之后的体重增加。
图19是Von Frey应答的平均δ。使用的计算是：右腿的平均值减左腿的平均值。
图20是Chung外科手术后和在研究第6日全身施用hUTC后腿缩回的Von Frey应答的平均δ。
图21是Chung外科手术和在第6日全身施用hUTC后腿缩回的Von Frey应答的平均δ。
图22是平均Von Frey检查。
图23是Chung外科手术后在研究第6日全身施用hUTC后，爪之间的差异(由右腿的最小缩回Log力除以左腿的Log力表示)。
图24A-C是个体体重的个别数据表。
图25 A-C是Von Frey应答的个别数据表。
发明详述
在下面的说明性实施方案详述中，对构成其一部分的附图进行参考。这些实施方案被足够详细地描述，以使本领域技术人员能够实践本发明，并且理解的是，可以利用其它实施方案并且可以在不背离本发明的精神或范围的情况下进行合理的结构、机械、电和化学改变。为了避免使本领域技术人员能够实践本文描述的实施方案所不需要的细节，该描述可省略本领域技术人员已知的某些信息。因此，下面的详述不以限制性意义采用。
为了更好地阐明本发明，提供下面的定义。
如本文可互换使用的术语"慢性疼痛"和"神经病性疼痛"通常指其中疼痛持续并未能对常规治疗作出响应的状况。这些术语包括长持续时间的疼痛和可以是医学上难治的疼痛。这些术语也包括特征在于神经元兴奋性水平持续增加或受侵袭区域中异常感觉的存在的疼痛。示范性的慢性疼痛状况包括糖尿病性神经病、颈神经根病、神经痛性肌萎缩、HIV 神经病、神经痛性肌萎缩、带状疱疹后神经痛、脊髓后损伤、肌营养不良、三叉神经痛、幻肢痛、灼痛、脊髓起源的痉挛状态、以及糖尿病性和酒精性多发性神经病。
如本文使用的术语"组织位点"、"神经损害"、"神经损伤"和"神经损害位点"是可互换的，并且通常指位于个体神经组织之上、之内或附近的伤口或缺陷；并且可包括但不限于皮组织、血管组织、结缔组织、软骨、脂肪组织、肌肉组织、腱或韧带。该术语可进一步指下列任何组织区域，其不必定是受伤或缺陷的，而是其中希望加入或促进另外组织的生长的区域。该术语也可指虽然没有明显的损伤，但临床观察、测试和患者的报告指示存在异常的神经组织。
如本文使用的术语 "个体"、"患者"或"受试者"通常指任何形式的动物，包括哺乳动物，诸如人和猴，其用药物或治疗组合物或根据所描述的方法进行治疗。如本文使用的术语"异种"指细胞从一个物种的供体移植到不同物种的受试者中。
如本文使用的术语"治疗(treat，treating或treatment)"通常指细胞群施用到遭受慢性疼痛的受试者中之后，疼痛或损伤改善或减少一段时间。该改善或减少也包括任何客观或主观参数，诸如症状的减轻、缓和、减少，或使损伤、病理学或状况对患者更加可耐受，减缓变性或衰落速度，使变性的终点虚弱程度减小，改进受试者的身体或精神健康，或延长存活时间。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括身体检查或神经学检查的结果。
术语"有效期"、"有效时间段"或"有效条件"通常指时间段或其它可控条件(例如，对于体外方法的温度、湿度)，其对于试剂或药物组合物实现其预期结果是必要的或优选的。
如本文使用的术语"有效量"通常指化合物、材料或组合物的浓度或量，如本文所描述的，其有效实现特定的生物学结果。这种结果包括但不限于患有慢性疼痛的患者中神经组织的再生、修复或改进，血流的改进和/或炎症的减少。这种有效活性可例如通过向患有慢性疼痛的患者施用本发明的细胞和/或组合物实现。关于施用给患者的细胞群，有效量通常大于约104个细胞/kg体重，并且在局部递送时可为约104个细胞/kg体重至约 106个细胞/kg体重范围，或在全身递送时可为约105至约107个细胞/kg体重范围。在特定实施方案中，有效量可为约105至约108个细胞/kg体重范围。将意识到待施用的细胞数目将取决于待治疗的障碍的细节变化，所述细节包括但不限于待治疗的尺寸或总体积/表面积，和施用位点对待治疗区域位置的接近度，和医学生物学家熟悉的其它因素。
"干细胞"是未分化的细胞，其由单细胞自我更新和分化以产生后代细胞的能力所限定，包括自我更新祖先、非更新祖先和终末分化细胞。干细胞的特征也在于它们的下列能力：在体外分化成来自多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的各种细胞谱系的功能细胞，以及在移植后产生多胚层的组织，和在注射到胚泡中之后基本上有助于大多数组织，如果不是所有组织的话。
干细胞根据它们的发育潜能被分类为：(1) 全能的；(2) 多潜能的(pluripotent)；(3) 多能的(multipotent)；(4) 寡能的；和(5) 单能的。全能细胞能够产生全部胚胎和胚外细胞类型。多潜能细胞能够产生全部胚胎细胞类型。多能细胞包括能够产生细胞谱系亚群，但全部在特定组织、器官或生理学系统中的那些。例如，造血干细胞(HSC)可以产生包括HSC (自我更新)、血细胞-限制性寡能祖先及为血液正常组分的全部细胞类型和元件(例如，血小板)的后代。寡能细胞可以产生比多能干细胞更加受限的细胞谱系亚群。单能细胞能够产生单细胞谱系(例如，生精干细胞)。
干细胞也基于获得它们的来源进行分类。"成体干细胞"通常是在包含多个分化的细胞类型的组织中发现的多能的未分化细胞。成体干细胞可以自我更新。在正常情况下，其也可以分化以产生其从中起源的组织并且有可能地其它组织类型的特化的细胞类型。"胚胎干细胞"是来自胚泡期胚胎的内细胞团的多潜能细胞。胎儿干细胞是起源自胎儿组织或胎膜的干细胞。"产后干细胞"是基本上起源于出生后可得的胚外组织，即胎盘和脐带的多能或多潜能细胞。已发现这些细胞拥有多潜能干细胞特有的特征，包括快速增殖和分化成许多细胞谱系的潜能。产后干细胞可为血液来源的(例如，如得自脐带血的那些)或非血液来源的(例如，如得自脐带和胎盘的非血液组织)。
各种术语用于描述培养中的细胞。"细胞培养"通常指细胞从活生物取得并在受控条件下生长("在培养中"或"被培养的")。"原代细胞培养"是在第一传代培养之前从生物(一个或多个)直接取得的细胞、组织或器官的培养。当在促进细胞生长和/或分裂的条件下将细胞置于生长培养基中时，细胞在培养中"扩增"，从而导致产生较大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，细胞增殖速度有时通过细胞数目加倍所需的时间量测量。这被称为"倍增时间"。
如本文使用的术语"标准生长条件"指在37℃、在包含5% CO2的标准气氛和维持在约100%的相对湿度中培养细胞。虽然前述条件对于培养是有用的，但要理解的是，将认识到本领域中可用于培养细胞的选项的技术人员能够改变该条件。
"条件培养基"是其中特定细胞或细胞群已被培养并且然后被取出的培养基。当细胞在培养基中培养时，它们可分泌可以对其它细胞提供营养支持的细胞因子。这种营养因子包括但不限于激素、细胞因子、细胞外基质(ECM)、蛋白质、小泡、抗体和颗粒(granule)。包含该细胞因子的培养基是条件培养基。
"分化"是下列过程，通过该过程，非特化的 ("未定型的")或特化较差的细胞获得特化细胞的特征，例如，诸如神经细胞或肌细胞。"分化的"细胞是已占据细胞谱系中更加特化的("定型的")位置的细胞。当用于分化过程时，术语"定型的"指已在分化途径中行进到一点的细胞，在该点，在正常情况下，其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型亚型，并且在正常情况下不能分化成不同细胞类型或回复成分化较差的细胞类型。"去分化"指下列过程，通过该过程，细胞回复到细胞谱系中特化(或定型)较差的位置。如本文所用的，细胞的"谱系"限定细胞的遗传，即，其来自哪些细胞和其可以产生什么细胞。细胞谱系将细胞置于发育和分化的遗传安排中。
广义地，"祖细胞"是具有产生比其本身更加分化的后代的能力、并且仍然保持补充祖先库的能力的细胞。通过该定义，干细胞本身也是祖细胞，终末分化细胞的更直接前体也如此。当提及本发明的细胞时，如下文更详细地描述的，祖细胞的该宽泛定义可被使用。较狭义地，祖细胞常常被限定为在分化途径中间的细胞，即，其起自干细胞并在成熟细胞类型或细胞类型亚型产生的中间。该类型的祖细胞通常不能自我更新。因此，如果该类型的细胞在本文中提及，其将被称为"非更新祖细胞"或称为"中间祖细胞或前体细胞"。
几个术语在本文中关于细胞或组织移植或细胞置换疗法使用。术语"自体转移"、"自体移植"、"同体移植"等指其中细胞或移植供体也是细胞或移植受者的治疗。术语 "同种异体转移"、"同种异体移植"、"同种异体移植物"等指其中细胞或移植供体与受者是相同物种但不是相同个体的治疗。其中供体的细胞已与受者进行组织相容性匹配的细胞转移有时被称为"同系转移"。术语 "异种转移"、"异种移植"、"异种移植物"等指其中细胞或移植供体与受者是不同物种的治疗。
如本文使用的，短语"神经细胞"既包括神经细胞(即，神经元，例如，单极、双极或多极神经元)和它们的前体又包括神经胶质细胞(例如，大神经胶细胞诸如少突胶质细胞、施旺细胞和星形胶质细胞或小胶质细胞)和它们的前体。
本发明中使用的细胞通常被称为"产后细胞"或"产后-来源的细胞" (PPDC(s))"。该细胞更具体地为"脐-来源的细胞"或"脐带-来源的细胞"(UDC(s))，或"脐带组织来源的细胞"(UTC(s))。此外，该细胞可被描述为干细胞或祖细胞，后一术语被广义地使用。术语"来源的"用于指示，细胞已得自它们的生物学来源并生长或另外地在体外操作(例如，在生长培养基中培养以扩增群体和/或产生细胞系)。本发明脐干细胞的体外操作和脐-来源的细胞的独特特征在下文详细描述。
如本文使用的术语"分离"通常指已从其天然环境中分离的细胞。该术语包括从其天然环境中总的物理分离，例如，从供体动物取出。在优选的实施方案中，分离的细胞在组织中不存在，即，细胞从与其正常接触的邻近细胞中分离或解离。优选地，细胞作为细胞悬浮液施用。如本文使用的，短语"细胞悬浮液"包含与培养基接触和已例如通过使一片组织接受轻柔研磨被解离的细胞。
如本文使用的，术语"生长培养基"通常指足以培养脐带组织来源的细胞的培养基。具体地，用于培养本发明的细胞的一种培养基包括Dulbecco's改良必需培养基 (DMEM)。特别优选的是DMEM-低葡萄糖(DMEM-LG) (Invitrogen, Carlsbad, Ca.)。DMEM-LG优选地补加有血清，最优选地胎牛血清或人血清。一般地，加入15% (v/v)胎牛血清(例如，确定成分胎牛血清，Hyclone, Logan Ut.)连同抗生素/抗真菌剂(优选地100单位/毫升青霉素，100毫克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素B; Invitrogen, Carlsbad, Ca.)和0.001% (v/v) 2-巯基乙醇(Sigma, St. Louis Mo.)。在一些情况下，使用不同的生长培养基或提供不同的补充，并且这些正常在文中指示为生长培养基的补充。在某些化学成分确知培养基中，细胞可在根本不存在血清的情况下生长。在这种情况下，细胞可需要某些生长因子，其可以加入培养基以支持和维持细胞。待加入用于在无血清培养基中生长的目前优选的因子包括bFGF、EGF、IGF-I和PDGF中的一种或多种。在更优选的实施方案中，将因子中的两种、三种或全部四种加入无血清或化学成分确知培养基中。在其它实施方案中，将LIF加入无血清培养基以支持或改进细胞的生长。
术语"细胞系"通常指由原代细胞培养物的一次或多次转种形成的细胞群。每轮传代培养被称为传代。当细胞被传代培养时，它们被称为已被"传代"。具体的细胞群或细胞系有时通过其被传代的次数进行提及或表征。例如，已传代10次的培养的细胞群可被称为P10培养物。原代培养物，即，细胞从组织分离后的第一培养物被指定为P0。第一传代培养后，细胞被描述为第二培养物(P1或传代1)。第二传代培养后，细胞变为第三培养物(P2或传代2)等等。本领域的技术人员将理解，在传代时间段期间可有许多群体倍增；因此，培养物的群体倍增数目大于传代数目。在传代之间的时间段期间，细胞的扩增(即，群体倍增数目)取决于许多因素，包括但不限于，接种密度、基质、培养基、生长条件和传代之间的时间。
可与术语"生物相容性载体"或"生物相容性介质"互换使用的术语"药学上可接受的载体"或"药学上可接受的介质"通常指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，其不仅与待治疗性施用的细胞和其它试剂相容，而且也适于与人类和动物的组织接触使用，而没有过度的毒性、刺激、变态反应或与合理的利益/风险比相称的其它并发症。如本文更详细地描述的，适于在本发明中使用的药学上可接受的载体包括液体、半固体(例如，凝胶)和固体材料(例如，细胞支架和基质、管、片和本领域已知的和本文更详细地描述的其它这种材料)。这些半固体和固体材料可进行设计以抵抗体内降解(非-生物可降解的)或它们可进行设计以在体内降解(生物可降解的，生物可侵蚀的)。生物可降解材料可进一步为生物可再吸收的或生物可吸收的，即，它可溶解和吸收到体液中(水溶性植入物是一个例子)，或降解并最终从身体消除，或是通过转化成其它材料或是通过天然途径破坏和消除。一旦植入到体内，生物降解速度就可以根据希望的释放速度而变化。
如本文使用的术语"基质"通常指连同细胞施用给患者的生物可降解的和/或生物可再吸收的材料。基质可充当临时支架，直至被新生长的细胞取代。在一些实施方案中，基质可提供神经营养因子或与细胞结合使用的其它试剂的持续释放，并且可提供用于发展患者中组织生长的结构。在其它实施方案中，基质仅提供用于发展组织的临时支架。基质可以是颗粒形式(直径大于10微米的大颗粒或直径小于10微米的微粒)，或其可以是结构上稳定的三维植入物形式(例如，支架)。基质可以是浆液、水凝胶或可选地三维结构诸如立方体、圆柱体、管、块、薄膜、片或适当的解剖形式。
如本文使用的术语"支架"通常指三维多孔结构，其提供用于细胞生长的模板。支架由在体内随时间过去降解的生物可降解的和/或生物可再吸收的材料制成。支架降解花费的时间长度可取决于材料的分子量。因而，较高分子量材料可产生较长时间段保持它们的结构完整性的聚合物支架；而较低分子量导致较慢的释放和较短的支架寿命。支架可由本领域已知的任何方式制成。可以用于形成支架的聚合物的例子包括天然和合成聚合物。
在本发明的一些实施方案中，支架可灌输有、包被有或包含细胞群、生长因子或促进细胞生长的其它营养物。在一些优选的实施方案中, 支架包含生长诱导剂，包括神经营养蛋白。进一步地，生长诱导剂可为合成或天然产生的，并且可为生长诱导剂的片段、衍生物或类似物。
"神经营养因子"或"营养因子"被定义为促进细胞存活、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞增加的活性的物质。
具体实施方案
在本文描述的各种实施方案中，本发明特征在于用于治疗慢性和神经病性疼痛的方法和药物组合物。这些方法和药物组合物进行设计以刺激和支持神经组织生长或愈合，并且改进包绕神经组织的组织的再生和修复，包括但不限于，皮组织、血管组织、结缔组织、软骨、脂肪组织、肌肉组织、腱或韧带。
本发明的细胞包括但不限于来自产后组织，具体地脐组织等的祖细胞和细胞群。优选细胞的更详细解释可见于下文。
细胞
本发明的优选细胞的分离和表征的描述在以整体并入的美国专利公开号 2005/0032209、2005/0058631和2005/0054098中描述。
在一些实施方案中，细胞是干细胞。干细胞是通过单细胞自我更新和分化以产生后代细胞的能力限定的未分化细胞，包括自我更新祖先、非更新祖先和终末分化细胞。
在一个优选的实施方案中，干细胞是脐带组织来源的细胞。为了分离脐带组织来源的细胞，脐带在足月或早产妊娠终止时或在足月或早产妊娠终止后不久，例如在胞衣娩出后回收。脐带组织可从出生位点转运到实验室的无菌容器诸如瓶、烧杯、培养皿或袋中。容器可含有溶液或培养基，包括但不限于盐溶液，诸如Dulbecco's 改良 Eagle's 培养基 (DMEM) (也称为 Dulbecco极限必需培养基)或磷酸缓冲盐水(PBS)，或用于转运用于移植的器官的任何溶液，诸如University of Wisconsin 溶液或全氟化学溶液。一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，诸如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素可加入培养基或缓冲液。脐带组织可用抗凝剂溶液诸如含肝素溶液漂洗。优选的是在细胞提取前将组织保持在约4至约10℃。甚至更优选的是在细胞提取前不冷冻组织。
脐带组织来源的细胞优选地在无菌环境下分离。脐带可通过本领域已知的方式从胎盘分离。在分离脐带组织来源的细胞之前，优选地从产后组织除去血液和碎片。例如，可用缓冲溶液洗涤产后组织，包括但不限于磷酸缓冲盐水。洗涤缓冲液也可包含一种或多种抗真菌和/或抗生素试剂，包括但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
优选地通过机械力(切碎或剪切力)解聚包括全部脐或其片段或部分的产后组织。在目前优选的实施方案中，分离程序也可利用酶促消化过程。已知许多酶在本领域中用于从复合组织基质分离个别细胞以促进在培养物中生长。消化酶范围为弱消化(例如，脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶，分散酶)至强消化(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)且是可购得的。这种酶的一个非穷尽性列举包括粘液溶解酶活性、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(诸如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。目前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘液溶解活性的酶活性。例如，已知胶原酶对于从组织分离各种细胞是有用的。脱氧核糖核酸酶可以消化单链DNA并且可以最小化分离期间的细胞-团块化。优选的方法涉及用胶原酶和分散酶，或胶原酶、分散酶和透明质酸酶的酶促处理。技术人员将认识到，在本领域已知许多这种酶处理用于从各种组织来源分离细胞，并且被充分装备以评估新的或另外的酶或酶组合在分离本发明的细胞中的效用。优选的酶处理可以是约0.5至2小时长或更长。在其它优选的实施方案中，在解离步骤的酶处理过程中，于37℃温育组织。
用于选择最适当的培养基、培养基制备和细胞培养技术的方法是本领域公知的，并且在多种来源中描述，包括Doyle等人, (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture Laboratory Procecdures, John Wiley & Sons, Chichester；和Ho 和 Wang (eds.), 1991, Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Boston，它们引入本文作为参考。
在本发明的一些实施方案中，将细胞传代或移动至分开的培养容器中，所述分开的培养容器含有与最初使用的相同或不同类型的新鲜培养基，在所述分开的培养容器中细胞群可进行有丝分裂扩增。本发明的细胞可在介于传代0和衰老之间的任何点使用。优选将细胞传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，并优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以证实已经分离到细胞克隆群。
在本发明的一些方面，将产后组织中存在的不同细胞类型分级分离为亚群，从所述亚群中可以分离脐带组织来源的细胞。分级分离或选择可使用用于细胞分离的标准技术来完成。这种技术包括，但不限于，酶促处理以将产后组织解离成其组分细胞，然后是具体细胞类型的克隆和选择，包括但不限于基于形态学和/或生物化学标记的选择；希望的细胞的选择性生长(阳性选择)，不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于在混合群中有差别的细胞可凝集性的分离，例如，采用大豆凝集素；冻融程序；在混合群中有差别的细胞粘附性质；过滤；常规的和区带离心；离心淘析(逆流(counter-streaming)离心)；单位重力分离；逆流分布；电泳；和荧光激活细胞分选术(FACS)。
