麻疯树毒蛋白基因、组织特异性启动子和毒蛋白缺陷型转基因麻疯树属植物的生产

摘要

本发明涉及麻疯树毒蛋白基因(Jatropha curcas curcin genes)和组织特异性启动子的分离，以及毒蛋白缺陷型麻疯树属植物的生产。更具体地，本发明涉及麻疯树毒蛋白1、毒蛋白2和毒蛋白2A的分离。本发明进一步涉及毒蛋白1、毒蛋白2A和毒蛋白2基因，更具体地涉及毒蛋白1和毒蛋白2A基因的组织特异性启动子。本发明进一步涉及通过使用RNAi技术抑制毒蛋白基因表达来生产毒蛋白缺陷型转基因麻疯树属植物。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月5日提交的美国临时专利申请61/184,416号的 优先权，在此通过引用将其并入本申请。

背景技术

本发明涉及麻疯树毒蛋白基因(Jatropha curcas curcin gene)和组织特异 性启动子的分离，以及毒蛋白缺陷型麻疯树属植物的生产。更具体地，本 发明涉及麻疯树毒蛋白1、毒蛋白2和毒蛋白2A的分离。本发明进一步涉 及毒蛋白1、毒蛋白2A和毒蛋白2基因，更具体地涉及毒蛋白1和毒蛋白 2A基因的组织特异性启动子。本发明进一步涉及通过使用RNAi技术抑制 毒蛋白基因表达来生产毒蛋白缺陷型转基因麻疯树属植物。

本文所用的出版物和其它材料是用于说明本发明的背景，或提供与实 践有关的额外细节，它们在此援引加入且分别列在参考书目中供参考。

植物生物技术十分需要组织特异性启动子，以在合适时间在特定植物 组织中表达感兴趣基因(Mansoor et al.，2006)。植物种子胚乳积累诸如淀粉、 蛋白和脂类等储存物质(Berger et al.，2006；Hannah and James，2008)。胚乳特 异性启动子已被用于驱动参与这些存储物质生物合成途径的基因的表达 (Roesler et al.，1997；Plant et al.，1994；Kuwano et al.，2009)。杀虫毒素，如苏 云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis(Bt))δ-内毒素已被用于控制昆虫 (Christou et al.，2006；Roh et al.，2007)。虽然Bt毒素作为杀虫毒素具有高特 异性且对环境安全，但仍希望使Bt毒素在叶组织而非在种子和果实中特异 地表达(Datta et al.，1998)。因此，越来越需要特异性启动子来控制感兴趣基 因在特定发育时期在特定组织中的表达。此外，多基因转化系统被用于递 送在一个表达载体中同时构建的若干基因(Lin et al.，2003；Chen et al.，2006； Wakasa et al.，2006)。为避免基因沉默，这些多重基因中的每种均需要不同 的启动子来驱动。然而，缺乏适合的启动子是这类研究的重要限制因素(Qu et al.，2008)。

麻疯树属(Jatropha)(麻疯树(Jatropha curcas))属于大戟科(Euphorbiaceae) 的小型热带木本植物。麻疯树为双子叶植物，其种子包含高达40％的油 (Bringi，1987)。来自麻疯树的油可作为化石燃料的有效替代物(Augustus et  al.，2002；Azam et al.，2005；Forson et al.，2004；Pramanik，2003)。然而，麻风 树具有几个缺点，这限制了其广泛的应用。此植物的产量受到不利的雄花 与雌花比的限制，并且其含油量尚未通过育种进行优化。该植物对生物胁 迫如病毒(Narayanna et al.，2007)、真菌和细菌病原体，和非生物胁迫特别是 寒冷和干旱也很敏感(http://www.jatropha.org)。在植物的种子和叶中若干毒 性组分(例如蛋白毒素、毒蛋白和致癌剂佛波酯)的存在给麻风树产业的农民 和生物加工工人带来健康危害。

毒蛋白是在麻疯树种子中鉴定的毒素蛋白(Stirpe et al.1976)。麻疯树种 子中毒蛋白以及其它毒素的存在阻碍了将麻疯树种子粉作为动物饲料的应 用(Makkar et al.，1997)。毒蛋白属于I类核糖体失活蛋白(RIP)，其具有RNA N-糖苷酶活性且能够不可逆地灭活核糖体(Barbieri，1993，Lin et al.，2003a)。 目前，五个毒蛋白已经保藏在GenBank中，它们的登录号为AAL58089(Lin et al.，2003a)、AAL86778(Lin et al.，2003b)、ABZ04128、AAR08395和 ABW17545。根据长度和它们的氨基酸残基，这些毒蛋白可被分为两类。1 类毒蛋白的前体由293个氨基酸残基组成，而2类毒蛋白的前体包含309 个氨基酸残基。Lin et al.(2003a)从麻疯树种子中鉴定了1类毒蛋白，其编 码具有42个氨基酸信号肽的32-kDa的毒蛋白前体。Wei et al.(2005)克隆了 2类毒蛋白基因。发现被命名为毒蛋白2的毒蛋白基因被胁迫诱导。此类中 的毒蛋白成员在氨基酸上显示出93％至98％的相同性，而两种不同类之间 的成员显示出87％的氨基酸相同性。

改进麻疯树农艺学和质量性状的重要策略是遗传修饰。可产生表达同 源和异源基因序列的麻疯树植物。在许多情况中，期望一个或多个确定功 能的同源基因的过量表达或通过RNA干扰(RNAi)沉默。麻疯树属的基因序 列可从cDNA和基因组文库中获得，且这些基因的功能可通过与已知功能 的其它植物基因的序列同源性来暂定。通常利用组织特异性启动子在所希 望的组织中表达同源或异源基因序列。

RNAi是一种转录后靶基因沉默技术，其使用双链RNA(dsRNA)来引起 包含与dsRNA相同序列的信使RNA(mRNA)的降解(Constans，2002)。小干 扰RNA或siRNA在至少两步中产生：内源性核糖核酸酶将较长的dsRNA 切割为较短的dsRNA，即21-23个核苷酸长度的RNA。随后，siRNA片段 介导靶mRNA的降解(Zamore，2001)。RNAi以类似于反义寡核苷酸的方式 被用于基因功能的确定(Constans，2002)。已对在瞬时和稳定转染的细胞中连 续表达siRNA的表达载体进行工程化以表达小发夹RNA(shRNA)，其在体 内被加工为能进行基因特异性沉默的siRNA样分子(Brummelkamp et al.， 2002；Paddison et al.，2002)。通过双链RNA进行的转录后基因沉默的更多细 节参见Hutvágner and Zamore，2002；Vaucheret et al.，2001；Hammond et al.， 2001；Maine，2000；Fire et al.，1998；和Timmons and Fire，1998。使用RNAi 抑制基因表达的方法是本领域技术人员已知的。参见例如美国专利 5,034,323号；6,326,527号；6,452,067号；6,573,099号；6,753，139号；和 6,777,588号。也参见国际专利公布WO 97/01952、WO 98/36083、WO 98/53083、WO 99/32619和WO 01/75164；和美国专利公布2003/0175965、 2003/0175783、2003/0180945、2004/0214330、2005/0244858、2005/0277610、 2007/0265220和2010/0058498。

因此，希望分离这样的组织特异性启动子，其用于控制感兴趣基因在 麻疯树、其它麻疯树属物种以及其它植物物种中在特定发育时期在特定组 织中的表达，以用于如这类植物的基因工程化。也希望这样的分离的启动 子，其可用在麻疯树、其它麻疯树属物种以及其它植物物种的基因工程化 中。也希望生产对人和动物无毒的毒蛋白缺陷型麻疯树属植物。

发明内容

本发明涉及麻疯树毒蛋白基因和组织特异性启动子的分离，以及毒蛋 白缺陷型麻疯树属植物的生产。更具体地，本发明涉及麻疯树毒蛋白1、毒 蛋白2和毒蛋白2A的分离。本发明进一步涉及毒蛋白1、毒蛋白2A和毒 蛋白2基因，更具体地涉及毒蛋白1和毒蛋白2A基因的组织特异性启动子。 本发明进一步涉及通过使用RNAi技术抑制毒蛋白基因表达来生产毒蛋白 缺陷型转基因麻疯树属植物。

因此，第一方面，本发明提供了三种麻疯树毒蛋白基因的序列。在一 个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白1。毒蛋白1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。毒蛋白1的编码序列包含SEQ ID NO：1中474-1355位的核 苷酸。毒蛋白1的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

在第二个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白2。毒蛋白2的核苷酸 序列如SEQ ID NO：3所示。毒蛋白1的编码序列包括SEQ ID NO：3中 439-1368位的核苷酸。毒蛋白2的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。

在第三个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白2A。毒蛋白2A的核 苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。毒蛋白2A的编码序列包括SEQ ID NO：5 中475-1404位的核苷酸。毒蛋白2A的蛋白序列如SEQ ID NO：6所示。

第二方面，本发明提供了两种麻疯树毒蛋白基因的组织特异性启动子 和第三种麻疯树毒蛋白基因的启动子。在一个实施方式中，所述启动子源 自毒蛋白1基因。毒蛋白1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所述。毒 蛋白1启动子为胚乳特异性启动子。此序列的片段也有组织特异性启动子， 即胚乳特异性启动子的活性。这类片段包括以下：(a)SEQ ID NO：7中1-2888 位的核苷酸、(b)SEQ ID NO：7中1142-3181位的核苷酸、(c)SEQ ID NO：7， 其中2944-3170位的核苷酸被缺失、(d)SEQ ID NO：7中1142-3181位的核 苷酸，其中2944-3170位的核苷酸被缺失、和(e)SEQ ID NO：7中2688-3181 位的核苷酸，其中2944-3170位的核苷酸被缺失。

在第二个实施方式中，所述启动子源自毒蛋白2A基因。毒蛋白2A启 动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所述。毒蛋白2A启动子为叶特异性启动 子。此序列的片段也有组织特异性启动子的活性。然而，当将一些序列缺 失时，特异性由叶特异的变为非组织特异的。具有非组织特异性启动子的 活性的此类片段包括以下：(a)SEQ ID NO：8中912-2087位的核苷酸、(b) SEQ ID NO：8中1-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺失、 (c)SEQ ID NO：8中912-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺 失、和(d)SEQ ID NO：8中1751-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核 苷酸被缺失。

在第三个实施方式中，所述启动子源自毒蛋白2基因。毒蛋白2启动 子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。如本文所述，此启动子在胚乳或叶 组织中不表达，但可通过昆虫袭击时茉莉酸(JA)的活化和/或防御反应或叶 老化期间乙烯的活化来活化和表达。