按需要改变培养基。例如，通过用移液管从皿中小心地吸出培养基并补充以新鲜培养基。继续温育，直至足够数目或密度的细胞在皿中积累。其后，可除去存在的任何原始的外植组织部分，并且通过胰蛋白酶消化使用标准技术或通过使用细胞刮棒从皿中分离剩余的细胞。胰蛋白酶消化之后，收集细胞，移动到新鲜培养基和如上温育。在一些实施方案中，培养基在胰蛋白酶消化后大约24小时至少更换1次，以除去任何漂浮细胞。认为在培养物中剩余的细胞是脐带组织来源的细胞。
脐带组织来源的细胞可被冷藏。因此，在下文更详细地描述的优选的实施方案中，用于自体转移(对于母亲或孩子)的脐带组织来源的细胞可来源自孩子出生后的适当的产后组织，然后进行冷藏以便在随后需要它们用于移植的情况下是可用的。
脐带组织来源的细胞可通过下列进行表征，例如，通过生长特征(例如，群体倍增能力、倍增时间、传代至衰老)、核型分析(例如，正常核型、母源谱系或新生儿谱系)、流式细胞术(例如，FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，用于检测表位)、基因表达概况(例如，基因芯片阵列、聚合酶链反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如，通过血浆凝固测定或PDC条件培养基的分析，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、混合淋巴细胞反应(例如，作为PBMCs的刺激的测量)，和/或本领域已知的其它方法。
脐带组织来源的细胞的例子于2004年6月10日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)并指定为如下ATCC登记号：(1) 株名称 UMB 022803 (P7) 指定为登记号PTA-6067；和(2) 株名称UMB 022803 (P17) 指定为登记号PTA-6068。
在各种实施方案中，脐带组织来源的细胞拥有下列生长特征中的一个或更多：(1) 它们在培养物中需要L-缬氨酸用于生长；(2) 它们能够在含约5%至约20%的氧的气氛中生长；(3) 它们在达到衰老之前具有在培养物中至少倍增约40次的潜能；和(4) 它们在未包被或包被明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的组织培养容器中贴壁和扩增。
在某些实施方案中，脐带组织来源的细胞拥有正常核型，所述核型随着细胞传代保持。用于核型分析的方法是可用的并且是本领域的技术人员已知的。
在其它实施方案中，脐带组织来源的细胞可通过某些蛋白质的产生表征，包括：(1) 组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中至少一种的产生；和(2) CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C 细胞表面标记中至少一种的产生，如通过流式细胞术检测的。在其它实施方案中，脐带组织来源的细胞可通过缺乏下列至少一种的产生表征：CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR、DP、DQ细胞表面标记，如通过流式细胞术检测的。在一些应用中特别优选的是产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中至少两种的细胞。更优选的是产生蛋白质组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中所有三种的那些细胞。
在其它实施方案中，脐带组织来源的细胞可通过相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞的基因表达表征，所述表达对于编码白细胞介素8、浆膜蛋白(reticulon) 1、趋化因子(C-X-C基序)配体1 (黑色素瘤（melonoma）生长刺激活性，α)、趋化因子(C-X-C基序)配体6 (粒细胞趋化蛋白2)、趋化因子(C-X-C基序)配体3、肿瘤坏死因子、α-诱导的蛋白3、C-型凝集素超家族成员2、Wilms瘤1、醛脱氢酶1家族成员A2、肾素、氧化的低密度脂蛋白受体1、智人(Homo sapiens)克隆IMAGE:4179671、蛋白激酶C ζ、假设的蛋白质DKFZp564F013、卵巢癌中下调的1和/或来自克隆DKFZp547k1113的智人基因中至少一种的基因增加。
在再其它实施方案中，脐带组织来源的细胞可通过相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞的基因表达表征，所述表达对于编码下列中至少一种的基因降低：身材矮小症同源框2、热休克27 kDa蛋白2、趋化因子(C-X-C基序)配体12 (基质细胞来源的因子1)、弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄，Williams-Beuren综合征)、智人mRNA、cDNA DKFZp586M2022 (来自克隆KFZp586M2022)、间充质同源框2 (生长停滞特异的同源框)、sine oculis同源框同源物1 (果蝇属(Drosophila))、晶体蛋白α B、形态发生的散乱相关活化剂2、DKFZP586B2420蛋白、类似于neuralin 1、四连蛋白(纤溶酶原结合蛋白)、src同源三(SH3)和富含半胱氨酸结构域、胆固醇25-羟化酶、runt-相关的转录因子3、白细胞介素11受体α、前胶原 C-内肽酶增强子、frizzled同源物7 (果蝇属)、假设的基因BC008967、类型VIII α1胶原、生腱蛋白C (hexabrachion)、易洛魁族人同源框蛋白5、hephaestin、整联蛋白β8、突触小泡糖蛋白2、成神经细胞瘤致瘤性的抑制1、胰岛素样生长因子结合蛋白2(36kDa)、智人cDNA FLJ12280 fis克隆MAMMA1001744、细胞因子受体样因子1、钾中间的/小的电导钙-活化通道亚家族N成员4、整联蛋白β7、含PDZ-结合基序的转录辅激活物(TAZ)、sine oculis 同源框同源物2 (果蝇属)、KIAA1034蛋白、突触小泡相关膜蛋白5 (myobrevin)、含EGF的纤蛋白（fibulin）-样细胞外基质蛋白1、早期生长应答3、远端较小的(distal-less)同源框 5、假设的蛋白FLJ20373、醛酮还原酶家族1成员C3 (3-α羟基类固醇脱氢酶类型II)、双糖链蛋白聚糖、含PDZ结合基序的转录辅激活物(TAZ)、纤连蛋白 1、脑啡肽原、整联蛋白β-样1 (含EGF-样重复结构域)、智人mRNA全长插入片段cDNA克隆EUROIMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367蛋白、利尿钠肽受体 C/鸟苷酸环化酶C (心房钠尿肽受体 C)、假设的蛋白FLJ14054、智人mRNA、cDNA DKFZp564B222 (来自克隆KFZp564B222)、BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3-样、AE结合蛋白1和/或细胞色素c氧化酶亚基VIIa多肽1 (肌肉)。
在其它实施方案中，脐带组织来源的细胞可通过下列至少一种的分泌表征：MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1。在一些实施方案中，脐带组织来源的细胞可通过下列至少一种的分泌的缺乏表征：TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF，如通过ELISA检测的。
在一些优选的实施方案中，脐带组织来源的细胞来源于基本上不含血液的脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，需要L-缬氨酸用于生长，可以在至少约5%氧中生长，并且包含下列特征中的至少一种：(1) 在培养物中至少约40次倍增的潜能；(2) 在未包被的组织培养容器或包被有明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的组织培养容器上贴壁和扩增的能力；(3) 波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的产生；(4) CD10、CD13、CD44、CD73和CD90的产生；和(5) 基因的表达, 其相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞对于编码白细胞介素8和浆膜蛋白1的基因增加。在一些实施方案中，这种脐带组织来源的细胞不产生CD45和CD117。
在优选的实施方案中，细胞包括上文列出的生长、蛋白质/表面标记产生、基因表达或物质分泌特征中的两种或更多种。更优选的是包括三、四、五或更多种所述特征的那些细胞。还更优选的是包括六、七、八或更多种所述特征的脐带组织来源的细胞。目前仍更优选的是包括所有上述特征的那些细胞。
在目前在几个方面中优选用于本发明的细胞中的是，具有上述特征的脐带组织来源的细胞，且更特别的是那些细胞，其中细胞具有正常核型并随着传代保持正常核型，并且此外，其中细胞表达标记CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每一种，并且其中细胞产生免疫可检测的蛋白，所述蛋白对应于所列的标记。还更优选的是除前述外不产生对应于标记CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR、DP、DQ中任一种的蛋白质的那些细胞，如通过流式细胞术检测的。
具有沿着导致各种表型的系分化的潜能的某些细胞是不稳定的，并且因而可以自发地分化。目前优选用于本发明的是不自发分化的细胞，例如沿着成肌细胞、骨骼肌、血管平滑肌、周细胞、成血管（hemangiogenic）、血管生成（angiogenic）、血管发生（vasculogenic）或血管内皮系。优选的细胞，当在生长培养基中生长时，就在它们表面上产生的细胞标记以及就各种基因的表达模式而言，基本是稳定的，例如使用在商标GENECHIP (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA)下出售的医学诊断测试测定的。所述细胞例如在传代期间和经过多个群体倍增在它们的表面标记特征方面基本保持恒定。
本发明的另一个方面特征在于描述上文描述的脐带组织来源的细胞群的应用。在一些实施方案中，细胞群是异质的。本发明的异质细胞群可包含至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的本发明脐带组织来源的细胞。本发明的异质细胞群可进一步包含干细胞或其它祖细胞，诸如成肌细胞或其它肌祖细胞、成血管细胞或血管前体细胞；或其可进一步包含完全分化的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、周细胞、或血管内皮细胞。在一些实施方案中，群体基本上是同质的，即，包含基本上仅仅脐带组织来源的细胞(优选地至少约96%、97%、98%、99%或更多的脐带组织来源的细胞)。本发明的同质细胞群可包含脐-来源的细胞。脐-来源的细胞的同质群优选地不含母源谱系的细胞。细胞群的同质性可通过本领域已知的任何方法实现，例如，根据已知方法通过细胞分选(例如，流式细胞术)或通过克隆扩增。因而，优选的同质脐带组织-来源的细胞群可包含脐带组织来源的细胞的克隆细胞系。这种群体在具有高度希望的功能性的细胞克隆被分离时是特别有用的。
在一个实施方案中，细胞是作为未分化的细胞施用的脐带组织来源的细胞，即，如生长培养基中培养的。可选地，脐带组织来源的细胞可在培养中暴露于刺激朝向希望的神经组织分化的条件之后施用。在一个优选的实施方案中，细胞是UTC。在另一实施方案中，细胞是hUTC。
进一步地，细胞群可包括多于一类细胞。实际上，一些实施方案包括施用包绕和支持神经细胞的细胞。这种细胞可包括但不限于，皮组织、血管组织、结缔组织、软骨、脂肪组织、肌肉组织、腱或韧带。
脐带组织-来源的细胞的一般规程、分离和表征可见于实施例5-15。
基因修饰细胞
本发明中使用的细胞也可进行基因修饰以产生治疗上有用的基因产物，产生试剂以促进或支持神经组织形成、愈合和/或生长，或产生因子以将祖细胞募集到神经损害区域。
遗传修饰可用多种载体中的任一种完成，包括但不限于整合病毒载体，例如，逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体；非整合复制载体，例如，乳头瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；或复制-缺陷型病毒载体。将DNA引入细胞中的其它方法包括使用脂质体、电穿孔、基因枪或通过直接DNA注射。
例如，细胞可进行基因工程改造，以表达和/或分泌外来分子 (例如，正常不由细胞产生的异源分子)或修饰分子的产生来治疗慢性疼痛。这种分子可以在使用本领域公知的技术引入异源核酸分子时由细胞产生。
在一个实施方案中，本发明的细胞可以进行修饰以表达针对神经递质的受体。在另一实施方案中，本发明的细胞被修饰以产生神经递质，包括但不限于，5-羟色胺、组胺、γ-氨基丁酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、神经肽Y、ATP、GRP、腺苷、肾上腺素、去甲肾上腺素(neuroepinephrine)、多巴胺、乙酰胆碱、褪黑激素、n-乙酰天冬氨酰谷氨酸、章鱼胺、酪胺、促胃液素、缩胆囊素（cholecytokinin）、加压素、催产素、后叶激素运载蛋白(neurphysin) I和II、胰多肽、肽 YY、促肾上腺皮质素、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、促胰液素、促胃动素、胰高血糖素、血管活性肠肽、生长激素释放因子、生长抑素、神经激肽A和B、P物质、蛙皮素、胃释放肽、氧化氮、一氧化碳和花生四烯酸乙醇酰胺（anandamide）。在又一其它实施方案中，本发明的细胞被修饰以产生神经递质的片段，包括但不限于来自C'末端或N'末端的片段。
在另一实施方案中，外来分子增强移植的细胞的神经再生能力，帮助重建GABA中间神经元的感觉神经通讯，和/或帮助重建受试者中的兴奋性/抑制性神经递质平衡。
在又一实施方案中，细胞被基因工程改造以表达和/或分泌直接降低受试者中的疼痛，促进移植成功(例如，通过下调受试者中的免疫应答)和/或促进移植的细胞存活或功能的外来分子。示范性的分子包括例如，神经营养因子或神经保护剂。
在再一实施方案中，未修饰或修饰的细胞可以与被基因修饰以执行有用功能的其它类型的细胞共同引入。例如，为了促进神经元的生长，细胞可以与分泌或已进行修饰以分泌例如神经营养因子的其它细胞共同施用。充当对受试者的转基因的载体的细胞例子包括成纤维细胞、肾上腺嗜铬细胞、星形胶质细胞和成肌细胞。这种细胞，例如成纤维细胞和神经胶质细胞，也可以用于递送含有基因诸如单纯疱疹-胸苷激酶基因的逆转录病毒，其基因产物是其它治疗药物或试剂诸如更昔洛韦靶向细胞的靶。
宿主细胞可用DNA和选择标记转化或转染，所述DNA由一种或多种适当的表达控制元件控制或与所述控制元件操作性结合，控制元件诸如启动子或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等。任何启动子都可用于驱动插入的基因的表达。例如，病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV 40、乳头瘤病毒、EB病毒或弹性蛋白基因启动子。在一些实施方案中，用于控制目的基因表达的控制元件可以允许基因的调节的表达以便只在体内需要时才合成产物。如果瞬时表达是希望的，那么优选地在非-整合和/或复制-缺陷型载体中使用组成型启动子。可选地，诱导型启动子可用于在需要时驱动插入的基因的表达。诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的那些。
引入外来DNA后，可允许工程改造的细胞生长在富集培养基中并然后切换到选择性培养基。外来DNA中的选择标记赋予对选择的抗性并允许细胞稳定地将例如质粒上的外来DNA整合到它们的染色体中并生长以形成转化灶，其进而可以克隆和扩增为细胞系。该方法可以有利地用于工程改造表达基因产物的细胞系。
本发明的细胞可被基因工程改造以"敲除"或"击倒"促进植入位点处的炎症或排斥的因子的表达。用于减少靶基因表达水平或靶基因产物活性水平的负调节技术在下文中讨论。如本文使用的"负调节"指靶基因产物的水平和/或活性相对于缺乏调节治疗情况下靶基因产物的水平和/或活性的减少。对骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、周细胞、血管内皮细胞、神经细胞或其祖细胞为天然的基因的表达可以被降低或敲除，其中使用许多技术，包括例如，通过使用同源重组技术灭活基因抑制表达。一般地，编码蛋白质的重要区域的外显子(或该区域5'的外显子)被阳性选择标记例如neo打断，从而防止正常mRNA从靶基因的产生并导致该基因的失活。基因也可通过在部分基因中产生缺失，或通过缺失整个基因而灭活。通过使用带有与靶基因具有同源性的在基因组中相距很远的两个区域的构建体，插入这两个区域的序列可以被缺失(Mombaerts等人, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 1991; 88:3084)。反义、DNA核酶、核酶、小干扰RNA (siRNA)和抑制靶基因表达的其它这种分子也可以用于降低靶基因活性水平。例如，抑制主要组织相容性基因复合体(HLA)表达的反义RNA分子已显示就免疫应答而言最通用。又进一步地，三股螺旋分子可以在降低靶基因活性水平中使用。这些技术由Davis, L. G.等人, (eds), Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., 1994, Appleton & Lange, Norwalk, Ct.详细描述。
在其它方面，本发明利用从脐带组织来源的细胞制备的细胞裂解物和细胞可溶级分。这种裂解物和其级分具有许多效用。这种裂解物可溶级分(即，基本上不含膜)的体内使用，例如，允许有益的细胞内环境在患者中同种异体使用，而不引入最有可能触发排斥或其它不利的免疫应答的可观量的细胞表面蛋白质。裂解细胞的方法是本领域公知的并包括机械破裂、酶促破裂或化学破裂或其组合的各种方式。这种细胞裂解物可在它们的生长培养基中从细胞直接制备，并且因而包含分泌的生长因子等，或它们可从例如，在PBS或其它溶液中洗涤而不含培养基的细胞制备。如果优选，那么洗涤的细胞可在大于原始群密度的浓度重悬浮。
在一个实施方案中，制备全细胞裂解物，例如，通过破裂细胞而不随后分离细胞级分。在另一实施方案中，通过本领域已知的常规方法从细胞可溶级分分离细胞膜级分，例如，离心、过滤或类似方法。
从产后来源的细胞群制备的细胞裂解物或细胞可溶级分可照原样使用，通过例如超滤或冻干进一步浓缩，或甚至干燥、部分纯化、与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合、或与其它化合物诸如生物制品例如药学上有用的蛋白质组合物组合。细胞裂解物或其级分可在体外或体内使用，单独或例如连同自体或同系活细胞。裂解物如果体内引入，则可在治疗位点局部引入或远距离引入，以向患者提供例如所需的细胞生长因子。
在进一步实施方案中，UTC可以体外培养以高得率地产生生物学产物。可以使用本文描述的培养技术克隆扩增天然产生特定的目标生物学产物(例如，营养因子)或已被基因工程改造以产生这种生物学产物的脐带组织-来源的细胞。可选地，可在诱导分化为神经细胞的培养基中扩增细胞。在每一情况下，可以使用标准分离技术容易地从条件培养基分离细胞产生和分泌到培养基中的生物学产物，例如，诸如示差蛋白质沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、电泳和HPLC，仅举几个例子。"生物反应器"可用于利用流动方法进行进料，例如，体外三维培养。基本上，随着新鲜培养基通过三维培养物，生物学产物被洗出培养物并且可然后从流出物中分离，如上述。