第三方面，本发明提供了毒蛋白缺陷型转基因麻疯树属植物和毒蛋白 缺陷型转基因麻疯树属植物生产。在一个实施方式中，毒蛋白缺陷型转基 因植物包括稳定整合入其基因组中的核酸，其中所述核酸编码靶向毒蛋白 基因的双链RNA(dsRNA)。在另一个实施方式中，毒蛋白缺陷型转基因植 物包括稳定整合入其基因组中的核酸，其中所述核酸编码靶向毒蛋白基因 的短干扰RNA(siRNA)。在另一个实施方式中，毒蛋白缺陷型转基因植物 包括稳定整合入其基因组中的核酸，其中所述核酸编码靶向毒蛋白基因的 短发夹RNA(shRNA)。在一个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白1。 在另一个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白2。在又一个实施方式中， 所述毒蛋白基因为毒蛋白2A。在一个实施方式中，所述核酸包括所述毒蛋 白1基因的一部分。在另一个实施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白2基 因的一部分。在又一个实施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白2A基因的一 部分。在一个实施方式中，所述毒蛋白缺陷型转基因植物通过转化麻疯树 属植物组织生产。在另一个实施方式中，所述转化为农杆菌(Agrobacterium) 介导的转化。

附图说明

图1：包含毒蛋白基因的BAC克隆的分离以及毒蛋白基因的分离。将 7个包含毒蛋白基因的BAC克隆用HindIII(左面)消化，且其DNA印迹用 包含毒蛋白1编码区的探针杂交(右面)。标准DNA标记(New England  Biolabs，#N3012L)的分子量以千碱基(Kb)表示。M表示分子量标记。

图2：毒蛋白1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和其推导的氨基酸序 列(SEQ ID NO：2)。毒蛋白1的转录起始位点如核苷酸序列的1位所示。5’ 非翻译区(5’UTR)中内含子的核苷酸序列用小写字母显示。寡聚引物的位置 用粗斜体突出显示，箭头表示正向或反向。编码区中的两个Sau3AI位点用 粗体加下划线表示。第二个多腺苷酸信号序列仅用粗体突出显示。

图3：毒蛋白2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和其推导的氨基酸序 列(SEQ ID NO：4)。毒蛋白2的推定的转录起始位点如核苷酸序列的1位所 示。5’非翻译区(5’UTR)中内含子的推定的核苷酸序列用小写字母显示。寡 聚引物的位置用粗斜体突出显示，箭头表示正向或反向。编码区中的两个 Sau3AI位点用粗体加下划线显示。第二个多腺苷酸信号序列仅用粗体突出 显示。毒蛋白2的注释基于毒蛋白1的注释来预测。

图4：毒蛋白2A基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和其推导的氨基酸序 列(SEQ ID NO：6)。毒蛋白2A的推定的转录起始位点如核苷酸序列的1位 所示。5’非翻译区(5’UTR)中内含子的核苷酸序列用小写字母显示。寡聚引 物的位置用粗斜体突出显示，箭头表示正向或反向。编码区中的Sau3AI位 点用粗体加下划线显示。第二个多腺苷酸信号序列仅用粗体突出显示。

图5：通过酶切扩增多态性序列(CAPS)分析来检测毒蛋白基因的多态 性。将引物CF2和CR2扩增的来自BAC克隆121E10(B泳道)或基因组DNA (G泳道)的PCR片段用Sau3AI消化。毒蛋白1产生3条带(195bp、243bp 和582bp)，毒蛋白2也产生3条带(195bp、243bp和580bp)，然而毒蛋白 2A产生2条带(243bp和775bp)。BAC克隆121E10仅包含毒蛋白1和毒蛋 白2，因此，消化的PCR产物(B泳道)具有3条带(195-bp带、243-bp带以 及无法在1.2％琼脂糖凝胶中分离的580-bp带和582-bp带)。基因组DNA 包含全部3种毒蛋白基因。基因组DNA的消化的PCR产物(G泳道)具有B 泳道所示的全部带和775bp大小的另一条带。M，100-bp DNA梯带(New  England Biolabs，#N3231L)以碱基对表示。

图6：从麻疯树鉴定出的毒蛋白的比对。显示8种毒蛋白基因相同性的 氨基酸残基用黑色背景显示。镖状箭头表示N末端信号肽的切割位点(Lin et al.，2003a)。氨基酸序列标识符如下所示：毒蛋白2A-SEQ ID NO：6； ABZ04128-SEQ ID NO：10；AAR08395-SEQ ID NO：11；ABW17545-SEQ ID NO：12；毒蛋白1-SEQ ID NO：2；AAL58089-SEQ ID NO：13；毒蛋白 2-SEQ ID NO：4；和AAL86778-SEQ ID NO：14。

图7：从麻疯树鉴定出的毒蛋白的系统树。系统树由未命名的ClustalW 创建。

图8A-8C：麻疯树中毒蛋白基因的表达。图8A：通过RT-PCR检测麻 疯树中毒蛋白1和毒蛋白2A基因的表达。毒蛋白1的引物为CF和C1SR(表 1)，毒蛋白2A的引物为CF和C2ASR(表1)。L，来自叶的RNA样品；E， 来自胚乳的RNA样品。图8B：毒蛋白1在不同发育时期胚乳中的表达。 转录物水平通过实时PCR测定，且扩增序列的相同性通过测序确认。麻疯 树属肌动蛋白基因用作内部对照，显示出标准化为6周龄种子(6wk)的相对 值。毒蛋白1的引物为C1SF和C1SR，麻疯树属肌动蛋白基因的引物为Jc actin F2和Jc actin R1(表1)。图8C：毒蛋白2在叶中的表达。转录物水平 通过实时PCR测定，且扩增序列的相同性通过测序确认。麻疯树属肌动蛋 白基因用作内部对照，显示出标准化为新叶(YL)的相对值。毒蛋白2A的引 物为C2ASF和C1SR(表1)，麻疯树属肌动蛋白基因的引物为Jc actin F2和 Jc actin R1(表1)。YL，新叶；FL，完全展开的叶；OL，老叶；IL，粉蚧 (Pseudococcidae hirsutus)感染的完全展开的叶。

图9：麻疯树中毒蛋白的检测，显示出抗毒蛋白1N抗体探测的蛋白印 迹。在叶中检测出分子量大小为约34至约35kDa的带(可能为毒蛋白2A)。 在全部测试目录(accession)的种子中检测出分子量大小为约28kDa的另一 条带(可能为成熟毒蛋白1)。在叶、愈伤组织和种子中检测出分子量大小为 约39kDa的未知蛋白，但其在根中未检测出。类似地，在种子中检测出分 子量大小为约16kDa的未知蛋白。标准蛋白标记(Amersham Biosciences， RPN755)的分子量以千道尔顿(kDa)显示。L，叶；C，愈伤组织；R，根； S1，来自印尼目录(Indonesia accession)的种子；S2，来自印度目录(India  accession)的种子；S3，来自中国目录(China accession)的种子；S4，来自南 美目录(South America accession)的种子。

图10A-10D：毒蛋白1在发育种子胚乳细胞中的亚细胞免疫金定位。 图10A：6周龄种子的胚乳细胞。标尺＝5μm。图10B：免疫前血清对照 (Preimmune serum control)未显示出蛋白体的免疫标记。标尺＝0.2μm。图 10C：免疫定位至蛋白体的毒蛋白1。标尺＝0.2μm。图10D：用抗毒蛋白 1C抗体免疫标记后，胚乳细胞的油体和细胞壁。标尺＝0.5μm。箭头表示 具有白色淀粉体的质体。镖状箭头表示用抗毒蛋白1C抗体免疫标记的毒蛋 白。cw，细胞壁；ob，油体；pb，蛋白体。

图11A-11D：毒蛋白2A在叶肉细胞液泡内容物中的亚细胞免疫金定位。 图11A：用免疫前血清进行免疫标记后的叶肉细胞。标尺＝2μm。图11B： 免疫前血清对照未显示出液泡内容物的免疫标记(图11A中用框标出的高放 大率区域)。标尺＝0.2μm。图11C：用抗毒蛋白1C抗体免疫标记后的叶 肉细胞。标尺＝2μm。图11D：免疫定位至液泡内容物的毒蛋白2A(图11C 中用框标出的高放大率区域)。标尺＝0.2μm。镖状箭头表示用抗毒蛋白1C 抗体免疫标记的毒蛋白。C，叶绿体；cw，细胞壁；v，液泡。

图12A-12D：毒蛋白2A在叶管状分子次生细胞壁(secondary cell walls) 中的亚细胞免疫金定位。图12A：用抗毒蛋白1C抗体免疫标记后叶的切片。 两个相邻的管状分子，包括不成熟的管状分子(I)和成熟的管状分子(M)被叶 肉细胞围绕。标尺＝5μm。图12B：免疫前血清对照未显示出管状分子次 生细胞壁中的免疫标记。标尺＝0.2μm。图12C：免疫定位至不成熟管状 分子的次生细胞壁的毒蛋白2A(图12A左下侧用框标出的高放大率区域)。 标尺＝0.2μm。图12D：免疫定位至成熟管状分子的次生细胞壁的毒蛋白 2A(图12A右上侧用框标出的高放大率区域)。标尺＝0.2μm。箭头表示管 状分子壁上的坑区域。镖状箭头表示用抗毒蛋白1C抗体免疫标记的毒蛋 白。mc，叶肉细胞；pcw，初生细胞壁；scw，次生细胞壁；v，液泡。

图13A和13B：毒蛋白1和毒蛋白2A启动子的表征。图13A：在用空 载体pC1300(左面)、P_Ubi:GFP:T_Nos(中间)和P_C1P3:GFP:T_Nos(右面)基因轰击 后，GFP在麻疯树发育胚乳中的瞬时表达。GFP，荧光通道；Ph2，相差通 道；叠加，GFP和Ph2通道的叠加。标尺＝10μm。图13B：在用空载体 pC1300(左面)、P_35S:GUS:T_Nos(中间)和P_C2AP3:GUS:T_Nos(右面)基因轰击后， GUS活性在麻疯树叶组织中的瞬时表达。在用X-Gluc溶液染色后，显示 GUS活性的细胞为蓝色(用镖状箭头表示)。

图14：二元质粒pANDA35HKC1的T-DNA区域(未按比例绘制)。NPT II，新霉素磷酸转移酶基因；HPT，潮霉素磷酸转移酶基因；35S pro.，35S 启动子；毒蛋白1，毒蛋白1的部分序列；连接子，Gus连接子；T，胭脂 氨酸合酶基因的终止子；RB，右边界；LB，左边界。

图15：毒蛋白基因表达敲减的T₀转基因麻疯树植物。显示了二元载体 pANDA35HKC1转化的8月龄T₀转基因植物，所述二元载体 pANDA35HKC1携带设计用于毒蛋白基因的RNAi盒。