可选地，目标生物学产物可保留在细胞内，并且因而其收集可需要细胞被裂解，如上文所述。生物学产物可然后使用上文列出的技术中的任何一种或多种进行纯化。
在其它实施方案中，本发明利用来自培养的脐带组织来源的细胞的条件培养基在体外和体内使用，如下文所述。脐带组织来源的细胞条件培养基的应用允许脐带组织来源的细胞分泌的有益的营养因子在患者中同种异体地使用，而不引入可触发排斥或其它不利的免疫应答的完整细胞。条件培养基通过在培养基中培养细胞，然后从培养基取出细胞制备。
从脐带-来源的细胞群制备的条件培养基可照原样使用，通过例如超滤或冻干进一步浓缩，或甚至干燥、部分纯化、与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合、或与其它化合物诸如生物制品例如药学上有用的蛋白质组合物组合。条件培养基可在体外或体内使用，例如单独或与自体或同系活细胞组合。条件培养基如果体内引入，则可在治疗位点局部引入或远距离引入，以向患者提供所需的细胞生长或营养因子。
在另一实施方案中，制备、收集且使用由在液体、固体或半固体基质上培养脐带组织来源的细胞产生的细胞外基质(ECM)，作为将活细胞植入需要神经细胞修复、置换或再生的受试者中的替代方案。在需要量的ECM在框架上分泌的条件下，在如本文其它处描述的三维框架上体外培养脐带组织来源的细胞。取出构成新组织的细胞，并处理ECM用于进一步使用，例如，作为可注射制剂。为了完成这一点，杀死框架上的细胞并从框架除去任何细胞碎片。该过程可以许多不同方式执行。例如，可以在液氮中瞬间冻结活组织，而不冷藏，或可以在无菌蒸馏水中浸入组织以使细胞响应于渗透压裂解。
一旦细胞已被杀死，就可破裂细胞膜并通过用温和去污剂漂洗诸如EDTA、CHAPS或两性离子去污剂处理除去细胞碎片。可选地，可以对组织进行酶促消化和/或用破坏细胞膜和允许去除细胞内容物的试剂提取。这种酶的例子包括但不限于，透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶。去污剂的例子包括非离子去污剂诸如，例如，烷基芳基聚醚醇(TRITON X-100)、辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇(Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.)、BRIJ-35、聚乙氧基乙醇十二烷基醚(Atlas Chemical Co., San Diego, Ca.)、聚山梨醇酯 20 (TWEEN 20)、聚乙氧基乙醇失水山梨糖醇单月桂酸酯(Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.)、聚乙烯十二烷基醚(Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.)；和离子去污剂诸如十二烷基硫酸钠、硫酸化高级脂族醇、包含7至22个碳原子的支链或非支链磺化烷和磺化烷基芳烃。
ECM的收集可以以多种方式完成，这至少部分取决于新组织是否已在生物可降解的或非生物可降解的三维框架上形成，如在金属的情况下。例如，如果框架是非生物可降解的，那么ECM可以通过使框架接受超声处理、高压水喷射、机械刮擦或用去污剂或酶温和处理或上述任何组合取出。
如果框架是生物可降解的，那么ECM可以例如通过允许框架降解或在溶液中溶解收集。可选地，如果生物可降解的框架由本身可以连同ECM注射的材料组成，那么框架和ECM可以整体（in toto）加工用于随后注射。可选地，ECM可以通过上文描述的用于从非生物可降解的框架收集ECM的方法中的任一种从生物可降解的框架取出。所有收集过程优选地进行设计以便不变性ECM。
已收集后，可对ECM进一步地进行加工。例如，可以使用本领域公知的技术，诸如通过超声处理将ECM同质化为细粒，以便使其可以通过外科手术针。如果需要，那么也可以通过γ照射交联ECM的组分。优选地，可以在0.25至2 百万拉德之间照射ECM以对ECM灭菌和交联。使用毒性试剂，诸如戊二醛的化学交联是可能的，但通常不是优选的。
通过混合本发明的细胞产生的ECM与一种或多种其它细胞类型的ECM，可调整蛋白质诸如ECM中存在的各种类型的胶原的量和/或比。此外，生物活性物质诸如蛋白质、生长因子和/或药物可以掺入ECM。示范性的生物活性物质包括组织生长因子，诸如TGF-β等，其在注射位点促进愈合和组织修复。这种另外的试剂可用在本文上述的实施方案中的任一种中，例如，连同脐带组织来源的细胞产生的全细胞裂解物、可溶细胞级分或进一步纯化的组分和产物。
细胞培养
分离的细胞可用于起始或接种细胞培养物。将分离的细胞转移到未包被或包被有细胞外基质或配体诸如层粘连蛋白、胶原 (天然的、变性的或交联的)、明胶、纤连蛋白和其它细胞外基质蛋白的无菌组织培养容器。细胞在能够维持细胞生长的任何培养基中培养，诸如但不限于，DMEM (高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle's基础培养基、Ham's F10 培养基 (F10)、Ham's F-12 培养基 (F12)、Iscove's改良Dulbecco's培养基、间充质干细胞生长培养基 (MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和在商标CELL-GRO-FREE下销售的无血清/介质培养基(Mediatech, Inc., Herndon, Va.)。培养基可补加有一种或多种组分，包括例如，胎牛血清 (FBS)，优选地约2-15% (v/v)；马血清 (ES)；人血清 (HS)；β-巯基乙醇 (BME或2-ME)，优选地约0.001% (v/v)；一种或多种生长因子，例如，血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，胰岛素样生长因子- 1 (IGF-1)，白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素 (EPO); 氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种抗生素和/或抗真菌剂以控制微生物污染，诸如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，单独的或组合的。培养基优选地包括生长培养基(例如 DMEM-低葡萄糖、血清、BME和抗生素试剂)。
以允许细胞生长的密度将细胞接种在培养容器中。在优选的实施方案中，以约0至约5体积%的空气中的CO2培养细胞。在一些优选的实施方案中，以约2%至约25%的空气中的O2，优选地约5%至约20%的空气中的O2培养细胞。细胞优选地在约25至约 40℃的温度培养和更优选地在37℃培养。细胞优选地在培养箱中培养。培养容器中的培养基可以是静态的或搅动的，例如，使用生物反应器。在一些实施方案中，细胞在低氧化应激(例如，添加谷胱苷肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸)下生长。如本文使用的"低氧化应激"指对培养的细胞没有或具有最小自由基损害的条件。
局部施用
对本发明的所有实施方案，对患有神经病性疼痛的个体施用有效治疗疼痛量的细胞群。本发明的特定实施方案涉及局部施用细胞群用于神经细胞的直接修复、再生、置换或支持神经细胞的修复、再生或置换来治疗神经损害、损伤和/或疼痛。施用给个体的组合物包括细胞群和药学上可接受的载体。这种组合物可以在用于制造、使用和实践本文描述和示例的药物组合物的这种方法和试剂盒中使用。该试剂盒可以进一步包含帮助促进施用细胞群的设备，诸如例如，针、管、微量移液管等。在一个实施方案中，试剂盒包含至少一种细胞群、构建体和注射设备。进一步地，在一些实施方案中，试剂盒也可以偶联指示细胞的确切布置的成像设备。细胞可以被进一步修饰，以发出允许检测细胞布置的能量。
在一个实施方案中，将细胞群局部施用到疼痛区域和/或神经损害位点，或介导疼痛的病理学或异常位点。施用位点可为医学专业人员确定为最有效的任何位点，并且因而可接近或远离疼痛或神经损害位点。细胞的施用可通过将细胞群置于位点附近或远处的任何工具施用，包括导管、注射器、分流器、支架、微导管(microcatheter)、泵、以设备植入或以支架植入。
包含细胞群的药物组合物可以配制为液体、半固体(例如，凝胶)或固体(例如，基质、支架等，适当地用于血管或骨骼肌组织工程改造)。
液体组合物被配制用于通过本领域已知的任何可接受的途径施用，以实现细胞群向靶神经组织的递送。一般地，这些包括注射或输注，其或是以扩散方式或是靶向外周缺血性损伤、损害或痛苦位点，经带有针和/或导管的注射器带有或没有泵设备地通过包括但不限于肌内、静脉内或动脉内递送的施用途径实施。
例如，在一个实施方案中，细胞群通过直接立体定位注射施用，例如，针。针可为任何大小，以促进细胞通过中空孔移动。针可通过皮肤直接插入目的组织位点，或可选地，针可连同易于将针引导到组织位点的设备使用，诸如例如导丝(guide wire)。针和引导设备可以被预装配或被交付给受过训练的专业人员；受过训练的专业人员可恰在使用前或在使用期间装配设备。
在可选的实施方案中，递送导管可用于递送细胞群到递送设备中，其通过例如注射细胞到受试者中促进引入。这种递送设备包括管，例如，导管，用于注射细胞和流体进入接受受试者体内。在一个实施方案中，可以使用微量移液管在希望的位置将本发明的细胞引入受试者内。可以以溶液例如细胞悬浮液形式将本发明的细胞插入这种递送设备，例如，微量移液管或注射器。此外，本发明的细胞可以在引导通道(例如，聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC)引导通道)中施用，诸如在Bunge等人, J. Neurology, 1994; 241 :536中描述的那些，其可以充当用于再生轴突的指导。
细胞群或包含细胞的组合物和/或基质可通过微导管、导管内插入（intracatheterization）或通过微泵递送到位点。载体赋形剂或载体可以是已知对于施用给患者药学可接受的那些中的任一种，特别是在待诱导细胞分化的位点局部施用。
进一步地，细胞群可以在生理相容性载体诸如缓冲盐水溶液中施用。本公开内容中讨论的药学上可接受的载体和稀释剂包括但不限于，盐水、水性缓冲液、溶剂和/或分散介质。这种载体和稀释剂的使用是本领域公知的。其它例子包括液体培养基，例如，Dulbeccos 改良 eagle's 培养基 (DMEM)、无菌盐水、无菌磷酸缓冲盐水、Leibovitz's 培养基 (L15, Invitrogen, Carlsbad, Ca.)、无菌水中的葡萄糖、和任何其它生理上可接受的液体。溶液优选地是无菌和流动的，达到存在容易的可注射性的程度。优选地，溶液在制造和储存条件下是稳定的，并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞（thimerosol）等抵抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用保存。本发明溶液可以通过使用药学上可接受的载体或稀释剂并且按需要使用上文列举的其它成分，然后进行过滤灭菌，并且然后掺入如本文所描述的细胞群制备。
包含半固体或固体载体中的细胞的药物组合物一般地配制用于在神经损伤、损害或痛苦位点外科手术植入。将认识到，液体组合物也可通过外科手术程序施用。在特定实施方案中，半固体或固体药物组合物可包括半透凝胶、基质、细胞支架等，其可为非生物可降解的或生物可降解的。例如，在某些实施方案中，可希望或适于将外源细胞与它们的环境隔绝，而使得细胞能够分泌和递送生物分子(例如，神经营养蛋白因子)以包绕神经细胞。在这些实施方案中，细胞可配制为包含脐带组织来源的细胞的自主植入物，所述细胞被物理上分开移植的细胞与宿主组织的非可降解的选择性可渗透屏障包绕。这种植入物有时被称为"免疫保护的"，这是因为它们具有在不存在药物诱导的免疫抑制下防止免疫细胞和大分子杀死移植的细胞的能力。
在其它实施方案中，不同种类的可降解凝胶和网络用于本发明药物组合物。例如，特别合适的可降解材料包括本公开内容中讨论的任一种，包括但不限于，生物相容性聚合物，诸如聚(乳酸)、乳酸-乙醇酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。
在另一实施方案中，一种或多种水凝胶用于药物组合物。一种或多种水凝胶可包括胶原、去端肽胶原、血纤蛋白构建体、亲水乙烯基和丙烯酸聚合物、多糖诸如藻酸钙、和聚(环氧乙烷)。进一步地，水凝胶可由聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(丙烯酸)、自装配肽(例如，RAD 16)、聚(甲基丙烯酸)、聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)和它们与彼此或与疏水单体诸如甲基丙烯酸甲酯、乙酸乙烯酯等的共聚物形成。也优选的是包含大聚(环氧乙烷)嵌段的亲水聚氨基甲酸酯。其它优选的材料包括包含互穿聚合物网络的水凝胶，其可通过加聚或通过缩聚形成，其组分可包括亲水和疏水单体诸如刚刚列举的那些。原位形成的可降解网络也适于在本发明中使用(参见例如，Anseth, KS等人, J. Controlled Release, 2002; 78:199-209; Wang, D.等人, Biomaterials, 2003; 24:3969-3980; 美国专利公开2002/0022676)。这些原位形成材料被配制为适于注射的流体；然后可通过多种方式诸如温度、pH变化和原位或体内暴露于光被诱导以形成水凝胶。在一个实施方案中，构建体包含含有凝胶的血纤蛋白胶。在另一实施方案中，构建体包含含有凝胶的去端肽胶原。
在本发明的一方面，用于形成基质的聚合物是水凝胶形式。通常地，水凝胶是可以在水中吸收大于它们重量的20%、同时保持独特三维结构的交联聚合材料。该定义包括在水环境中将溶胀的干燥交联聚合物，以及水溶胀材料。许多亲水聚合物可以被交联以产生水凝胶，不论聚合物是生物学起源、半合成或完全合成的。水凝胶可从合成聚合材料产生。可以使这种合成聚合物适合一系列性质和可预测的批次间一致性，并代表通常没有免疫原性担心的可靠的材料源。基质可包括从自装配肽形成的水凝胶，诸如美国专利号5,670,483和5,955,343、美国专利申请号2002/0160471和PCT 申请号 WO 02/062969中论述的那些。
使水凝胶在药物递送应用中有价值的性质包括平衡溶胀程度、吸着动力学、溶质透性和它们的体内性能特性。对化合物的透性部分取决于溶胀程度或含水量和生物降解速度。由于凝胶的机械强度可与溶胀度成比例地下降，也完全在本发明的预期之内的是，水凝胶可以与基质附着，以便复合系统增强机械强度。在一些实施方案中，水凝胶可以浸渗入多孔基质，以便获得基质的机械强度连同水凝胶的有用的递送性质。
在其它实施方案中，药物组合物包含由天然、修饰的天然或合成的生物可降解聚合物制成的生物相容性基质，所述聚合物包括均聚物、共聚物和嵌段聚合物、以及其组合。
合适的生物可降解聚合物或聚合物种类的例子包括本公开内容中论述的任何生物可降解聚合物，包括但不限于，血纤蛋白，I、II、III、IV和V型胶原，弹性蛋白，明胶，玻连蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，凝血酶，聚(氨基酸)，氧化纤维素，原弹性蛋白，丝，核糖核酸，脱氧核糖核酸；蛋白质，多核苷酸，阿拉伯树胶，重建基底膜基质，淀粉，葡聚糖，藻酸盐，hyaluron，壳多糖，壳聚糖，琼脂糖，多糖，透明质酸，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚乙二醇，去细胞化的(decellularized)组织，自装配肽，多肽，糖胺聚糖，它们的衍生物和混合物。合适的聚合物也包括可以由L(+)和D(-)聚合物形成的聚(交酯) (PLA)、聚羟基丁酸酯、聚氨基甲酸酯、聚磷腈、聚(乙二醇)-丙交酯-乙交酯共聚物、可降解聚氰基丙烯酸酯和可降解聚氨基甲酸酯。对于乙醇酸和乳酸，中间环状二聚体可在聚合前制备和纯化。这些中间二聚体分别被称为乙交酯和丙交酯。
其它有用的生物可降解聚合物或聚合物种类非限制性地包括，脂族聚酯、聚(亚烷基草酸酯)、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚原酸酯、聚氧杂酯(polyoxaesters)、聚酰胺酯、含有胺基团的聚氧杂酯、聚(富马酸亚丙酯)、聚富马酸酯、聚二氧杂环己酮、聚碳酸酯、聚草酸酯、聚(α-羟基酸)、聚(酯)、聚氨基甲酸酯、聚酯型氨基甲酸酯、聚醚氨酯、聚酐、聚乙酸酯、聚己内酯、聚(原酸酯)、聚氨基酸、聚酰胺和它们的掺合物和共聚物。另外的有用的生物可降解聚合物非限制性地包括L-和D-乳酸的定向聚合物、双(对-羧基苯氧基)丙烷和癸二酸的共聚物、癸二酸共聚物、己内酯的共聚物、聚(乳酸)/聚(乙醇酸)/聚乙二醇共聚物、聚氨基甲酸酯和聚(乳酸)的共聚物、α-氨基酸的共聚物、α-氨基酸和己酸的共聚物、α-苄基谷氨酸酯和聚乙二醇的共聚物、琥珀酸酯和聚(乙二醇)的共聚物、聚磷腈、聚(羟基链烷酸酯)和它们的混合物。也考虑二元和三元系统。
通常地，希望将用于形成基质的材料进行配置以使其：(1) 具有适于预期应用的机械性质；(2) 保持足够地完整，直至组织已向内生长和愈合；(3) 不引发炎症或毒性反应；(4) 履行其目的后在体内代谢；(5) 容易加工成待形成的希望的最终产物；(6) 展示可接受的保存期限；和(7) 容易灭菌。
在另一实施方案中，细胞群通过使用支架施用。支架的组成、形状和孔隙率可为上文描述的任一种。一般地，这些三维生物材料包含附着于支架、在支架中分散或掺入在支架中截留的细胞外基质的活细胞。一旦植入到身体的靶区域，这些植入物就变得与宿主组织整合，其中移植的细胞逐渐确立。
可在本发明中使用的支架的非限制性例子包括纺织结构，诸如编织物(weaves)、针织物(knits)、编带、网状物、非编织物和经编针织物；多孔泡沫，半多孔泡沫，穿孔膜或片，微粒，珠，和球及为上述结构的组合的复合结构。非编织的垫子可例如使用包含乙醇酸和乳酸(PGA/PLA)的合成可吸收共聚物的纤维形成, 其在商品名称VICRYL缝线下出售(Ethicon, Inc., Somerville, N. J.)。也可利用由诸如冷冻-干燥或冻干方法形成的、由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸) (PCL/PGA)共聚物组成的泡沫，如美国专利号6,355,699中论述的。
在另一实施方案中，框架是毡，它可由从生物可吸收的材料制成的复丝纱（multifilament yarn）组成。使用标准的纺织工艺技术将所述纱制成毡，所述技术由卷曲、切割、梳理和针刺组成。在另一个实施方案中，可将细胞接种于泡沫支架上，所述支架可用作复合结构。
在上述实施方案中的许多中，框架可模压成有用的形状，诸如用于填充组织空隙。框架可以因此被成型，以不仅提供神经生长的通道，而且也提供用于支持和外围组织诸如血管组织、肌肉组织等的支架。另外，将认识到，细胞群可在预先形成的非可降解外科手术或可植入设备上培养。
本发明药物组合物可包括由用药学上可接受的载体或介质配制的细胞制成的制备剂。合适的药学上可接受的载体包括本公开内容中论述的任一种，包括但不限于：水，盐溶液(诸如林格液)，醇，油，明胶，聚乙烯基吡咯烷，碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉，脂肪酸酯，和羟甲基纤维素。这种制剂可以是灭菌的，并且如果需要，则与辅助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液和着色剂混合。适于在本发明中使用的药物载体是本领域已知的和在例如Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa.)和WO 96/05309中描述的。