图16显示出转基因麻疯树植物的DNA印迹分析的结果。图16：转基 因麻疯树植物的DNA印迹分析。DNA印迹用Gus连接子(上面)或Hpt(下 面)探针探测。箭头表示当用限制性酶KpnI和SpeI消化转基因植物的基因 组DNA时，RNAi盒的位置。Gus连接子用的引物为Gus F和Gus R(表1)。 M，分子标记；Wt，野生型麻疯树植物；L3至L26，单独的T₀转基因麻疯 树植物。

图17A至17B：来自RNAi盒的双链RNA(dsRNA)和毒蛋白2A的表 达。图17A：毒蛋白1的dsRNA在新叶中的表达。毒蛋白1的dsRNA的 转录物水平通过用于Gus连接子的实时PCR测定，且扩增序列的相同性通 过测序确认。麻疯树属肌动蛋白基因用作内部对照，显示出标准化为转基 因系17(L17)的相对值。Gus连接子的引物为Gus RT F1和Gus RT R1，麻 疯树属肌动蛋白基因的引物为Jc actin F2和Jc actin R1(表1)。Wt，野生型 植物；L17至L46，单独的T₀植物。图17B：毒蛋白2A在新叶中的表达。 转录物水平通过实时PCR测定，且扩增序列的相同性通过测序确认。麻疯 树属肌动蛋白基因用作内部对照，显示出标准化为用空载体pC1300转化的 对照转基因植物的相对值。毒蛋白2A的引物为C2ASF和C2ASR(表1)， 麻疯树属肌动蛋白基因的引物为Jc actin F2和Jc actin R1(表1)。Wt，野生 型植物；L17至L46，单独的T₀植物。

图18显示出毒蛋白2A在转基因麻疯树属植物新叶中的表达。图18： 毒蛋白2A在转基因麻疯树属植物新叶中的表达。毒蛋白2A(用箭头标出) 用抗毒蛋白1抗体检测。Wt，野生型植物；L17至L46为单独的转基因植 物。

图19A-19D：转基因向T₁代的遗传。图19A和19B：在含10mg/L潮 霉素的半强度MS培养基上发芽和生长12天的野生型麻疯树幼苗的枝(A) 和根(B)。图19C和19D：在含10mg/L潮霉素的半强度MS培养基上发芽 和生长12天的转基因系L26的T₁幼苗的枝(C)和根(D)。

具体实施方式

本发明涉及麻疯树毒蛋白基因和组织特异性启动子的分离，以及毒蛋 白缺陷型麻疯树属植物的生产。更具体地，本发明涉及麻疯树毒蛋白1、毒 蛋白2和毒蛋白2A的分离。本发明进一步涉及毒蛋白1、毒蛋白2A和毒 蛋白2基因，更具体地涉及毒蛋白1和毒蛋白2A基因的组织特异性启动子。 本发明进一步涉及通过使用RNAi技术抑制毒蛋白基因表达来生产毒蛋白 缺陷型转基因麻疯树属植物。

因此，第一方面，本发明提供了三种麻疯树毒蛋白基因的序列。在一 个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白1。毒蛋白1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。毒蛋白1的编码序列包括SEQ ID NO：1中474-1355位的核 苷酸。毒蛋白1的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。如本文所示，毒蛋白1 在发育的种子的胚乳中特异地表达。毒蛋白1位于胚乳的蛋白体。

在第二个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白2。毒蛋白2的核苷酸 序列如SEQ ID NO：3所示。毒蛋白2的编码序列包括SEQ ID NO：3中 439-1368位的核苷酸。毒蛋白2的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。如本文 所示，毒蛋白2在发育的种子或叶中不表达。

在第三个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白2A。毒蛋白2A的核 苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。毒蛋白2A的编码序列包括SEQ ID NO：5 中475-1404位的核苷酸。毒蛋白2A的蛋白序列如SEQ ID NO：6所示。如 本文所示，毒蛋白2A在叶中特异地表达。毒蛋白2A在叶肉细胞的液泡和 叶管状分子的次生细胞壁中被检测到。

第二方面，本发明提供了两种麻疯树毒蛋白基因的组织特异性启动子。 在一个实施方式中，所述启动子源自毒蛋白1基因。毒蛋白1启动子的核 苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。启动子缺失研究表明2888个碱基对的毒蛋 白1启动子足以用于其在种子胚乳中的组织特异性表达。因此，毒蛋白1 启动子为胚乳特异性启动子。此序列的片段也有如组织特异性启动子，即 胚乳特异性启动子的活性。这类片段包括以下：(a)SEQ ID NO：7中1-2888 位的核苷酸、(b)SEQ ID NO：7中1142-3181位的核苷酸、(c)SEQ ID NO：7， 其中2944-3170位的核苷酸被缺失、(d)SEQ ID NO：7中1142-3181位的核 苷酸，其中2944-3170位的核苷酸被缺失、和(e)SEQ ID NO：7中2688-3181 位的核苷酸，其中2944-3170位的核苷酸被缺失。毒蛋白1启动子或其片段 可用于在转基因植物的种子胚乳中特异地表达感兴趣的下游DNA。在一些 实施方式中，胚乳特异性毒蛋白1启动子可用于在麻疯树种子的胚乳以及 其它作物种子中表达感兴趣的DNA，如靶基因，如编码酶或蛋白的基因。

在第二个实施方式中，所述启动子源自毒蛋白2A基因。毒蛋白2A启 动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。启动子缺失研究表明1793个碱基 对的毒蛋白2A启动子足以用于其在叶组织中的组织特异性表达。因此，毒 蛋白2A启动子为叶特异性启动子。此序列的片段也有组织特异性启动子的 活性。然而，当将一些序列缺失时，特异性由叶特异的变为非组织特异的。 具有非组织特异性启动子的活性的此类片段包括以下：(a)SEQ ID NO：8中 912-2087位的核苷酸、(b)SEQ ID NO：8中1-2087位的核苷酸，其中 1853-2076位的核苷酸被缺失、(c)SEQ ID NO：8中912-2087位的核苷酸， 其中1853-2076位的核苷酸被缺失、和(d)SEQ ID NO：8中1751-2087位的 核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺失。

毒蛋白2A启动子可用于在转基因植物的叶组织中特异地表达感兴趣 的下游DNA。在一些实施方式中，叶特异性毒蛋白2A启动子可用于在麻 疯树属以及其它作物的叶或其它绿色组织中表达感兴趣的DNA，如靶基因， 如编码酶或蛋白的基因。在其它实施方式中，毒蛋白2A启动子的非组织特 异性片段可用于指导诸如酶或蛋白等感兴趣的DNA在麻疯树属以及其它 作物种子中的非组织特异性表达。

在第三个实施方式中，所述启动子源自毒蛋白2基因。毒蛋白2启动 子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。如本文所述，此启动子在胚乳或叶 组织中不表达，但可通过昆虫袭击时茉莉酸(JA)的活化和/或防御反应或叶 老化期间乙烯的活化来活化和表达。

本发明的启动子特别适用于制备包括麻疯树属在内的转基因植物，以 包含感兴趣的DNA。其它植物物种包括但不限于蓖麻、棕榈油、椰子、花 生、油菜籽、大豆、向日葵、木薯、番茄、豆、棉花、黄瓜、卷心菜、大 麦、燕麦、小麦、玉米和稻。在一个实施方式中，毒蛋白1启动子或其片 段可用于指导诸如感兴趣的基因等感兴趣的DNA在麻疯树属种子或其它 植物种子的胚乳中表达。在另一个实施方式中，毒蛋白2A启动子可用于指 导诸如感兴趣的基因等感兴趣的DNA在麻疯树或其它植物物种的叶或其 它绿色组织中表达。在又一个实施方式中，毒蛋白2启动子可用于指导诸 如感兴趣的基因等感兴趣的DNA在诱导性条件下表达，所述条件例如昆虫 袭击时JA的活化和/或防御反应或叶老化期间乙烯的活化。

插入麻疯树属植物或其它植物物种的DNA(感兴趣的DNA)对转化过 程不重要。通常，被引入植物的DNA是构建体的一部分。DNA可为感兴 趣的基因，如蛋白的编码序列，或其可为能够调节基因表达的序列，如反 义序列、有义抑制序列、转录后基因沉默序列(RNAi序列，如siRNA、shRNA 或dsRNA)或微小RNA(miRNA)序列。构建体通常包括与感兴趣DNA的5’ 端和/或感兴趣DNA的3’端可操纵连接的调节区域。本文中也将包含全部 这些元件的盒称为表达盒。在表达盒构建体中，表达盒可额外地包含5’前 导序列(leader sequence)。调节区域(即启动子、转录调节区域和翻译终止区 域)和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是天然/同源的。 本文鉴定的启动子和植物特异性启动子特别适用于制备用于麻疯树属转化 以及其它植物物种转化的构建体。或者，调节区域和/或编码信号锚的多核 苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是异源的。参见美国专利7,205,453以及美 国专利申请公布2006/0218670、2006/0248616和2009/0100536，以及本文 所引用文献。在表达盒构建体中，表达盒可额外地包含5’前导序列。这类 前导序列可起到增强翻译的作用。翻译前导物是本领域已知的，且包括国 际公布WO 2008/094127和本文所引用文献中描述的那些。

在优选实施方式中，本文鉴定的启动子和组织特异性启动子用在本发 明的实施中。可基于所需结果选择启动子。也就是说，核酸可与用于在感 兴趣的特定宿主细胞或宿主组织中表达的组织特异性启动子组合。

在诸如本文所述的启动子等启动子控制下的感兴趣的DNA可为本文 定义的任何DNA，且可用于改变其所引入的植物物种的任何特性或性状， 所述植物物种包括作为优选实施方式的麻疯树属。在一个实施方式中，将 感兴趣的DNA引入植物以提高植物的性状。在另一个实施方式中，提高的 农艺学性状可表征为提高的植物形态学、生理学、生长和发育、产率、营 养提高、疾病或害虫抗性、或环境或化学耐性。在一些方面，提高的性状 选自由以下提高的性状组成的组：提高的水利用率、提高的温度耐性、提 高的产率、提高的氮利用率、提高的种子蛋白、提高的种子油和提高的生 物量。提高的产率包括在无胁迫条件下提高的产率，和在环境胁迫条件下 提高的产率。胁迫条件包括，例如，干旱、背光、真菌性疾病、病毒性疾 病、细菌性疾病、昆虫侵扰、线虫侵扰、极端温度暴露(冷或热)、渗透胁迫、 降低的氮营养利用率、降低的磷营养利用率和高植物密度。在一些实施方 式中，感兴趣的DNA可用于修改代谢途径，如种子中的脂肪酸生物合成或 脂类生物合成途径，或修改麻疯树属或其它植物物种中的病原菌抗性。