在另一实施方案中，在施用前，细胞群在一种或多种因子存在下或在刺激干细胞沿神经细胞途径分化的条件下温育。这种因子是本领域已知的，并且技术人员将认识到，用于分化的合适条件的确定可以用常规实验完成。这种条件的最优化可以通过统计学实验设计和分析完成，例如反应表面方法学允许同时最优化多个变量，例如在生物学培养中。目前优选的因子包括但不限于生长或营养因子、趋化因子、细胞因子、细胞产物、脱甲基化剂和目前已知或稍后确定为刺激分化的其它刺激物，例如，沿着血管生成、成血管、血管发生、骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮途径或谱系的细胞群分化。可选地，施用给患者的组合物包括具有刺激细胞沿神经细胞途径分化的一种或多种因子的细胞群，其中细胞分化在体外在组织位点处发生。
用于施用细胞群或本文描述的任何其它治疗或药物组合物的剂型和方案依照医学规范（good medical practice）考虑个别患者的状况开发，例如，神经损伤或损害的性质和程度、年龄、性别、体重和一般医学状况、和医学专业人员已知的其它因素。因而，待施用给患者的药物组合物的有效量通过本领域已知的这些考虑确定。
全身施用
在一个实施方案中，细胞群被全身施用以治疗疼痛和/或神经损害位点。施用位点可为医学专业人员确定为最佳的任何位点，并且因而可为静脉内、肌肉系统内、腹膜内等。细胞可通过任何方式施用，包括但不限于注射和输注。
本发明的具体实施方案涉及用于神经细胞的直接修复、再生、置换，或其修复、再生或置换的支持的细胞群的全身施用，用于治疗神经损害、损伤和/或疼痛。
本发明的细胞或其组合物的全身施用途径包括但不限于：静脉内、腹膜内、动脉内、或通过带有针或导管的注射器并带有或没有泵设备。细胞群的迁移可以通过流体在个体体内的移动，诸如血液或淋巴移动，以及化学信号、生长因子等指导。
在一个具体实施方案中，递送导管可用于将细胞群递送到通过例如将细胞注射到受试者中而促进引入的递送设备中。这种递送设备包括管，例如，导管，用于注射细胞和流体到接受受试者体内。进一步地，细胞群可以在任何生理相容性载体，诸如缓冲盐水溶液中施用。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、含水缓冲液、溶剂和/或分散介质。优选地，溶液在制造和储存条件下是稳定的，并且通过使用包括例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等的抗微生物剂和抗真菌剂抵抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用保存。本发明溶液可以通过使用药学上可接受的载体或稀释剂并且按需要使用上文列举的其它成分，然后进行过滤灭菌，并且然后掺入如本文所描述的细胞群制备。
对于局部和全身施用的细胞，用于施用细胞群或本文描述的任何其它治疗或药物组合物的剂型和方案依照医学规范考虑个别患者的状况开发，例如，神经损伤或损害的性质和程度、年龄、性别、体重和一般医学状况、和医学专业人员已知的其它因素。因而，待施用给患者的药物组合物的有效量通过本领域已知的这些考虑确定。
如果医学专业人员使用的细胞群是脐带组织来源的细胞，那么同种异体或甚至异种细胞移植在一些情况下可被耐受，这是因为这些细胞已显示在混合淋巴细胞反应中不刺激同种异体PBMCs。因此，认为细胞本身提供免疫抑制作用，从而防止移植的细胞群的宿主排斥。在这种情况下，细胞治疗期间的药学免疫抑制可以不是必需的。
然而，在其它情况下，在起始细胞治疗之前，可希望或适于药学地免疫抑制患者。这可通过使用全身或局部免疫抑制剂完成，或其可通过在被囊化设备中递送细胞完成，如上文所述。用于降低或消除对移植的细胞的免疫应答的这些和其它方式是本领域已知的。作为替代，细胞群可被基因修饰以降低它们的免疫原性，如上所述。
此外，移植的细胞群在活患者中的存活可以通过使用多种扫描技术测定，例如，计算机控制轴向X线断层摄影术(CAT或CT)扫描、磁共振成像(MRI)或正电子发射横体层摄影术(PET)扫描。移植物存活的测定也可以在死后通过取出神经组织和外围组织、并视觉或通过显微镜检测它进行。可选地，细胞可以用特异于神经组织或其外围组织的染料处理。移植的细胞也可以通过在先掺入示踪染料进行鉴定，诸如罗丹明或荧光素标记的小球体、坚牢蓝、高铁微粒、双苯甲酰胺或遗传引入的报道基因产物诸如β-半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸糖苷酶。
连同细胞群施用的试剂或化合物
本发明的细胞可以在它们制备用于移植的任何阶段与促进细胞在体外和/或在接受受试者中存活、生长、分化和/或整合或进一步帮助治疗慢性疼痛的许多试剂或因子温育和/或用其处理，例如，在解剖、限制性消化、解离、平板培养(plating)和/或产生细胞悬浮液用于移植期间。另外的试剂的施用可以在细胞移植前开始，可以在移植之时开始，或可以在移植后开始。另外的试剂的施用可以在持续时间方面受限(例如，可以由单次施用试剂组成)或可以具有延长的持续时间(例如，可以在长时间段内重复给予受试者)。
在一些实施方案中，平行、顺序施用或连同细胞群直接配制一种或多种化合物或组分。可加入施用的细胞的其它组分的例子包括但不限于：(1) 其它神经营养因子，诸如脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白 4/5、神经生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、促甲状腺素释放激素、表皮生长因子、双调蛋白、转化生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子；(2) 选择的细胞外基质组分，诸如一种或多种类型的本领域已知的胶原，和/或生长因子，富血小板血浆和药物(可选地，脐带组织来源的细胞可被基因工程改造以表达和产生生长因子)；(3) 抗凋亡剂(例如，促红细胞生成素(EPO)、EPO 模拟体(mimetibody)、血小板生成素、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF- II、肝细胞生长因子、胱天蛋白酶抑制剂)；(4) 抗炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、抑制素、IL-6和IL-1抑制剂、吡嘧司特(Pemirolast)、曲尼司特(Tranilast)、Remicade (Centocor, Inc., Malvern, Pa.)、西罗莫司(Sirolimus)和非类固醇消炎药 (NSAIDS) (诸如替波沙林(Tepoxalin)、托美汀(Tolmetin)和Suprafen; (5) 免疫抑制或免疫调谐剂，诸如钙依赖磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体；(6) 局部麻醉剂；和(7) 其它血管生成因子、血管生成药或肌再生(myoregenerative)或肌保护(myooprotective)因子或药物。
在一个实施方案中，这种试剂或因子可以在本发明的细胞已在其中移植后在接受受试者中的移植位点加入。在一些情况下，例如，这些试剂可以最小化或抵消由用于制备用于移植的细胞的程序引起的对细胞的有害作用，例如，制备用于移植的细胞可经历细胞创伤和/或低氧，其导致活性氧类别(ROS)诸如超氧化物自由基阴离子、过氧化氢和羟基自由基的产生。已知ROS不利地影响细胞功能，这最有可能是通过影响多种膜和细胞内组分，包括离子通道、膜脂质、转运机制诸如Na/K ATP酶和Na/谷氨酸交换转运和胞质酶诸如谷氨酰胺合酶。此外，活性氧类别驱使膜脂质过氧化并因此可降低移植物中细胞的存活。
为了最小化和/或抵消在制备用于移植的细胞的过程中这些类型的氧化应激的不利作用，本发明的细胞可以在制备期间的任何阶段与抗氧化剂温育和/或用其处理。这种抗氧化剂的例子包括酶抗氧化剂超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶，和促进谷胱甘肽形成的试剂，例如N-乙酰半胱氨酸(NAC)。其它抗氧化剂包括拉扎洛依，例如，U-74389G和U-83836E，它们是设计以定位在细胞膜中并抑制脂质过氧化作用同时清除自由基的氨基类固醇。可以加入细胞培养物和细胞悬浮液的抗氧化剂的其它例子包括TGF，维生素E，维生素C，β胡萝卜素，和清除ROS、抑制ROS产生和/或抑制脂质过氧化作用的其它化合物。
抗氧化剂酶诸如SOD清除ROS并防止超氧化物与氧化氮形成已显示对培养的细胞有毒性的过氧亚硝酸阴离子的反应。这些酶可以与如上文所述的本发明的细胞温育。将这些酶引入本发明的细胞制剂的另一方法是基因修饰细胞以包含编码这种酶的核酸。然后，基因修饰的细胞可以产生增强移植的细胞在接受受试者中存活、生长和分化的试剂。例如，可以用人Cu/Zn超氧化物歧化酶基因转染本发明的细胞，Cu/Zn超氧化物歧化酶是氧自由基解毒作用中的关键酶，其产生转染的细胞，所述细胞表达SOD并且因此有效解毒在组织制备和植入期间生成的ROS以从而增加移植的细胞存活。
此外，可以修饰细胞体外的氧化环境以抑制细胞氧化应激。例如，在移植前，可以将细胞环境中的氧分压从正常氧分压即大约150托(torr)O2减少为降低的氧分压即38托O2(约 5% O2)。该减少氧化应激的方法可以与用上述抗氧化剂中的一种或多种治疗细胞相组合。
可以将NOS抑制剂诸如神经节苷脂、FK506和环孢菌素A加入细胞制剂以抑制NO的产生，从而减少过氧亚硝酸和其衍生物的产生。超氧化物歧化酶是可以减少NO超量生产的不利作用和其介导的毒性作用的另一试剂。
为了防止创伤及其有关的不利作用，例如，通过制备用于植入的本发明的细胞诱导的膜过氧化、自由基诱导的细胞损害，可以用编码抗凋亡基因产物诸如bcl-2和/或crmA基因产物的核酸转染本发明的细胞。进一步地，可以用上调这些基因产物的表达或功能的试剂处理本发明转染的细胞，例如，上调bcl-2表达的TGFl和TGF3、神经生长因子(NGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)。进一步地，也可以用编码这些因子的核酸转染本发明的细胞。
为了进一步促进本发明的细胞在接受受试者中的存活，细胞可以连同血管生成剂移植或用编码血管生成剂的核酸转染。在移植时，血管生成剂促进血管向细胞群中的向内生长。作为这种血管向内生长的结果，移植的细胞得到足够的营养物以在接受受试者中增殖和存活。许多生长因子表现血管生成活性。例如，血管内皮生长因子(VEGF)、PDGF、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和K-FGF拥有血管生成活性并且可以在本发明的方法在使用以促进血管向内生长到本发明移植的细胞中。
可以将其它因子诸如促成神经发育、神经纤维形成和神经元维持的神经营养因子加入在制备用于移植期间体外的本发明细胞，和/或加入细胞悬浮液本身以用于连同本发明的细胞引入到个别受试者中。本发明的细胞也可以进行基因修饰以产生如本文所描述的这种神经营养因子。加入本发明的细胞的神经营养因子可以基于待移植的细胞上的其受体的存在情况来选择。例如，中脑细胞拥有下列神经营养因子的受体：神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)，其促进中脑细胞的存活、形态学分化和高亲和力多巴胺摄取；脑衍生神经营养因子(BDNF)；睫状神经营养因子(CNTF)，其防止轴突切断术（axotomy）诱导的中脑细胞变性；中期因子，其促进中脑细胞的存活和分化；EGF，其增加中脑细胞的存活和成熟；胰岛素样生长因子I和II和胰岛素；酸性FGF；碱性FGF，其诱导带神经突细胞数目以及它们的纤维网络的程度显著增加；神经营养蛋白-3 (NT-3)和神经营养蛋白4/5 (NT-4/5)；以及转化生长因子-2 (TGF2)和转化生长因子-3 (TGF3)。
促进神经细胞存活的神经营养因子可以基于细胞上受体的存在情况来选择。碱性FGF、BDNF、NT-3和NT-4/5的受体可以在某些神经细胞上发现。因而，在一个实施方案中，可以用编码这些因子中的一种或多种的核酸转染本发明的细胞。在另一实施方案中，在移植前可以将这些因子中的一种或多种加入神经细胞制剂。这些神经营养因子增强本发明的细胞在接受受试者中的存活。类似地，表现皮层细胞特异性并且因而可以在移入接受受试者中时用于促进这种细胞存活的神经营养因子包括神经生长因子(NGF)，其防止例如轴突切断术的前脑胆碱能神经元的萎缩；BDNF，以及NT-3和NT-4/5。
在另一实施方案中，本文描述的神经营养因子可以与其它化合物诸如神经递质共同或联合使用，以增大它们的神经营养作用。此外，预期本文描述的神经营养因子的各种组合可以协同作用，并且因此可以共同应用以促进本发明移植的细胞的存活。
某些药物也拥有神经营养活性。这种药物的例子包括 FK506和环孢菌素A，其阻断作用于N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的谷氨酸引起的神经毒性，例如，通过增加NOS的磷酸化水平。由于磷酸化NOS 抑制其催化活性，这些药物有效地降低NO形成和防止NMDA对这些细胞的神经毒性作用。拥有神经营养活性且可以在本发明中使用的其它药物是和与FK506和/或环孢菌素A相同的结合蛋白结合、并因此介导类似的神经保护作用的那些小分子。在一个实施方案中，除治疗慢性疼痛和/或痉挛状态的细胞群之外也将这些药物施用给受试者。
在一个实施方案中，上述试剂和因子的一种或多种的组合可以用于在将细胞移植到接受受试者之前或之后促进本发明的细胞的存活。例如，可以将本发明的细胞与本文描述的试剂和因子的一种或多种接触以促进细胞在体外和/或体内存活。在另一实施方案中，可以用本文描述的试剂和因子的一种或多种的核酸转染本发明的细胞，并且也用本文描述的试剂和因子的一种或多种接触本发明的细胞。另外，尽管本文描述的神经营养因子中的许多特异地针对于特定细胞类型，但这些因子与这种细胞类型的联系不排除对不同细胞类型使用该因子。用本文描述的试剂或因子对本发明的细胞的处理可以同时或顺序发生。
在另一实施方案中，施用细胞群以治疗慢性疼痛可以与施用关于这些状况的常规疗法(例如，用阿片样物质或巴氯芬(baclofen))相偶联。在某些受试者中，这种联合疗法可导致症状的最佳改善。
在另一实施方案中，除标题细胞之外还可以施用抑制受试者中T细胞活性的试剂。如本文使用的，抑制T细胞活性的试剂被定义为这样的试剂，其导致T细胞在受试者中除去或破坏，或抑制受试者中的T细胞功能，因而T细胞仍可在受试者中存在但处于非功能状态，以至于它们不能增殖或引起或实施效应子功能，诸如细胞因子产生、细胞毒性等。术语"T细胞"包括成熟的外周血T淋巴细胞。抑制T细胞活性的试剂也可抑制未成熟T细胞的活性或成熟。
下列实施例更详细地描述本发明。这些实施例意图进一步举例说明而不是限制本文描述的发明的方面。
实施例1
在血纤蛋白原-凝血酶构建体中接种细胞
将人UTCs从低温贮存中取出，从冷冻保护剂移出并用含Ca/Mg的PBS洗涤。将细胞重悬浮在200-300μl体积中。将血纤蛋白原和凝血酶稀释在50μm等分试样中，以至于向细胞添加50μl 凝血酶和50μl 血纤蛋白原分别导致1 :133和1 :8的最终稀度。加入凝血酶组分后立即将材料分散在低聚簇细胞培养皿中并置于具有前述培养基的培养箱中。将细胞和构建体置于带有5% CO2的37℃培养箱中4日。为了评估生存力，使用制造商的说明书与Live/Dead染料(Invitrogen, Carlsbad CA)温育细胞并在荧光显微镜下观察。
与凝血酶和血纤蛋白原一起平板培养人UTCs。4日后，在应用可行的染料后通过荧光显微镜术检查hUTCs的生存力。构建体对于递送hUTCs是可行的，这是因为hUTCs在血纤蛋白原-凝血酶构建体中在体外第4日保持存活。
显示细胞生存力的照片在图1中举例说明。
实施例2
细胞的局部和全身施用
为了证明hUTCs对动物的局部和全身施用减轻疼痛行为，发明人使动物经历慢性压缩损伤(CCI)。CCI是用于测试针对神经病性疼痛的试剂和疗法的普通模型(参见Bennett 和 Xie, Pain, 1988; 33:87 - 107)。首先用赛拉嗪和氯胺酮麻醉称重为200-225g 的Sprague-Dawley大鼠。分离动物的坐骨神经。将使用4-0铬肠线的4个松的结扎线放置在坐骨神经上，在其离开坐骨切迹处。在外科手术前获得所有动物的基线行为(对Semmes Weinstein丝的机械敏感性)。外科手术后5或6日对动物进行再测试，并且对各组分层以保证每一组展示类似疼痛行为和每一组中疼痛严重性的分布是类似的。
在外科手术后5-6日，测试后立即用下列中的一种治疗动物：
1. 用修饰的凝血酶-血纤蛋白原构建体治疗8只动物。将该构建体(修饰的止血剂)应用到损伤的神经：同时在麻醉下将300μl - 400μl凝胶材料注射到损伤的神经附近。如下制备凝胶：将300μl的含钙和镁的PBS与凝血酶50μl (1 :133，最终)和50μl血纤蛋白原(1 :8，最终)混合。
2. 用细胞局部制剂治疗8只动物。该制剂包含3e5细胞剂量，其在300μl的含钙和镁的PBS、50μl 凝血酶(1 : 133，最终)和50μl血纤蛋白原 (1 :8，最终)中。在麻醉下将300μl - 400μl的凝胶材料注射到损伤的神经附近。
3. 用在2ml含钙和镁PBS中的3e6细胞的IV给药治疗8只动物。
4. 用2ml含钙和镁PBS的IV给药治疗8只动物。
5. 经历CCI 的16只对照动物保持不治疗。
局部施用
局部施用的结果在图2中举例说明。
治疗前基线分数与预测的正常值没有显著不同(差异分数为'0')。另外，对于基线分数没有显著的组间差异。
外科手术后5日，与基线水平(CCI 组：-0.02±0.01 log10gm，载体组：-0.05±0.02 log10gm，构建体组：-0.06±0.04 log10gm)相比，所有3组都发展显著的机械异常性疼痛（allodynia）(CCI 组：-0.36±0.08 log10gm，载体组：-0.31±0.07 log10gm，构建体组：-0.34±0.08 log10gm)。施用后11和20日，与基线水平相比，CCI组(无治疗)保持显著超敏感的(分别是-0.54±0.12 log10gm和-0.78±0.14 log10gm)。在施用后第11和20日，载体组与基线相比保持显著超敏感的，但比CCI组显著低敏感(分别是-0.18±0.01 log10gm和-0.27±0.12 log10gm)。构建体组在施用后第11日发展显著的低敏感性(0.21±0.19 log10gm)和在第20日显著降低的超敏感性(-0.08±0.03 log10gm)。
全身(静脉内)施用
全身(静脉内)施用的结果在图3中举例说明。
治疗前基线分数与预测的正常值没有显著不同(差异分数为'0')。另外，对于基线分数没有显著的组间差异。
外科手术后5日，与基线水平(CCI 组: -0.02±0.01 log10gm, 载体组: -0.01±0.01 log10gm, 构建体组: -0.00±0.01 log10gm)相比，所有3组都发展显著的机械异常性疼痛(CCI 组: -0.35±0.08 log10gm, 载体组: -0.40±0.05 log10gm, 构建体组: -0.55±0.09 log10gm)。施用后10和20日，CCI(无治疗)和载体组与基线水平相比保持显著超敏感的(CCI分别为: -0.53±0.11 log10gm和- 0.76±0.10 log10gm，载体分别为: -0.61±0.14 log10gm和-0.83±0.11 log10gm)。在第10和20日，构建体组的超敏感性与2个其它组相比显著降低(-0.33±0.10 log10gm和-0.41±0.11 log10gm)。
实施例3
生物学构建体在减轻神经病性疼痛中的功效
在局部注射后和尾静脉施用后检查疼痛行为。
材料和方法
所有大鼠经历如前述的CCI。简言之，在赛拉嗪/氯胺酮麻醉下，分离动物的坐骨神经。将使用4-0铬肠线的4个松的结扎线放置在坐骨神经上，在其离开坐骨切迹处。在外科手术前获得所有动物的基线行为(对Semmes Weinstein丝的机械敏感性)。外科手术后6日对动物进行再测试，并且对各组分层以保证每一组展示类似疼痛行为和每一组中疼痛严重性的分布是类似的。
在外科手术(因为神经病性疼痛通过触觉异常性疼痛的存在确认)后6日，用下列治疗中的一种治疗动物：
1. 向尾静脉全身施用约 2 ml含细胞或载体的流体(表3-1)。
2. 局部施用细胞或载体(表3-2)。
3. 测试前用加巴喷丁治疗的对照动物。
然后在治疗后第7、10、14、17和21日测试动物的机械敏感性(触觉异常性疼痛)。检查者对于治疗是不知情的；代码只在研究结束时和将结果提交给负责研究的医生之后公开。