通常，表达盒可另外包括用于选择转化细胞的可选择的标记基因。使 用可选择的标记基因来选择转化的细胞或组织。通常，植物可选择的标记 基因将编码抗生素抗性，适合的基因包括以下至少一组：编码抗生素大观 霉素的基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、编码卡那霉素 或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素 磷酸转移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。或者，植物可选择 的标记基因将编码除草剂抗性，如对磺酰脲类除草剂、草铵膦、草甘膦、 铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸盐(2，4-D)的抗性，包括编码有此 除草剂抗性的基因，所述除草剂对谷氨酰胺合酶起抑制作用，如草胺膦或 basta(如bar基因)。参见国际公布WO 02/36782、美国专利7,205,453以及 美国专利申请公布2006/0218670、2006/0248616、2007/0143880和 20090100536，以及本文所引用的文献。可选择的标记基因的此列表不意在 限制。可使用任何可选择的标记基因。可选择的标记基因叶也受待转化的 植物物种中可操纵启动子的控制。这类启动子包括国际公布WO 2008/094127和本文所引用文献中所述的那些。

适合时，可最佳化感兴趣的DNA以提高在转化植物中的表达。也就是 说，可使用植物优选的密码子来合成编码序列以改进表达。本领域中可获 得合成植物优选的基因的方法。参见，如美国专利5,380,831、5,436,391和 7,205,453，以及美国专利申请公布2006/0218670和2006/0248616。

在表达盒的制备中，可操作各种DNA片段，以为所述DNA片段提供 正确的方向，以及在适合时提供正确的可读框。因此，可使用适配子或连 接子来连接DNA片段，或可包括其它操作来提供方便的限制性位点、去除 多余的DNA、去除限制性位点等。为此，可包括体外诱变、引物修复、限 制、退火、再替换，如翻译和颠换。

一旦将核酸克隆入表达载体中，可使用常规转化步骤将其引入植物细 胞。术语“植物细胞”意在包括源自以下植物的任何细胞，所述植物包括未分 化的组织如愈伤组织和悬浮培养物、以及植物种子、花粉或植物胚。适用 于转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、原生质体、胚轴、子 叶、盾片、枝条尖、根、未成熟的胚、花粉和花粉囊。“转化”是指通过外部 应用来自不同基因型的另一种细胞的重组DNA，使其被吸收并整合进入对 象细胞的基因组，以直接修改细胞基因组。在此方式中，可获得遗传修饰 的植物、植物细胞、植物组织、种子等。

包含本发明启动子的DNA构建体可用于转化任何植物，特别是麻疯树 属植物。构建体可通过各种常规技术引入所需植物宿主的基因组内。用于 转化各种高等植物物种的技术是熟知的，且描述在技术和科技文献中。转 化方法可根据转化所针对的植物或植物细胞的类型，即单子叶或双子叶来 改变，这些是本领域技术人员熟知的。例如，DNA构建体可使用诸如植物 细胞原生质体电穿孔和微注射等技术直接引入植物细胞的基因组DNA中， 或DNA构建体可使用诸如DNA微粒轰击等冲击方法直接引入植物组织中。 或者，DNA构建体可与适合的T-DNA旁侧区域结合，并引入常规根癌农 杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主载体中。当细胞被细菌感染时，根癌农 杆菌宿主的毒力功能将引导构建体和相邻的标记插入植物细胞DNA中。因 此，可应用提供有效转化/转染的任何方法。参见，例如美国专利7,241,937、 7,273,966和7,291,765，和美国专利申请公布2007/0231905和2008/0010704， 以及本文所引用的文献。还参见国际公布的申请WO 2005/103271和WO 2008/094127以及本文所引用的文献。

在一个实施方式中，可使用本领域熟知的技术，将外植体组织与包括 含感兴趣的基因或核酸的DNA构建体的农杆菌株共培养。转化的组织可使 用本领域熟知的常规技术来选择。在另一实施方式中，可使用本领域熟知 的技术，将胚胎发生液体悬浮培养物与包括含感兴趣的基因或核酸的DNA 构建体的农杆菌株共培养。转化的组织可使用本领域熟知的常规技术来选 择。在另一实施方式中，DNA可使用诸如微粒轰击等常规方法引入胚胎发 生液体悬浮培养物的外植体组织或细胞中。转化的组织可使用本领域熟知 的常规技术来选择。转化的或转基因植物可使用本文所述的方法来再生。 在另一实施方式中，如2009年1月7日递交的国际专利申请 PCT/SG2009/000015所述，麻疯树属可用农杆菌转化，此文献在此援引加 入。

可培养通过任何以上转化方法得到的转化的植物细胞，以再生为具有 转化的基因型和因此所希望的表型的整株植物，如转基因植物。“转基因植 物”为已引入外源DNA的植物。无论是有性或无性繁殖，“转基因植物”均 包括继续含有外源DNA的全部子代、杂种和它们的杂交体。再生技术依赖 于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素，通常依赖于已与所需核苷 酸序列一起被引入的杀生物剂和/或除草剂标记。参见，例如国际公布的申 请WO 2008/094127以及本文所引用的文献。

前述用于转化的方法通常被用于生产表达盒被稳定并入其中的转基因 变体。在表达盒被稳定地并入转基因植物中后，其可通过有性杂交来转移 至其它植物中。在一个实施方式中，转基因变体可随后与另一种变体(未转 化的或转化的)杂交，以产生新的转基因变体。或者，可使用植物育种领域 熟知的传统回交技术将遗传性状转移入另一种棉花系中，所述遗传性状已 使用前述转化技术通过工程化进入特定棉花系。例如，可使用回交方法将 来自共有的，非原种变体的工程化性状转移入原种变体，或将来自在其基 因组中包含外源基因的变体的工程化性状转移入不包含此基因的一种或多 种变体。如本文所用，根据上下文，“杂交”是指简单的X与Y杂交，或回 交的方法。根据待杂交的物种，可使用大量标准育种技术中的任一种。