在3个分开的时间段（sessions）中实施研究
表3-1 : 全身施用
表3-2: 局部施用
安死术后收获相关的神经并在福尔马林中储存。构建体施用和行为测试由对治疗组不知情的人实施。
统计学分析：每一动物针对其自身的基线(用于评价基线疼痛行为)和针对其自身的疼痛行为进行评价，并与其自身的外科手术前机械敏感性进行比较以评估恢复。数据表示为与神经病性疼痛阶段(外科手术后5-6日)的水平的变化百分比。对于治疗实施重复测量ANOVA，然后实施Fisher's PLSD检验。提供关于受侵袭和对侧爪的单独的数据。
结果：
局部施用
治疗前基线分数与预测的正常值没有显著不同(两爪间的差异分数为'0')。另外，对于基线分数没有显著的组间差异。外科手术后5日，所有3组与基线水平相比发展显著的机械异常性疼痛(参见行数据)。
受侵袭侧：
如图4中对期望的胶原(Colbar)所示，加巴喷丁减轻疼痛。单独的载体和细胞对疼痛行为没有作用。低剂量(组4)具有短期作用，最多为施用后10日。高剂量(组2)具有最显著作用，对于总体分析(Fisher's PLSD检验)，与用加巴喷丁的成功治疗没有显著不同。然而重要的是指出，该治疗与其它组作用没有显著不同。(统计学分析在图10中提供)。
对侧爪未表现显著的触觉异常性疼痛，治疗组对该侧测试均没有显著作用。(结果在图5，并且统计学分析在图11中提供)。
Evicel (Omrix)
如图6中对Evicel (Omrix)所示，加巴喷丁治疗减轻疼痛。低剂量(组8)与加巴喷丁一样有效，并且在第14日甚至略微较好。载体(组9)比两个较高剂量(组6和7)更有效，该两个较高剂量根本不具有任何减轻作用。(结果在图6中显示并且统计学分析在图12中提供)。
对侧爪未表现触觉异常性疼痛，治疗组对该侧测试均没有显著作用。(统计学分析在图7中提供)。
全身施用
受侵袭侧：全身施用受侵袭侧(左)，神经病性疼痛变化
如图8所示，加巴喷丁减轻疼痛。1e7(组B)作用与加巴喷丁作用接近。其它两组(A和D)作用与pbs作用没有不同。(统计学分析在图14中提供)。
对侧侧：全身施用对侧侧(右)，神经病性疼痛变化
对侧爪未表现触觉异常性疼痛，治疗组对机械敏感性都没有显著作用。(结果在图9中显示并且统计学分析在图15中提供)。
结论
疼痛通过全身施用1e7 hUTC 细胞和通过局部施用Colbar 载体中的高剂量(1.00E+065)细胞显著降低。然而，最显著作用通过局部施用带有Evicel 载体的低剂量(1.00E+05)细胞诱导。该作用不低于普通神经病性疼痛药疗法加巴喷丁诱导的作用。
实施例4
大鼠Chung疼痛模型中全身注射的细胞的治疗和镇痛作用的评价
该研究用于检查神经病性疼痛Chung 模型中uHTC 细胞的抗伤害感受(antinociceptive)作用。通过外科手术后研究第6日全身施用给予细胞治疗，并且测量它们对疼痛反应的作用。该研究不依照任何具体的管理指南。结果证明，在所有给定剂量的hUTC细胞中都有显著的疼痛减轻作用。与载体相比，在所有测试日，以150 mg/kg剂量施用并作为阳性对照的加巴喷丁在作为镇痛化合物减轻疼痛方面显著地有活性。
在研究开始时，研究中所有动物的总平均体重是192.62 ± 1.42 g。所有动物在研究的自始至终增加重量，并且没有发现重量增加方面的显著差异。
Von Frey用于评估动物对疼痛的反应。使用下列三种不同方法计算结果。
通过log除法(log division)计算的Von Frey结果。使用Von Frey装置(Touch Test?)评估对疼痛的反应。根据Touch Test?给出的值将缩回腿所需的力的克数转变成log力。用缩回健康腿(右)所需的log力除以缩回手术腿(左)所需的log力。在每一测量时间点每一治疗组与载体对照组的比较显示，在几个时间点，在所有治疗组中相对于载体组显著的疼痛减轻(p<0.01和p<0.05)。在所有测试日期间与载体治疗组(组4M；p<0.01)相比，用阳性对照项目加巴喷丁的治疗(组5M)作为疼痛减轻化合物是有活性的。
通过简单减法计算的Von Frey结果。计算Von Frey值的另一方式是通过缩回健康右腿所需的力减去缩回疼痛左腿所需的力的简单减法。当比较每一测量时间点每一治疗组与载体对照组的Von Frey值时，结果显示，在几个时间点，在所有治疗组中相对于载体组显著的疼痛减轻。在所有测试日期间与载体治疗组(组4M；p<0.01)相比，阳性对照加巴喷丁(组5M)具有显著的疼痛减轻点。
通过相对于治疗前的简单减法计算的Von Frey结果。在每一测量时间点每一治疗组的Von Frey值与研究第5日测量的治疗前Von Frey值的比较显示，在几个时间点，在所有治疗组中相对于载体组显著的疼痛减轻。在所有测试日与治疗前研究第5日的相同组相比，阳性对照加巴喷丁(组5M)具有显著的疼痛减轻作用(p<0.01)。
本研究的目标是评价在大鼠Chung神经病性疼痛模型中，外科手术后第6日通过尾静脉全身施用给予的hUTC细胞的治疗活性。
实验测试项目：
用于全身注射的hUTC的制备：
在验证合格的BSL II生物安全柜中使用无菌技术用hUTC的开放小瓶实施所有步骤。
解冻hUTC (细胞在-80℃贮存)：
通过在37℃水浴中轻柔回荡小瓶大约1-2分钟直至恰好解冻而解冻hUTC的冷冻小瓶。用乙醇喷射(sprayed down)小瓶，用Kimwipe干燥并置于生物安全柜中。除去冷冻小瓶盖并通过使用1 ml移液管上下移液2次轻柔混合内容物。然后使用移液管将1 ml解冻的hUTC悬浮液转移到15 ml管中。新的1 ml移液管用于将1 ml无菌PBS加入冷冻小瓶。为了悬浮残余的解冻的hUTC细胞，使PBS上下移液2次。将1 ml残余的hUTC悬浮液移液到含有解冻的hUTC悬浮液的15 ml管中。
使用新的10 ml移液管，将11 ml的PBS加入hUTC悬浮液中以达到总共13 ml。对于每一小瓶细胞，使用1 ml 洗涤 + 12 ml洗涤。
于室温在250 g (或1200 rpm)离心hUTC悬浮液5分钟。将管从离心中移开并同时注意不扰乱沉淀的hUTC，使用1个10 ml移液管将12.7 ml上清液向上移液并弃去。
使用无菌5 ml移液管对每小瓶解冻的hUTC沉淀加入1 ml无菌PBS，以等于大约1 ml/小瓶的总体积。通过轻柔上下移液确保不产生气泡使沉淀重悬浮。
将50 μl锥虫蓝溶液加入hUTC微量离心机(microfuge)计数管。使用P200 Pipetman将细胞在PBS中稀释1 : 10 (500 μl中的50 μl)。使用P200 Pipetman将50 μl稀释的hUTC悬浮液加入微量离心机管中的锥虫蓝溶液。通过移液管轻柔但彻底地混合管的内容物并将10 μl锥虫蓝染色的hUTC加载到血细胞计数器中。使用最外面的4个大的血细胞计数器围梁(girds)计数hUTC。记录无色 (存活的)和蓝色染色的(非存活的)hUTC的数目和总数。存活hUTC浓度、细胞悬浮液的存活hUTC总含量和%存活hUTC计算如下：
1. 总无色hUTC ÷ 4 * 20 * 10,000 = 存活hUTC浓度，以hUTC /ml计。
2. 最终体积 * 以hUTC /ml计的存活hUTC浓度 = 总存活hUTC。
3. 总无色hUTC ÷ 总无色和蓝色染色的 hUTC* 100 = %存活hUTC。
计算重悬浮hUTC以便实现适当浓度的hUTC/μl的体积。
对于2 ml/动物:
-对于1 *106 : 5*105 / ml
-对于3*106: 1.5*106 / ml
- 对于10*106 : 5*106 / ml
通过注射器事先上拉细胞，在冰上水平贮存并在注射前立即通过轻柔转动混合。
测试系统
物种/株: 大鼠Sprague Dawley。
来源: Harlan Laboratories Israel, Ltd. (ISO 9001 :2000 证书号.:US2002/3081 )。
性别: 雄性
动物总数: n= 60
年龄: 年轻成体；在研究起始时称重160-189 g。
体重: 治疗起始时动物的体重变化不超过平均重量 ± 20%。
动物健康: 在它们到达时检查在该研究中使用的动物的健康状态。仅使健康状态良好的动物适应于实验室条件并在研究中使用。
适应: 5日。
圈养(housing): 在适应期间和贯穿整个研究持续时间，将动物圈养在限制进入的啮齿类动物设备中并保持在组中，每个聚丙烯笼子最多5只大鼠。笼子装备有固体底部并填充以无菌刨花作为衬垫材料。
食物和水: 对动物随意提供商业无菌啮齿类动物食物并自由取得饮水，所述饮水通过带有不锈钢吸管(sipper)的聚乙烯瓶供给每一笼子。研究中使用的食物批次的饲养场分析与研究数据包括在档案中。定期监控水。
环境: 设置自动控制的环境条件以维持温度为20-24℃，和相对湿度(RH)30-70%，12: 12小时光暗周期和研究室中15-30换气/h。每日监控温度和RH。控制计算机监控光周期。
鉴定: 给予动物独特的动物鉴定耳部标识。该编号也出现在笼卡上，在每一笼的前面可见。笼卡也包含研究编号和关于治疗组的所有其它相关细节。
随机化: 将动物随机分配给实验组。
终止: 在研究结束时，通过CO2窒息对存活动物实施安死术。
合理性: 选择大鼠是因为其代表用于该实验动物模型的选择物种。
测试组和剂量水平的构成：
下表列出构成研究的5个实验组。
表4-1
测试程序：
研究时间表：
神经病性疼痛诱导：在麻醉下将大鼠置于伏卧位，并使左脊椎旁肌与棘突在L4-S2水平分离。用小咬骨钳小心取出L6横突以可视地鉴定L4- L6脊神经。分离左侧L5和L6脊神经并用3-0 丝线紧紧结扎，然后用刀片切断。外科手术后使大鼠回到笼中并保持在加热灯下，直至它们醒来。
为了形成同质的治疗组和遵守随机化，根据包括/排除标准对所有手术大鼠分组。在Chung程序后在研究第5日根据包括/排除标准仅选择60只手术动物。
包括标准：
· 舔手术爪，伴随用嘴轻柔咬或拉甲；
· 将腿保持在（Holding the leg）空中；
· 在神经损伤的对侧侧承重；
· 后爪畸形以及异常姿态和步态；
· 左后爪虚弱。
排除标准：
不能移动它们的爪的动物表现L4破坏的迹象。将这些动物从研究中排除。
治疗：
在Chung外科手术后研究第6日，通过向尾静脉全身注射对动物(组1M、2M、3M和4M)给予它们各自的治疗。组5M动物接受加巴喷丁治疗，剂量是经腹膜内150 mg/kg，在起始于研究第7日的每一行为评估前120分钟实施。在所有情况下，所有给药作为单次施用应用。在研究结束时，使动物暴露于CO2实施安死术。
观察和检查：
Von Frey检查：
使用Von Frey 装置 (Touch Test?)针对机械异常性疼痛评估对疼痛的反应。将大鼠置于安置有金属网表面的围栏中，但允许其自由移动。大鼠的小室覆盖有红色玻璃纸以减小环境干扰。测试在探索行为停止后开始。单丝设置提供大约对数标度的实际力和线性标度的感知强度。用于计算的对数标度如下：
操作原则：当给定长度和直径的纤维的尖端以直角压在皮肤上时，只要研究者继续推进探针直至纤维弯曲，应用的力就增加。纤维弯曲后，探针可以继续前进，其引起纤维更加弯曲，但不应用另外的力。该原则使得研究者有可能使用手持式探针对爪应用宽耐量内的可再现力。
啮齿类动物在爪被出乎意料地触摸时表现爪缩回反射。Touch Test? Sensory Evaluator可以在大鼠足的跖面上使用，并且动物将通过拉回其爪而指示感觉。提高缩回反射所需的最小力被考虑为参考值。
计算方法：根据上文的表将以克表示的Von Frey力的原始数据转变为log力。此外，应用最大值(60 g)以减少两腿间任意的高差距。缩回健康腿(右)所需的log力除以缩回手术腿(左)所需的log力。
该计算呈现当每一腿的力之间的比相似时接近1的健康状态下的腿的值。值增加表示更疼痛状态。基线值的结果指示值1。
体重：在每一测试日进行动物的个别体重的测定。
统计学分析：所有参数表示为平均值和平均值的标准误(SEM)并使用配对和非配对双尾T检验(Microsoft Excel)分析。小于0.05或小于0.01的概率(p)值被考虑为显著的。
人道的终点：在研究结束时，使动物暴露于CO2实施安死术。
结果：在研究开始时，所有动物的总平均体重是192.62± 1.42 g。尽管所有动物在研究时间段期间重量增加，但在组间没有观察到显著差异(图17和18)。
Von Frey实验：使用Von Frey 装置 (Touch Test?)针对机械异常性疼痛评估对疼痛的反应。根据Touch Test?给出的值(参考部分7.1)将以克表示的缩回力转变为log力。使缩回健康腿(右)所需的log力除以缩回手术腿(左)所需的log力。该计算呈现当每一腿的力之间的比相似时接近1的健康状态下的腿的值。值增加表示更疼痛状态。(图19、20和21)。
通过log除法计算的Von Frey结果：当在每一时间点比较每一治疗组与载体对照组时，治疗组显示如下的显著的疼痛减轻：
与载体治疗组(组4M)相比，在研究第7、10、26和30日，用低浓度细胞治疗的动物(组1M)显示显著的疼痛减轻：在研究第7日为1.10±0.03，其相对于组4M的1.17±0.02 (p<0.05)。
与载体治疗组(组4M)相比，用中等浓度细胞治疗的动物(组2M)显示显著的疼痛减轻，在研究第7、10和26日p<0.05，并且在研究第17和30日p<0.01：在研究第7日为1.10±0.02，其相对于组4M的1.17±0.02 (p<0.05)。
与载体治疗组(组4M)相比，在研究第7、21、26和30日，用高浓度细胞治疗的动物(组3M)显示显著的疼痛减轻：在研究第7日为1.07±0.02，其相对于组4M的1.17±0.02 (p<0.01)。
与载体治疗组相比，在所有测试日期间，用阳性对照项目加巴喷丁的治疗(组5M)作为疼痛减轻化合物是有活性的：在研究第7日为1.04±0.02，其相对于组4M的1.17±0.02 (p<0.01)。
通过简单减法计算的Von Frey结果：也使用简单减法计算Von Frey结果：缩回健康右腿所需的力减去缩回疼痛左腿所需的力。
在每一时间点每一治疗组的Von Frey值与载体对照组的比较显示如下的显著的疼痛减轻。
与载体治疗组(组4M)相比，在研究第7日(p<0.05)和在研究第10和26日(p<0.01)，用低浓度细胞治疗的动物(组1M)显示显著的疼痛减轻：在研究第10日为15.67±6.18 g，其相对于组4M的40.25±5.82 g(p<0.01)。与载体治疗组(组4M)相比，在研究第7、10和17日(p<0.05)以及在研究第30日(p<0.01)，用中等浓度细胞治疗的动物(组2M)显示显著的疼痛减轻：在研究第10日为17.33±6.73 g，其相对于组4M的40.25±5.82 g(p<0.05)。与载体治疗组(组4M)相比，在研究第7、21、26和30日，用高浓度细胞治疗的动物(组3M)显示显著的疼痛减轻(p<0.01)：在研究第26日为18.83±8.25 g，其相对于组4M的46.67±2.68 g(p<0.01)。与载体治疗组(组4M)相比，在所有测试日期间，用阳性对照项目加巴喷丁的治疗(组5M)作为疼痛减轻化合物是有活性的：在研究第10日为7.92±5.35 g，其相对于组4M的40.25±5.82 g(p<0.01)。
通过相对于治疗前的简单减法计算的Von Frey结果：在每一时间点每一治疗组的Von Frey值与在研究第5日测量的治疗前Von Frey值的比较显示如下的显著的疼痛减轻。与治疗前研究第5日的相同组相比，在研究第7、21和26日(p<0.05)以及在研究第10、14和17 日(p<0.01)，用低浓度细胞治疗的动物(组1M)显示显著的疼痛减轻：在研究第7日为28.08±7.30 g，其相对于在研究第5日的46.67±2.79 g(p<0.05)。与治疗前研究第5日的相同组相比，在研究第14日(p<0.05)以及在研究第10、17和30日(p<0.01I)，用中等浓度细胞治疗的动物(组2M)具有显著的疼痛减轻：在研究第10日为17.33±6.73 g，其相对于在研究第5日的47.25±.2.77 g (p<0.01)。与治疗前研究第5日的相同组相比，在所有测试日(7、10、14、17、21、26、30)期间，用高浓度细胞治疗的动物(组3M)具有显著的疼痛减轻：在研究第7日为23.58±6.26 g，其相对于在研究第5日的46.58±2.30 g (p<0.01)。
与治疗前研究第5日的相同组相比，在所有测试日期间，用阳性对照项目加巴喷丁的治疗(组5M)具有显著的疼痛减轻：在研究第7日为14.92±6.46 g，其相对于在研究第5日的45.17±3.66 g(p<0.01)。
考虑到在此研究条件下得到的并限制为in-life数据的发现，处于低、中和高剂量的hUTC作为镇痛项目是有效的，如Von Frey测试参数反映的。
实施例5
细胞的分离
脐带细胞分离。脐带是从National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, Pa.)获得的。这些组织是在正常分娩之后获得的。细胞分离规程是在层流罩超净台中在无菌条件下进行的。为了除去血液和碎片，将脐带在磷酸缓冲盐水(PBS; Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中在100 单位/毫升青霉素、100 毫克/毫升链霉素和.25 微克/毫升两性霉素B(Invitrogen, Carlsbad, Ca.)存在下洗涤。然后将组织在150 cm2组织培养板中在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖和DMEM-高葡萄糖，Invitrogen)存在下进行机械解离，直至组织被绞碎成细浆。将该剁碎的组织转移至50毫升锥形管中(大约每管5克组织)。
然后将组织在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化，每一种培养基中含有100 单位/毫升青霉素、100 毫克/毫升链霉素、0.25 微克/毫升两性霉素B和消化酶。在一些实验中，使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”)(胶原酶(Sigma, St Louis, Mo.)，500单位/毫升；以及分散酶(Invitrogen)，50单位/毫升，于DMEM-低葡萄糖培养基中)。在其它实验中，使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(“C:D:H”)(C:D:H=胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；以及透明质酸酶(Sigma)，5单位/毫升，于DMEM-低葡萄糖中)。将含有组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃在定轨振荡器(Environ, Brooklyn, N.Y.)中于225 rpm温育2小时。
消化后，将组织在150 × g离心5分钟，吸出上清液。将沉淀重悬浮于20毫升生长培养基(DMEM:低葡萄糖(Invitrogen)，15% (v/v)胎牛血清(FBS，确定成分的胎牛血清；Lot#AND18475，Hyclone, Logan, Ut.)、0.001% (v/v) 2-巯基乙醇(Sigma)、100 单位/毫升青霉素、100 微克/毫升链霉素和0.25 微克/毫升两性霉素B(各来自Invitrogen, Carlsbad, Ca))中。将该细胞悬浮液过滤通过70-微米尼龙BD FALCON Cell Strainer (BD Biosciences, San Jose, Ca.)。使包含生长培养基的另外5毫升漂洗液(rinse)通过该滤过器。然后将该细胞悬浮液通过40-微米尼龙细胞滤过器(BD Biosciences, San Jose, CA)，并追加另外5毫升的生长培养基漂洗液。
将滤液重悬浮于生长培养基(总体积50毫升)中并在150 × g离心5分钟。吸出上清液并将细胞重悬浮于50毫升的新鲜生长培养基中。将该过程再重复两次。
最后离心后，吸出上清液并将细胞沉淀重悬浮于5毫升新鲜生长培养基中。使用锥虫蓝染色测定活细胞数目。然后将细胞在标准条件下培养。
将从脐带组织分离出的细胞以5000细胞/cm2在明胶-包被的T-75瓶(Corning Inc., Corning, N.Y.)上接种于生长培养基中。2天后，从瓶中吸出使用过的培养基和非贴壁细胞。将贴壁细胞用PBS洗涤三次以除去碎片和血液来源的细胞。然后对细胞补充生长培养基并允许其生长至汇合(从传代0起约10天(至传代1)。在随后的传代(从传代1至传代2等)中, 细胞在4-5天内达到亚汇合(75-85%汇合)。对这些随后的传代而言，将细胞以5000细胞/cm2接种。使细胞在含5%二氧化碳的湿润培养箱中在37℃生长。
在一些实验中，在用LIBERASE? (2.5 毫克每毫升, Blendzyme 3; Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)和透明质酸酶(5 单位/毫升, Sigma)消化后，在DMEM-低葡萄糖培养基中将细胞从脐带组织分离。组织消化和细胞分离如上文对其它蛋白酶消化所述，但使用LIBERASE?/透明质酸酶混合物替代C:D或C:D:H酶混合物。用LIBERASE?组织消化导致细胞群从容易扩增的产后组织分离。
比较使用不同酶组合从脐带分离细胞的程序。针对消化比较的酶包括：i) 胶原酶；ii) 分散酶；iii) 透明质酸酶；iv) 胶原酶：分散酶混合物 (C:D)；v) 胶原酶：透明质酸酶混合物(C :H)；vi) 分散酶：透明质酸酶混合物(D :H)；和vii) 胶原酶：分散酶：透明质酸酶混合物(C:D:H)。观察到利用这些不同酶消化条件的细胞分离差异(表4-1)。
进行其它尝试以通过不同方法从脐带分离细胞库。在一种情况下，对脐带切片并用生长培养基洗涤，以移去血凝块和胶状材料。收集血液、胶状材料和生长培养基的混合物并在150 x g离心。将沉淀重悬浮和在明胶包被的瓶上接种于生长培养基中。根据这些实验，分离出容易扩增的细胞群。
细胞也已分离自得自NDRI的脐带血样品。使用的分离规程是Ho等人的国际专利申请PCT/US2002/029971的规程。将脐带血(NDRI, Philadelphia Pa.)样品(分别是50毫升和10.5毫升)与裂解缓冲液(过滤灭菌的155毫摩尔氯化铵，10毫摩尔碳酸氢钾，0.1毫摩尔EDTA，缓冲为pH 7.2 (所有组分来自Sigma, St. Louis, Mo.)混合。以1 :20 脐带血对裂解缓冲液的比裂解细胞。涡旋产生的细胞悬浮液5分钟，并在环境温度温育2分钟。将裂解物离心(10 分钟，200 x g)。将细胞沉淀重悬浮于包含10%胎牛血清(Hyclone, Logan Ut.)、4毫摩尔谷氨酰胺(Mediatech Herndon, Va.)、100单位每毫升青霉素和100 微克每毫升链霉素(Gibco, Carlsbad, Ca.)的完全极限必需培养基 (Gibco, Carlsbad Ca.)中。将重悬浮的细胞离心(10 分钟，200 x g), 吸出上清液，并且在完全培养基中洗涤细胞沉淀。将细胞直接接种在T75 瓶 (Corning, N.Y.)、T75 层粘连蛋白-包被的瓶或T 175纤连蛋白-包被的瓶(均为 Becton Dickinson, Bedford, Ma.)上。
为了确定细胞群是否会在不同条件下分离并在分离后立即在多种条件下扩增，根据上文提供的程序，在带有或没有0.001%(v/v) 2-巯基乙醇的生长培养基(Sigma, St. Louis, Mo.)中使用C:D:H酶组合消化细胞。所有细胞在100 单位每毫升青霉素和100 微克每毫升链霉素存在下生长。在所有测试条件下，细胞在传代0和传代1之间附着和扩增良好(表4-2)。在条件5-8和13-16中的细胞表现增殖良好直至接种后4次传代，在该点它们被冷藏。
C:D:H组合提供分离后最佳的细胞得率，并生成比其它条件在培养中扩增多得多的世代的细胞(表4-1)。使用单独的胶原酶或透明质酸酶不得到可扩增细胞群。没有进行尝试来确定该结果是否特异于被测试的胶原酶。
表4-1：使用不同酶组合从脐带组织分离细胞
关键字：+ = 好， ++ = 非常好，+++ = 极好的，X = 不成功。
细胞在针对酶消化和生长测试的所有条件下在传代0和1间附着和扩增良好(表4-2)。实验条件5-8和13-16中的细胞增殖良好直至接种后4次传代，在该点它们被冷藏。对所有细胞冷藏用于进一步分析。
表4-2：在不同条件下产后细胞的分离和培养扩增
具核细胞迅速地附着和生长。通过流式细胞术分析这些细胞，并且其类似于通过酶消化得到的细胞。
制剂包含红细胞和血小板。在前3周期间没有具核细胞附着和分裂。接种后3周改变培养基，且没有观察到细胞附着和生长。
细胞群可使用酶组合胶原酶(金属蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明质酸酶(粘液溶解酶，其分解透明质酸)有效地从脐组织分离。也可使用作为胶原酶和中性蛋白酶掺合物的LIBERASE。Blendzyme 3，其为胶原酶(4 Wunsch 单位/克)和嗜热菌蛋白酶(1714 酪蛋白单位/克)，也与透明质酸酶共同使用以分离细胞。当在生长扩增培养基中在明胶包被的塑料上培养时，这些细胞容易扩增许多代。
细胞也从脐带中的残余血液而不是脐带血中分离。从组织洗涤的血凝块中在所用条件下附着和生长的细胞的存在可归因于在解剖过程中释放的细胞。
实施例6
细胞的生长特征
将脐带组织来源的细胞的细胞扩增潜能与分离的干细胞的其它群比较。细胞扩增至衰老的过程被称为Hayflick's极限(Hayflick L., J. Am. Geriatr. Soc. 1974; 22(1): 1-12; Hayflick L., Gerontologist, 1974; 14(l):37-45。
于室温通过将20毫升 2% (w/v)明胶(Type B: 225 Bloom; Sigma, St Louis, Mo.)加入T75瓶(Corning Inc., Corning, N.Y.)包被组织培养塑料瓶20分钟。移去明胶溶液后加入10 毫升磷酸缓冲盐水(PBS) (Invitrogen, Carlsbad, Ca.)，然后吸出。
对于生长扩增潜能的比较，利用下列细胞群：i) 间充质干细胞 (MSC; Cambrex, Walkersville, Md.)；ii) 脂肪-来源的细胞(美国专利号6,555,374 B1；美国专利申请US20040058412)；iii) 正常皮肤成纤维细胞(cc-2509 lot # 9F0844; Cambrex, Walkersville, Md.)；和iv) 脐-来源的细胞。细胞最初以5,000 细胞/cm2在明胶-包被的T75瓶上接种在生长培养基中。对于随后的传代，如下处理细胞培养物。胰蛋白酶消化后，在锥虫蓝染色后计数活细胞。将细胞悬浮液(50 微升)与锥虫蓝(50 微升, Sigma, St. Louis Mo.)组合。使用血细胞计数器估计活细胞数目。
计数后，将细胞以5,000细胞/cm2在明胶-包被的T75 瓶上接种于25毫升的新鲜生长培养基中。使细胞在标准气氛(5%二氧化碳(v/v))中在37℃生长。每周改变生长培养基2次。当细胞达到约85%汇合时，使它们传代；重复该过程直至细胞达到衰老。
在每一传代对细胞进行胰蛋白酶消化和计数。计算活细胞得率、群体倍增[ln (细胞最终/细胞起始)/ln2]和倍增时间(在培养中的时间/群体倍增)。为了确定最佳细胞扩增的目的，通过在前传代的总得率乘以每一传代的扩增系数 (即，扩增系数 = 细胞最终/细胞起始)确定每一传代的总细胞得率。
也测试堆积(banked)在传代10的细胞的扩增潜能。应用不同组的条件。测试正常皮肤成纤维细胞 (cc-2509 lot # 9F0844; Cambrex, Walkersville, Md.)、脐-来源的细胞。这些细胞群在前已堆积在传代10，已在5,000 细胞/cm2下在每一传代培养至该点。测定细胞密度对细胞解冻后传代10时细胞群的作用。将细胞在标准条件下解冻并使用锥虫蓝染色计数。然后将解冻的细胞以1,000 细胞/cm2 接种在生长培养基中。使细胞在标准气氛条件下在37℃生长。每周改变生长培养基2次。细胞在它们达到约85%汇合时传代。然后细胞传代直至衰老，即，直至它们不再能进一步扩增。在每一传代对细胞进行胰蛋白酶消化并计数。计算细胞得率、群体倍增(ln (细胞最终/细胞起始)/ln2)和倍增时间(在培养中的时间/群体倍增)。通过在前传代的总得率乘以每一传代的扩增系数 (即，扩增系数 = 细胞最终/细胞起始)确定每一传代的总细胞得率。
在另一实验中测试在低细胞接种条件下的新分离的脐带组织-来源的细胞培养物的扩增潜能。脐-来源的细胞如实施例4中所述地分离。将细胞以1,000 细胞/cm2接种和如上文所述传代直至衰老。使细胞在标准气氛条件下在37℃生长。每周改变生长培养基2次。细胞在它们达到约85%汇合时传代。在每一传代对细胞进行胰蛋白酶消化并通过锥虫蓝染色计数。对每一传代计算细胞得率、群体倍增(ln (细胞最终/细胞起始)/ln2)和倍增时间(在培养中的时间/群体倍增)。通过在前传代的总得率乘以每一传代的扩增系数 (即，扩增系数 = 细胞最终/细胞起始)确定每一传代的总细胞得率。使细胞在明胶和非明胶包被的瓶上生长。
已证明，在某些情况中低O2细胞培养条件可以改进细胞扩增(美国公开号US20040005704)。为了确定脐-来源的细胞的细胞扩增是否可以通过改变细胞培养条件改进，将脐-来源的细胞的培养物在低氧条件中生长。将细胞以5,000 细胞/cm2在明胶包被的瓶上接种在生长培养基中。将细胞最初在标准气氛条件下培养至传代5，在该点将它们转移到低氧(5% O2)培养条件。
在其它实验中，使细胞在未包被的、胶原-包被的、纤连蛋白-包被的、层粘连蛋白-包被的和matrigel-包被的板上扩增。培养物已证明在这些不同基质上扩增良好。
脐-来源的细胞扩增大于40次传代，在60天内产生> 1E17细胞的细胞得率。与之相比，MSCs和成纤维细胞分别在< 25天和<60天后衰老。尽管脂肪-来源的和网膜细胞扩增几乎60天，但它们分别生成4.5x1012和4.24x1013的总细胞得率。因而，当在所用的实验条件下以5,000 细胞/cm2接种时，脐-来源的细胞扩增得比在相同条件下生长的其它细胞类型好得多(表6-1)。
表6-1：生长至衰老的不同细胞群的生长特征
脐-来源的细胞和成纤维细胞扩增大于10次传代，在60天内产生> 1E11细胞的细胞得率(6-2)。在这些条件下60天后，成纤维细胞变得衰老；而脐-来源的细胞在80天后衰老，完成>50群体倍增。
表6-2: 使用低密度生长扩增的不同细胞群从传代10至衰老的生长特征
细胞在减少的氧条件下扩增良好，然而，对于脐带组织来源的细胞在低氧条件下培养似乎不对细胞扩增具有显著作用。标准气氛条件已证实成功用于生长足够数目的细胞，并且低氧培养对于脐带组织来源的细胞的生长是不需要的。
以约5,000细胞/cm2的密度、在生长培养基中在明胶-包被或未包被瓶上、在标准大气氧下生长分离的脐带组织来源的细胞的目前的细胞扩增条件足以在传代11产生大数目的细胞。另外，数据提示细胞可以使用较低密度培养条件(例如，1,000 细胞/cm2)容易地扩增。在低氧条件下的脐带组织-来源的细胞扩增也促进细胞扩增，尽管在利用这些条件用于生长时没有观察到细胞扩增潜能方面的增加的改进。目前，在标准气氛条件下培养脐带组织来源的细胞优选用于产生大的细胞库。但当培养条件改变时，脐带组织-来源的细胞扩增可以同样改变。该策略可用于增强这些细胞群的增殖和分化能力。
在所利用的条件下，尽管MSC和脂肪-来源的细胞的扩增潜能受到限制，但脐带组织来源的细胞容易扩增成大的数目。
实施例7
细胞在包含D-缬氨酸的培养基中的生长
已报告，包含D-缬氨酸而不是正常L-缬氨酸同工型（isoform）的培养基可以用于选择性抑制成纤维细胞-样细胞在培养物中的生长(Hongpaisan, Cell Biol Int., 2000; 24:1-7; Sordillo 等人, Cell Biol Int Rep., 1988; 12:355-64.)。实施实验以确定脐带组织来源的细胞是否能在包含D-缬氨酸的培养基中生长。
将脐-来源的细胞(P5)和成纤维细胞(P9)以5,000 细胞/cm2接种于明胶-包被的T75瓶(Corning, Corning, N.Y.)中。24小时后，移去培养基并用磷酸缓冲盐水(PBS)(Gibco, Carlsbad, Ca.)洗涤细胞以除去残余的培养基。将培养基替换以改良的生长培养基(DMEM，带有D-缬氨酸(特殊定制，Gibco)、15% (v/v)透析的胎牛血清(Hyclone, Logan, Ut.)、0.001% (v/v) β巯基乙醇(Sigma)、50单位/毫升青霉素和50毫克/毫升链霉素(Gibco))。
接种在含D-缬氨酸培养基中的脐-来源的细胞和成纤维细胞不增殖，这与接种在含透析的血清的生长培养基中的细胞不同。成纤维细胞在形态学上变化，大小增加和改变形状。4周后，所有细胞死亡并从瓶表面最终脱离。因而，可断定脐带组织来源的细胞需要L-缬氨酸用于细胞生长和维持长期生存力。L-缬氨酸优选地不从用于脐带组织来源的细胞的生长培养基除去。
实施例8
细胞的核型分析
在细胞疗法中使用的细胞系优选地是同质的，并且不含任何污染的细胞类型。在细胞疗法中使用的人细胞应当具有正常数目(46)的带有正常结构的染色体。为了鉴定同质的并且不含非产后组织起源细胞的脐带组织-来源的细胞系，对细胞样品的核型进行分析。
将来自雄性新生儿产后组织的脐带组织来源的细胞在生长培养基中培养。选择来自雄性新生儿(X, Y)的脐带组织以允许在新生儿-来源的细胞和母本来源的细胞(X, X)之间的区分。将细胞以5,000细胞每平方厘米接种在T25 瓶(Corning, Corning, N.Y.)中的生长培养基中，并扩增至80%汇合。将含有细胞的T25瓶填充以生长培养基至瓶颈。将样品通过快递递送到临床细胞遗传学实验室(估计的实验室至实验室输送时间是1小时)。由New Jersey Medical School, Newark, N.J.的Center for Human & Molecular Genetics实施染色体分析。细胞在染色体最可见的中期期间进行分析。在计数的20个中期细胞中，分析5个的正常同质核型数(2)。如果观察到2个核型，则将细胞样品表征为同质的。如果观察到大于2个核型，则将细胞样品表征为异质的。当鉴定出异质核型数(4)时，对另外的中期细胞进行计数和分析。
送去进行染色体分析的所有细胞样品被细胞遗传学实验室工作人员解释为表现正常的外观。分析的16个细胞系中的3个表现异质表型(XX和XY)，这表明存在来源于新生儿和母本起源的细胞(表8-1)。每一细胞样品被表征为同质的(表8-1)。
表8-1. 脐带组织来源的细胞的核型结果
染色体分析鉴定核型显示正常的脐-来源的细胞，如临床细胞遗传学实验室所解释的。核型分析也鉴定不含母本细胞的细胞系，如同质核型所确定的。
实施例9
细胞表面标记的流式细胞术评价
细胞表面蛋白质或"标记"通过流式细胞术的表征可以用于确定细胞系的特征。表达的一致性可以从多个供体以及在暴露于不同处理和培养条件的细胞确定。通过流式细胞术表征分离自脐的细胞系，从而提供用于鉴定这些细胞系的概况。
将细胞在生长培养基中在血浆处理的T75、T150和T225组织培养瓶(Corning, Corning, N. Y.)中培养，直至汇合。通过将2% (w/v)明胶(Sigma, St. Louis, Mo.)在室温温育20分钟而将瓶的生长表面包被以明胶。
将瓶中的贴壁细胞在磷酸缓冲盐水(PBS); (Gibco, Carlsbad, Mo.)中洗涤并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)脱离。收获细胞、离心并以1 × 107每毫升的细胞浓度重悬浮于PBS中的3% (v/v)FBS中。根据生产商的说明书，将目标细胞表面标记的抗体(参见下面)加入到100微升细胞悬浮液中，并将该混合物在暗处、在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去未结合的抗体。将细胞再悬浮于500微升PBS中并通过流式细胞术分析。流式细胞术分析采用FACS calibur仪器(Becton Dickinson, San Jose, Ca.)进行。
使用针对细胞表面标记的下列抗体。
表9-1：在表征UDC的细胞表面标记中使用的抗体
在传代8、15和20分析脐带细胞。
为了比较供体间的差异，将来自不同供体的脐带-来源的细胞进行彼此比较。
将在明胶-包被的瓶上培养的脐带-来源的细胞与在未包被的瓶上培养的脐带-来源的细胞进行比较。
比较用于分离和制备细胞的4种处理。比较通过用(1)胶原酶；(2)胶原酶/分散酶；(3)胶原酶/透明质酸酶；和(4)胶原酶/透明质酸酶/分散酶处理的来源于产后组织的细胞。
通过流式细胞术分析的在传代8、15和20的脐带-来源的细胞都表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A, B, C，这通过相对于IgG对照增加的荧光指示。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，这通过与IgG对照一致的荧光值指示。
通过流式细胞术分析的分离自单独供体的脐带-来源的细胞各自显示对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr- α和HLA-A, B, C的生产阳性，这反映在相对于IgG对照增加的荧光值上。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD 141、和HLA-DR、DP、DQ的生产是阴性的，具有与IgG对照一致的荧光值。
通过流式细胞术分析的在明胶包被和未包被的瓶上扩增的脐带-来源的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A, B, C的生产都是阳性的，相对于IgG对照具有增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD 141和HLA-DR、DP、DQ的生产是阴性的，具有与IgG对照一致的荧光值。
通过流式细胞术对脐带-来源的细胞的分析已确立了这些细胞系的特性。这些脐带-来源的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C是阳性的，并且对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的。该鉴定在变量的变异之间是一致的，所述变量包括供体、传代、培养容器表面包被、消化酶和胎盘层。在个体荧光值直方图曲线平均值和范围中观察到一些变异，但在所有所测试条件下的所有阳性曲线是正常的并表达大于IgG对照的荧光值，从而证实细胞包括具有所述标记的阳性表达的同质群。
实施例10
通过寡核苷酸阵列的细胞分析
使用寡核苷酸阵列以比较脐-来源的和胎盘-来源的细胞和成纤维细胞、人间充质干细胞以及人骨髓来源的另一细胞系的基因表达概况。该分析提供了产后来源的细胞的表征，并鉴定了这些细胞的独特分子标记。
产后组织-来源的细胞。人脐带和胎盘得自National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, Pa.)，来自患者知情同意的正常足月分娩。接收这些组织，并在用C:D:H 混合物消化后如实施例4所述分离细胞。将细胞培养于在明胶包被的塑料组织培养瓶上的生长培养基中。将培养物在37℃、在5% CO2下温育。
成纤维细胞。人皮肤成纤维细胞购买自Cambrex Incorporated (Walkersville, Md.，批号9F0844)和ATCC CRL-1501 (CCD39SK)。将两个系均培养于含10% (v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中。使细胞生长于标准组织处理过的塑料上。
人间充质干细胞 (hMSC)。hMSCs购买自Cambrex Incorporated (Walkersville, Md.，批号2F1655、2F1656和2F1657)，并根据生产商的说明书将其培养于MSCGM培养基(Cambrex)中。使这些细胞在37℃、在5% CO2下生长于标准组织培养过的塑料中。
人髂嵴骨髓细胞(ICBM)。人髂嵴骨髓接受自NDRI，具有患者的知情同意。将骨髓根据Ho等人(WO03/025149)提出的方法进行处理。将骨髓与裂解缓冲液(155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3和0.1 mM EDTA, pH 7.2)以1份骨髓对20份裂解缓冲液的比率混合。将该细胞悬浮液进行涡旋，在环境温度温育2分钟，并在500 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬浮于补充有10% (v/v)胎牛血清和4 mM谷氨酰胺的极限必需培养基-α (Invitrogen)中。将该细胞再次离心，并将细胞沉淀重悬浮于新鲜培养基中。使用锥虫蓝排除(Sigma, St. Louis, Mo.)对活的单核细胞进行计数。将该单核细胞以5 × 104细胞/cm2接种于塑料组织培养瓶中。将该细胞在37℃、在5% CO2下、在标准大气O2或5% O2下温育。将细胞培养5天，而不改变培养基。在5天的培养之后除去培养基和非贴壁细胞。将贴壁细胞保持在培养中。
使用于冷磷酸缓冲盐水(PBS)中的细胞刮棒将细胞的活性生长培养物从瓶中取出。将该细胞在300 × g离心5分钟。除去上清液，并将该细胞重悬浮于新鲜PBS中并再次离心。除去上清液，并将细胞沉淀立即冷冻并贮存在-80℃。提取细胞mRNA并将其转录为cDNA。然后将cDNA转录为cRNA并进行生物素标记。将该生物素标记的cRNA与Affymetrix GENECHIP HG-U133A寡核苷酸阵列(Affymetrix, Santa Clara, Ca.)杂交。该杂交和数据采集是根据生产商的说明书进行的。该杂交和数据采集是根据生产商的说明书进行的。数据分析是使用“微阵列的显著性分析”(SAM)版本1.21计算机软件(Tusher, V. G等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98:5116-5121)进行的。
在该研究中分析了不同的细胞群。在表9-1中列出了细胞和传代信息、培养基质和培养基。
表10-1. 通过微阵列研究分析的细胞。通过它们的识别码列出了细胞系、以及分析时的传代、细胞生长基质和生长培养基
如上所述通过主组分分析用SAM软件对数据进行评价。分析揭示在所测试细胞中以不同相对量表达的290个基因。该分析提供群之间的相对比较。
表10-2显示了对细胞对的比较而计算的欧氏(Euclidean)距离。该欧氏距离基于细胞比较，所述细胞比较基于在所述细胞类型之中差异表达的290个基因。该欧氏距离与290个基因表达之间的相似性成反比。
表10-2. 细胞对的欧氏距离。使用在细胞类型之间差异表达的290个基因计算细胞类型的欧氏距离。细胞间的相似性与欧氏距离成反比。
表10-3、10-4和10-5显示在脐组织-来源的细胞(表10-3)和胎盘-来源的细胞(表10-4)中增加的基因表达，增加和在脐带和胎盘-来源的细胞(表10-5)中降低的基因表达。
表10-3. 与所测定的其它细胞系相比，脐带-来源的细胞中表达特别增加的基因
表10-4. 与所测定的其它细胞系相比，胎盘-来源的细胞中表达特别增加的基因
表10-5. 与所测定的其它细胞系相比，脐带-来源的和胎盘-来源的细胞中表达降低的基因
表10-6、10-7和10-8显示人成纤维细胞(表10-6)、ICBM 细胞(表10-7)和MSCs(表10-8)中增加的基因表达。
表10-6. 与测定的其它细胞系相比，在成纤维细胞中表达增加的基因。
表10-7. 与测定的其它细胞系相比，在ICBM-来源的细胞中表达增加的基因。
表10-8. 与测定的其它细胞系相比，在MSC细胞中表达增加的基因。
实施本实施例以提供来源于脐带和胎盘的细胞的分子表征。该分析包括来源自三个不同脐带和三个不同胎盘的细胞。研究也包括两个不同系的皮肤成纤维细胞、三个系的间充质干细胞和三个系的髂嵴骨髓细胞。在含有针对22,000个基因的寡核苷酸探针的GENECHIP寡核苷酸阵列上分析由这些细胞表达的mRNA。
分析揭示在这些五种不同的细胞类型中，290个基因的转录物以不同量存在。这些基因包括在脐组织-来源的细胞中特别增加的7个基因，和在胎盘-来源的细胞中特别增加的10个基因。发现54个基因在胎盘-来源的和脐带-来源的细胞中具有特别较低的表达水平。
已经通过PCR证实了所选择的基因的表达，如实施例10所示。一般而言产后-来源的细胞以及具体地脐来源的细胞具有截然不同的基因表达概况，例如，与其它人细胞诸如本文测试的骨髓来源的细胞和成纤维细胞相比。
实施例11
细胞标记
使用Affymetrix基因芯片将来源于脐带的细胞的基因表达概况与来源于其它来源的细胞的那些相比较。鉴定了六个“特征”基因：氧化的LDL受体1、白细胞介素-8（IL-8）、肾素、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3 (CXC配体3)和粒细胞趋化蛋白2 (GCP-2)。这些“特征”基因在脐-来源的细胞中以相对高的水平表达。
进行该实施例中描述的程序以验证微阵列数据并比较基因和蛋白质表达的数据，以及确立一系列可靠的测定用于检测脐带组织-来源的细胞的独特标识符。
使脐-来源的细胞(四份分离物)和正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF，新生儿的和成人的)在明胶包被的T75瓶中生长于生长培养基中。使间充质干细胞(MSCs)生长于间充质干细胞生长培养基 bullet试剂盒(MSCGM; Cambrex, Walkerville, Md.)中。
对IL-8实验而言，将细胞从液氮中解冻并以5000细胞/cm2铺平板于明胶包被的瓶中，在生长培养基中生长48小时，且然后在10毫升血清饥饿培养基 [DMEM –低葡萄糖(Gibco, Carlsbad, Ca.)，青霉素(50 单位/毫升)，链霉素(50 微克/毫升)(Gibco)和0.1% (w/v)牛血清清蛋白(BSA; Sigma, St. Louis, Mo.)]中再生长8小时。然后提取RNA并将上清液在150 × g离心5分钟以除去细胞碎片。将上清液在-80℃冷冻直至ELISA分析。
将脐带-来源的细胞以及来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞在明胶包被的T75瓶中培养于生长培养基中。在传代11将细胞在液氮中冷冻。将细胞解冻并转移至15毫升离心管中。在150 × g离心5分钟后，弃去上清液。将细胞重悬浮于4毫升培养基中并计数。使细胞以375,000细胞/瓶在含15毫升生长培养基的75 cm2瓶中生长24小时。将该培养基改变为血清饥饿培养基进行8小时。在温育结束时收集血清饥饿培养基，在14,000 × g离心5分钟(并贮存在-20℃)。
为了估计每一瓶中的细胞数目，将2毫升胰蛋白酶/EDTA (Gibco, Carlsbad, Ca.)加入到每一瓶中。在细胞从瓶脱离后，采用8毫升生长培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞转移至15毫升离心管中并在150 × g离心5分钟。除去上清液并将1毫升生长培养基加入到每一管中以重悬浮细胞。使用血细胞计数器确定细胞数目。
使用 ELISA 测定(R&D System, Minneapolis, Mn.)分析由细胞分泌进入血清饥饿培养基的IL-8量。所有测定是根据制造商提供的说明书进行的。
从汇合的脐带-来源的细胞和成纤维细胞提取RNA，或用于来自如上处理的细胞的IL-8表达。根据制造商的说明书(RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, Ca.)，将细胞用350微升含β-巯基乙醇(Sigma, St. Louis, Mo.)的缓冲液RLT裂解。根据制造商的说明书(RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, Ca.)提取RNA，并进行DNA酶处理(2.7单位/样品) (Sigma St. Louis, Mo.)。将RNA用50微升DEPC处理过的水洗脱并贮存在-80℃。从人脐带提取RNA。将组织(30毫克)悬浮于700微升含2-巯基乙醇的缓冲液RLT中。将样品机械匀浆，并按照制造商的说明书进行RNA提取。采用50微升DEPC处理过的水提取RNA并贮存在-80℃。
使用含TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems, Foster City, Ca.)的随机六聚体将RNA逆转录，在25℃进行10分钟、在 37℃进行60分钟，以及在95℃进行10分钟。将样品贮存在-20℃。
使用实时PCR和常规PCR对通过cDNA微阵列鉴定为在脐带细胞中独特调节的基因(特征基因-包括氧化的LDL受体、白细胞介素-8、肾素和浆膜蛋白)进行进一步的研究。
使用在商标Assays-On-Demand (Applied Biosystems)基因表达产物下出售的基因表达产物对cDNA样品进行PCR。根据制造商的说明书(Applied Biosystems)使用配有ABI Prism 7000 SDS软件(Applied Biosystems)的7000序列检测系统将氧化的LDL受体(Hs00234028)、肾素(Hs00166915)、浆膜蛋白 (Hs00382515)、CXC配体3 (Hs00171061)、GCP-2 (Hs00605742)、IL-8 (Hs00174103)和GAPDH与cDNA和TaqMan通用PCR主混合物混合。热循环条件为最初50℃进行2分钟和95℃进行10分钟，随后40个循环的95℃进行15秒和60℃进行1分钟。根据制造商的说明书(来自Applied Biosystems用于ABI Prism 7700序列检测系统的User Bulletin#2)分析PCR数据。
使用ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Ma.)进行常规PCR以证实来自实时PCR的结果。PCR是使用2微升cDNA溶液(1 x Taq聚合酶(商标AMPLITAQ GOLD)通用混合PCR反应缓冲液(Applied Biosystems)和在94℃最初变性5分钟实施的。对每一引物组进行了扩增最优化。对IL-8、CXC配体3和浆膜蛋白 (94℃进行15秒，55℃进行15秒和72℃进行30秒，进行30个循环)；对肾素(94℃进行15秒，53℃进行15秒和72℃进行30秒，进行38个循环)；对氧化的LDL受体和GAPDH (94℃进行15秒，55℃进行15秒和72℃进行30秒，进行33个循环)。用于扩增的引物在表11-1中列出。在最终的PCR反应中引物的浓度是1微摩尔，除GAPDH为0.5微摩尔外。GAPDH引物与实时PCR相同，除未将制造商的TaqMan探针加入到最终的PCR反应中外。将样品在2% (w/v)琼脂糖凝胶中分离，并用溴化乙锭(Sigma, St. Louis, Mo.)染色。使用固定焦距POLAROID照相机(VWR International, South Plainfield, N.J.)在667胶片(Universal Twinpack, VWR International, South Plainfield, N.J.)上捕获图像。
表11-1：使用的引物
将脐带-来源的细胞用冷的4% (w/v)低聚甲醛(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.)在室温固定10分钟。使用了传代0(P0)的脐带-来源的细胞(分离后直接使用)和传代11 (P11)(脐带-来源的细胞的两份分离物)以及成纤维细胞(P11)的各一份分离物。使用针对下列表位的抗体进行免疫细胞化学：波形蛋白 (1:500, Sigma, St. Louis, Mo.)、结蛋白 (1:150; Sigma – 对抗兔产生的；或1:300; Chemicon, Temecula, Ca. – 对抗小鼠产生的)、α-平滑肌肌动蛋白 (SMA; 1:400; Sigma)、细胞角蛋白18 (CK18; 1:400; Sigma)、von Willebrand因子(vWF; 1:200; Sigma)、和CD34 (人CD34 III类; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, Ca.)。此外，对传代11脐带-来源的细胞测试了下列标记：抗人GRO α - PE (1:100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)、抗人GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Ca.)、抗人氧化的LDL受体1 (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech)和抗人NOGA-A (1:100; Santa Cruz, Biotech)。
将培养物用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，并将其暴露于含PBS、4% (v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, Ca.)和0.3% (v/v) Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, Mo.)的蛋白质封闭溶液中进行30分钟以接近细胞内抗原。在目标表位被定位于细胞表面(CD34、ox-LDL R1)的情况中，在程序的所有步骤中省略Triton X-100以防止表位损失。此外，在第一抗体对抗山羊产生(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况中，在整个方法过程中使用3% (v/v)驴血清代替山羊血清。然后将在封闭溶液中稀释的第一抗体应用到培养物中，在室温进行1小时时间段。除去第一抗体溶液，并在应用含有连同山羊抗-小鼠IgG – Texas Red (1:250，Molecular Probes，Eugene，Or.) 和/或山羊抗-兔IgG - Alexa 488 (1:250，Molecular Probes)或驴抗-山羊IgG – FITC (1:150; Santa Cruz Biotech)一起的封闭的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。然后洗涤培养物，并应用10微摩尔DAPI (Molecular Probes)进行10分钟以使细胞核可见。
在免疫染色后，使用适当的荧光滤光片在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus, Melville, N.Y.)上显现荧光。在所有的情况中，阳性染色代表高于对照染色的荧光信号，在对照染色中遵循上面概述的整个程序，除了应用第一抗体溶液外(1° 号对照)。代表性图像是使用数字彩色摄影机和ImagePro软件(Media Cybernetics, Carlsbad, Ca.)捕获的。对三重染色的样品而言，每一张图像均是使用一次仅一个发射滤光片采集的。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, Ca.)制备分层的蒙太奇。
将瓶中的贴壁细胞在磷酸缓冲盐水(PBS) (Gibco, Carlsbad, Ca.)中洗涤，并用胰蛋白酶/ EDTA (Gibco, Carlsbad, Ca.)进行脱离。将细胞收集、离心并以1×107每毫升的细胞浓度重悬浮于PBS中的3% (v/v) FBS中。将一百微升等分试样递送至锥形管中。将针对细胞内抗原染色的细胞用Perm/Wash缓冲液(BD Pharmingen, San Diego, Ca.)进行透化。按照制造商的说明书将抗体加入到等分试样中，并将所述细胞在暗处、在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去过量的抗体。将需要第二抗体的细胞重悬浮于100微升3% PBS中。按照制造商的说明书加入第二抗体并将所述细胞在暗处、在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去过量的第二抗体。将洗涤过的细胞重悬浮于0.5毫升PBS中，并通过流式细胞术进行分析。使用了下列抗体：氧化的LDL受体1 (sc-5813; Santa Cruz, Biotech)、GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, Ma.)、小鼠IgG1 κ, (P-4685和M-5284; Sigma)、以及驴抗山羊IgG (sc-3743; Santa Cruz, Biotech.)。流式细胞术分析采用FACScalibur (Becton Dickinson San Jose, Ca.)进行。
在来源于人脐带、成体和新生儿成纤维细胞和间充质干细胞(MSCs)的细胞的cDNA上实施的针对选择的"特征"基因的实时 PCR结果表明浆膜蛋白和氧化的LDL受体表达在脐-来源的细胞中较其它细胞高。将从实时PCR获得的数据通过ΔΔCT方法进行分析并以对数标度表达。产后细胞和对照之间未发现CXC配体3和GCP-2表达水平的显著差异。通过常规PCR证实了实时PCR的结果。PCR产物的测序进一步验证了这些观察。使用表11-1中所列的常规PCR CXC配体3引物在产后细胞和对照之间未发现CXC配体3表达水平的显著差异。
脐带来源的细胞中细胞因子，IL-8的表达在生长培养基培养的和血清饥饿的脐带来源的细胞中均提高。采用常规PCR并通过测序PCR产物验证了所有的实时PCR数据。
于无血清培养基中生长之后，检查条件培养基中IL-8的存在。在脐细胞已在其中生长的培养基中检测到了IL-8的最大量(表11-2)。在人皮肤成纤维细胞已在其中生长的培养基中未检测到IL-8。
表11-2: 通过ELISA测量的IL-8蛋白表达
将来源于人脐带的传代0细胞通过免疫细胞化学分析探测所选择的蛋白质的产生。在分离后立即(传代0)将细胞用4%低聚甲醛固定并将其暴露于针对六种蛋白质的抗体：von Willebrand因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐带来源的细胞对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白是阳性的，具有直达传代11一致的染色模式。
通过免疫细胞化学研究GROα、GCP-2、氧化的LDL受体 1和浆膜蛋白(NOGO-A)在脐带-来源的传代11细胞中的的产生。脐带-来源的细胞是GCP-2阳性的，但GRO α产生通过该方法未检测到。另外，细胞是NOGO-A阳性的。
已经对四个基因确立了通过微阵列和PCR(实时和常规两种)测量的基因表达水平之间的一致性：氧化的LDL受体1、肾素、浆膜蛋白和IL-8。这些基因的表达在脐带-来源的细胞中在mRNA水平是差异地调节的，IL-8在蛋白质水平也差异地调节。GCP-2和CXC 配体3的差异表达未在mRNA水平证实。虽然该结果不支持从微阵列实验原始获得的数据，但这可能是归因于方法学灵敏度方面的差异。
对来源于人脐带的传代0细胞探测α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达，且它对两者均是阳性的。该染色模式保持直达传代11。
结论是，全部mRNA数据至少部分地证实得自微阵列实验的数据。
实施例12
细胞表型的免疫组织化学表征
通过免疫组织化学分析在人脐带中发现的细胞的表型。
收获人脐带组织并于4℃在4% (w/v)低聚甲醛中浸没固定过夜。使用针对下列表位的抗体(参见表12-1)实施免疫组织化学：波形蛋白(1 :500; Sigma, St. Louis, Mo.)，结蛋白(1 : 150，针对兔产生；Sigma；或1 :300，针对小鼠产生；Chemicon, Temecula, Ca.)，α-平滑肌肌动蛋白(SMA; 1 :400; Sigma)，细胞角蛋白18 (CK18; 1:400; Sigma)、von Willebrand因子(vWF; 1:200; Sigma)和CD34 (人CD34 III类; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, Ca.)。此外，测试了下列标记：抗人GROα-PE (1 :100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N. J.)，抗人GCP-2 (1 :100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Ca.)，抗人氧化的LDL受体 1 (ox-LDL R1; 1 : 100; Santa Cruz Biotech)和抗人NOGO-A (1 : 100; Santa Cruz Biotech)。用手术刀修剪固定的样品并在含乙醇的干冰浴上置于OCT包埋化合物(Tissue- Tek OCT; Sakura, Torrance, Ca.)中。然后使用标准恒冷切片机(Leica Microsystems)对冷冻块切片(10 微米厚)并封固在载玻片上用于染色。
与在前研究类似地实施免疫组织化学(例如，Messina,等人, Exper. Neurol, 2003; 184: 816-829)。将组织切片用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤并暴露于含PBS、4% (v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, Ca.)和0.3% (v/v) Triton (Triton X-100; Sigma)的蛋白质封闭溶液1小时以接近细胞内抗原。在目标表位被定位于细胞表面(CD34、ox-LDL R1)的情况中，在程序的所有步骤中省略triton以防止表位丢失。此外，在第一抗体对抗山羊产生(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况中，在整个程序过程中使用3% (v/v)驴血清代替山羊血清。然后将在封闭溶液中稀释的第一抗体应用到切片中，在室温进行4小时时间段。除去第一抗体溶液，并在应用含有连同山羊抗-小鼠IgG – Texas Red (1:250，Molecular Probes，Eugene，Or.) 和/或山羊抗-兔IgG - Alexa 488 (1:250，Molecular Probes)或驴抗-山羊IgG – FITC (1:150; Santa Cruz Biotech)一起的封闭的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。洗涤培养物，并应用10微摩尔DAPI (Molecular Probes)进行10分钟以使细胞核可见。
在免疫染色后，使用适当的荧光滤光片在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus, Melville, N.Y.)上显现荧光。阳性染色由高于对照染色的荧光信号代表。代表性图像是使用数字彩色摄影机和ImagePro软件(Media Cybernetics, Carlsbad, Ca.)捕获的。对三重染色的样品而言，每一张图像均是使用一次仅一个发射滤光片采集的。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, Ca.)制备分层的蒙太奇。
表12-1： 使用的第一抗体的概述
波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标记在脐带中发现的细胞亚群中表达(数据未显示)。具体地，vWF和CD34表达限制于脐带中包含的血管。CD34+细胞在最内层(腔侧)。波形蛋白表达在整个基质和脐带血管中发现。SMA限制于基质和动脉及静脉的外壁，但不包含在血管本身中。CK18和结蛋白仅在血管中观察到，结蛋白限制于中层和外层。
这些标记都没有在脐带中观察到(数据未显示)。
波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18, von Willebrand 因子和CD 34在人脐带内的细胞中表达。基于显示仅表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的体外表征研究，数据提示目前的脐带-来源的细胞分离方法收获细胞亚群或分离的细胞改变标记的表达以表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。
实施例13
由细胞分泌营养因子
测量选择的营养因子从脐-来源的细胞的分泌。选择具有血管生成活性的因子诸如肝细胞生长因子(HGF) (Rosen 等人, Ciba Found. Symp., 1997; 212:215-26)、单核细胞趋化蛋白质 1 (MCP-1) (Salcedo等人, Blood, 2000; 96;34-40)、白细胞介素-8 QL-S) ( Li等人,, J. Immunol., 2003; 170:3369-76)、角质形成细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF) (Hughes等人, Ann. Thorac. Surg., 2004; 77:812-8)、组织基质金属蛋白酶抑制剂1 (TIMP1)、促血管生成素(angiopoietin) 2 (ANG2)、血小板衍生生长因子(PDGFbb)、血小板生成素(TPO)、肝素结合表皮生长因子(HB- EGF)、基质衍生因子1 α (SDF-1α))、神经营养/神经保护活性 (脑衍生神经营养因子(BDNF) (Cheng 等人, Dev. Biol, 2003; 258;319-33)、白细胞介素-6 (IL-6)、粒细胞趋化蛋白-2 (GCP-2)、转化生长因子β2 (TGFβ2))或趋化因子活性(巨噬细胞炎性蛋白1 α (MIP1 α)、巨噬细胞炎性蛋白1 β (MlP1β)、单核细胞化学引诱物-1 (MCP-1)、Rantes (调节活化、正常T细胞表达和分泌)、I309、胸腺和活化-调节的趋化因子(TARC)、Eotaxin、巨噬细胞-来源的趋化因子 (MDC)和IL-8。
将来源于脐带的细胞以及来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞在明胶包被的T75瓶中培养于生长培养基中。在传代11将细胞冷藏并贮存在液氮中。解冻后将生长培养基加入细胞，然后转移到15毫升离心管并在150 x g离心细胞5分钟。将细胞沉淀重悬浮于4 毫升生长培养基中，并对细胞进行计数。将细胞以5,000 细胞/cm2 接种在各自包含15毫升生长培养基的T75瓶中并培养24小时。将培养基变成无血清培养基(低葡萄糖(Gibco)，0.1% (w/v)牛血清清蛋白(Sigma)，青霉素(50 单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升, Gibco))，进行8小时。在温育结束时通过在14,000 x g离心5分钟收集条件无血清培养基并贮存在-20℃。
为了估计每一瓶中的细胞数目，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞并使用2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco)脱离。通过加入8毫升生长培养基抑制胰蛋白酶活性。在150 x g对细胞离心5分钟。除去上清液，并将细胞重悬浮于1毫升生长培养基中。用血细胞计数器估计细胞数目。
使细胞在37℃在5%二氧化碳和大气氧下生长。通过ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Mn.)确定每一细胞样品产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。根据制造商的说明书实施所有测定。呈现的值是皮克每毫升每百万细胞(n=2, sem)。
使用 Searchlight Proteome Array (Pierce Biotechnology Inc.)测量趋化因子(MIP1α、MIP1β、MCP-1、Rantes、I309、TARC、Eotaxin、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGFbb、TPO、HB-EGF。Proteome Arrays是用于定量测量2至16种蛋白质每孔的多重夹心ELISAs。该阵列通过将2 x 2、3 x 3或4 x 4模式的4至16种不同俘获抗体点到96孔板的每一孔产生。夹心ELISA程序之后，对整个板成像以俘获在板的每一孔中的每一点生成的化学发光信号。在每一点生成的信号与原始标准或样品中的靶蛋白质的量成比例。
MCP-1和IL-6由脐-来源的细胞和皮肤成纤维细胞分泌(表13-1)。SDF-1α和GCP-2由成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8 由脐-来源的细胞分泌。TGF-β2未通过ELISA从任一细胞类型检测到。
表13-1. ELISA结果：营养因子的检测
SearchLight Multiplexed ELISA测定。TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1β、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8从脐-来源的PPDCs分泌(表13-2和13-3)。没有检测到Ang2、VEGF或PDGFbb。
表13-2. SearchLight Multiplexed ELISA测定结果
关键字：hFB (人成纤维细胞), U1 (脐-来源的PPDC (022803))，U3 (脐-来源的PPDC (071003))。ND：未检测到。
表13-3. SearchLight Multiplexed ELISA测定结果
关键字：hFB (人成纤维细胞)，U1(脐-来源的PPDC (022803))，U3 (脐 -来源的PPDC (071003))。ND：未检测到。
脐-来源的细胞分泌许多营养因子。这些营养因子中的一些，诸如HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在血管发生中起重要作用。其它营养因子诸如BDNF和IL-6在神经再生或保护中具有重要作用。
实施例14
体外免疫学
在体外评价脐带细胞系的免疫学特征以预测这些细胞将在体内移植时引起的免疫学应答，如果有的话。通过流式细胞术对脐带细胞系测定HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达。这些蛋白质是由抗原呈递细胞(APC)表达的，并是幼稚 CD4+ T细胞的直接刺激所要求的(Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171)。也通过流式细胞术分析了该细胞系的HLA-G (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171)、CD178 (Coumans等人, Journal of Immunology Methods, 1999; 224, 185-196)和PD-L2 (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171; Brown等人, The Journal of Immunology, 2003; 170, 1257-1266)的表达。由残留于胎盘组织中的细胞进行的这些蛋白质的表达被认为在子宫内介导胎盘组织的免疫特权状态(immuno-privileged status)。为了预测产后脐-来源的细胞系在体内引起免疫应答的程度，在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中测试了该细胞系。
在包被有2%明胶(Sigma, St. Louis, Mo.)的T75瓶(Corning, Corning, N.Y.)中，将细胞在生长培养基(DMEM-低葡萄糖 (Gibco, Carlsbad, Ca.)，15% (v/v) 胎牛血清 (FBS)；(Hyclone, Logan, Ut.)，0.001% (v/v) β巯基乙醇 (Sigma, St. Louis, Mo.)，50 单位/毫升青霉素，50 微克/毫升链霉素 (Gibco, Carlsbad, Ca.)中培养直至汇合。
将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Gibco, Carlsbad, Ca.)中洗涤，并用胰蛋白酶/EDTA (Gibco, Carlsbad, Ca.)进行脱离。将细胞收获、离心并以1×107每毫升的细胞浓度重悬浮于PBS中的3% (v/v) FBS中。按照制造商的说明书，将抗体(表14-1)加入到一百微升的细胞悬浮液中并将其在暗处、在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去未结合的抗体。将细胞重悬浮于五百微升PBS中，并通过流式细胞术使用FACS calibur仪器(Becton Dickinson, San Jose, Ca.)进行分析。
表14-1. 抗体
将标记为细胞系A的传代10脐带-来源的细胞的冷藏小瓶包裹(paclaged)在干冰上并送至CTBR (Senneville, Quebec)以使用CTBR SOP号CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多名男性和女性志愿者供体收集外周血单核细胞(PBMCs)。将刺激物(供体)同种异体 PBMC、自体PBMC和脐带组织-来源的细胞系用丝裂霉素C处理。将自体的和丝裂霉素C处理过的刺激物细胞加入到反应者(受者) PBMCs中并培养4天。温育后，向每一样品中加入[3H]胸苷并培养18小时。收获细胞后，提取放射性标记的DNA，并使用闪烁计数器测量[3H]-胸苷的掺入。
同种异体供体的刺激指数(SIAD)是这样计算的：接受者(receiver)加丝裂霉素C处理的同种异体供体的平均增殖除以接受者的基线增殖。脐带-来源的细胞的刺激指数是这样计算的：接受者加丝裂霉素C处理的脐带组织-来源的细胞系的平均增殖除以接受者的基线增殖。
筛选了六例人志愿者血液供体以鉴定将在与其它五例血液供体的混合淋巴细胞反应中显示稳健的增殖反应的单个同种异体供体。选择该供体作为同种异体阳性对照供体。选择剩余的五例血液供体作为受者。该同种异体阳性对照供体和脐带-来源的细胞系是用丝裂霉素C处理过的，并在混合淋巴细胞反应中与所述五例个体同种异体接受者一起培养。使用两个细胞培养板(每个板具有三例接受者)一式三份进行反应(表14-2)。平均刺激指数的范围为6.5(板1)至9(板2)，且同种异体供体阳性对照的范围为42.75 (板1)至70 (板2) (表14-3)。
表14-2：混合淋巴细胞反应数据-细胞系A (脐带)
用于增殖测定的DPM
板ID：板1
板ID：板2
表14-3. 脐带-来源的细胞和同种异体供体在与五个个体同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中的平均刺激指数。
通过流式细胞术分析的脐带-来源的细胞的直方图显示HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光值所记录的，从而表明脐带-来源的细胞系缺乏直接刺激同种异体PBMCs（例如，CD4+ T细胞）所需的细胞表面分子。
通过流式细胞术分析的脐带-来源的细胞的直方图显示PD-L2的阳性表达，如通过相对于IgG对照增加的荧光值所记录的，并显示CD 178和HLA-G的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光值所记录的。
在采用脐带-来源的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中，平均刺激指数的范围是6.5至9，且同种异体阳性对照的平均刺激指数的范围是42.75至70。脐带-来源的细胞系对刺激蛋白HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达是阴性的，如通过流式细胞术所测量的。脐带-来源的细胞系对免疫调节蛋白HLA-G和CD 178的表达是阴性的，并且对PD-L2的表达是阳性的，如通过流式细胞术所测量的。同种异体供体PBMCs包含表达HLA-DP、DR、DQ、CD80、CD86和B7-H2的抗原呈递细胞，从而允许对同种异体PBMCs（例如，幼稚CD4+ T细胞）的刺激。脐带-来源的细胞上抗原呈递细胞表面分子的缺失要求同种异体PBMCs（例如，幼稚CD4+ T细胞）的直接刺激，且免疫调节蛋白PD-L2的存在可解释与同种异体对照相比在MLR中由这些细胞表现的低刺激指数。
实施例15
端粒酶的功能是合成用于保护染色体完整性和用于延长细胞的复制寿命的端粒重复序列(Liu, K等人, PNAS,1999: 96:5147-5152)。端粒酶由两个组分组成，端粒酶RNA模板(hTERT)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。端粒酶的调节通过hTERT的转录而不是hTERT确定。因而用于hTERT mRNA的实时聚合酶链反应(PCR)是用于确定细胞的端粒酶活性的可接受方法。
细胞分离
实施实时PCR实验以测定人脐带组织来源的细胞的端粒酶产生。人脐带组织来源的细胞依照实施例4-14和美国申请系列号10/877,012 ('012申请)中列出的实施例制备。通常，得自 National Disease Research Interchange (Philadelphia, Pa.)的脐带在正常递送后被洗涤以除去血和碎片并被机械解离。然后将组织与包括胶原酶、分散酶和透明质酸酶的消化酶在培养基中于37℃温育。根据'012申请的实施例中列出的方法培养人脐带组织来源的细胞。间充质干细胞和正常皮肤成纤维细胞(cc-2509 lot # 9F0844)得自Cambrex, Walkersville, Md.。多潜能人睾丸胚胎性癌(畸胎瘤)细胞系nTera-2 细胞 (NTERA- 2 cl.Dl) (参见 Plaia 等人, Stem Cells, 2006; 24(3):531-546)购自ATCC (Manassas, Va.)并根据'012申请列出的方法培养。
总RNA分离
使用RNeasy?试剂盒(Qiagen, Valencia, Ca.)从细胞提取RNA。用50微升DEPC-处理过的水洗脱RNA并将其贮存在-80℃。使用含TaqMan?逆转录试剂(Applied Biosystems, Foster City, Ca.)的随机六聚体将RNA逆转录，在25℃进行10分钟、在 37℃进行60分钟，以及在95℃进行10分钟。将样品贮存在-20℃。
实时PCR
根据制造商的说明书(Applied Biosystems)，使用Applied Biosystems Assays-On-Demand? (也称为 TaqMan? Gene Expression Assays)对cDNA 样品实施PCR。该商业试剂盒广泛用于测定人细胞中的端粒酶。简言之，使用带有ABI prism 7000 SDS软件的7000序列检测系统(Applied Biosystems)，将hTERT(人端粒酶基因) (HsOO 162669)和人GAPDH (内部对照)与cDNA和TaqMan? Universal PCR主混合物（master mix）混合。热循环条件为最初在50℃进行2分钟和在95℃进行10分钟，然后是在95℃进行15秒和在60℃进行1分钟的40个循环。根据制造商的说明书分析PCR数据。
对人脐带组织来源的细胞 (ATCC 登记号PTA-6067)、成纤维细胞和间充质干细胞测定hTERT和18S RNA。如表15-1所示，在人脐带组织-来源的细胞中未检测到hTERT以及从而未检测到端粒酶。
表15-1
ND- 未检测到；+ 检测到信号
测定人脐带组织来源的细胞(分离物022803，ATCC登录号PTA-6067)和nTera-2 细胞，且结果显示在两批人脐带组织来源的细胞中没有端粒酶表达，而畸胎瘤细胞系揭示高水平的表达(表15-2)。
表15-2
因此，可以断定人脐组织-来源的细胞不表达端粒酶。
机译： 脐带组织来源的细胞用于治疗神经性疼痛和痉挛
机译： 脐带组织来源的细胞用于治疗神经性疼痛和痉挛
机译： 源自脐带组织的细胞，用于治疗神经性疼痛和痉挛