一旦产生这种类型的转基因植物，植物本身可根据常规方法来培育。 当然，转基因种子可从转基因植物中获得。这些种子可随后被植入土壤中， 并使用常规方法培育以产生转基因植物。

第三方面，本发明提供了毒蛋白缺陷型转基因麻疯树属植物和毒蛋白 缺陷型转基因麻疯树属植物生产。在一个实施方式中，毒蛋白缺陷型转基 因植物包括稳定整合入其基因组中的核酸，其中所述核酸编码靶向毒蛋白 基因的双链RNA(dsRNA)。在另一个实施方式中，毒蛋白缺陷型转基因植 物包括稳定整合入其基因组中的核酸，其中所述核酸编码靶向毒蛋白基因 的短干扰RNA(siRNA)。在另一个实施方式中，毒蛋白缺陷型转基因植物 包括稳定整合入其基因组中的核酸，其中所述核酸编码靶向毒蛋白基因的 短发夹RNA(shRNA)。在一个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白1。 在另一个实施方式中，所述毒蛋白基因为毒蛋白2。在又一个实施方式中， 所述毒蛋白基因为毒蛋白2A。在一个实施方式中，所述核酸包括所述毒蛋 白1基因的一部分。在另一个实施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白2基 因的一部分。在又一个实施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白2A基因的一 部分。在一个实施方式中，所述毒蛋白缺陷型转基因植物通过转化麻疯树 属植物组织生产。编码dsRNA、siRNA或shRNA的核酸通常被包括在构建 体中，如本文所述的构建体。核酸处于启动子的可操纵的控制下。可使用 的适合的启动子包括本文所述的那些。构建体可进一步包括其它调节序列， 如本文所述的那些。

例如，可制备包括这样序列的构建体，所述序列被转录为可自身退火 的RNA，如具有茎环结构的双链RNA。在一些实施方式中，双链RNA茎 部分的一条链包括这样的序列或其片段，所述序列与感兴趣多肽的有义编 码序列相似或相同，且长度为约10个核苷酸至约2,500个核苷酸。与有义 编码序列相似或相同的序列的长度可为10个核苷酸至500个核苷酸、15个 核苷酸至300个核苷酸、20个核苷酸至100个核苷酸或25个核苷酸至100 个核苷酸。双链RNA茎部分的另一条链包括这样的序列或其片段，所述序 列与感兴趣多肽的编码序列的反义链相似或相同，且可具有与有义序列对 应长度相比更短、相同或更长的长度。在一些情况中，双链RNA茎部分的 一条链包括这样的序列或其片段，所述序列与编码感兴趣多肽的mRNA的 3′或5′非翻译区相似或相同，且双链RNA茎部分的另一条链包括这样的序 列或其片段，所述序列与分别互补于编码感兴趣多肽的mRNA的3′或5′非 翻译区的序列相似或相同。在其它实施方式中，双链RNA茎部分的一条链 包括这样的序列或其片段，所述序列与编码感兴趣多肽的前mRNA中的内 含子的序列相似或相同，且茎部分的另一条链包括这样的序列或其片段， 所述序列与互补于前mRNA中的内含子序列的序列相似或相同。

双链RNA的环部分可为3个核苷酸至5,000个核苷酸，如3个核苷酸 至25个核苷酸、15个核苷酸至1,000个核苷酸、20个核苷酸至500个核苷 酸或25个核苷酸至200个核苷酸。RNA的环部分可包括内含子或其片段。 双链RNA可具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个茎环结构。

在本文所述的一个实施方式中，制备这样的构建体，其包括组成型启 动子，如CaMV 35S启动子、本文所述的其中一种毒蛋白基因的部分序列(有 义方向)、连接子、相同毒蛋白基因的部分序列(反义方向)和终止子，如NOS 终止子。在一个实施方式中，毒蛋白基因为毒蛋白1基因，且毒蛋白1的 部分序列包括862个核苷酸且如SEQ ID NO：53所示。在另一个实施方式中， 毒蛋白基因为毒蛋白1cDNA，且毒蛋白1cDNA的序列包括1161个核苷 酸且如SEQ ID NO：54所示。在又一个实施方式中，毒蛋白基因为毒蛋白 2A cDNA，且毒蛋白2A cDNA的序列包括1176个核苷酸且如SEQ ID NO：55 所示。在再一个实施方式中，毒蛋白基因为推定的毒蛋白2cDNA，且推定 的毒蛋白2cDNA的序列包括1140个核苷酸且如SEQ ID NO：56所示。除 了SEQ ID NO：53-56所示的序列，也可以使用这些序列的部分序列。部分 序列可包括50个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、200个核苷酸、250 个核苷酸、300个核苷酸、350个核苷酸、400个核苷酸、450个核苷酸、 500个核苷酸、550个核苷酸、600个核苷酸、650个核苷酸、700个核苷酸、 750个核苷酸、800个核苷酸、850个核苷酸或最多为少于全长序列中核苷 酸数量的核苷酸。应理解，部分序列可包括在所示例的核苷酸数量之间的 任意数量的核苷酸，如60个核苷酸、175个核苷酸等。也应理解，部分序 列可包括以下范围的核苷酸，所述范围在所示例的编号或所示例的那些编 号内的任何编号与全长序列中的核苷酸数量之间，如SEQ ID NO：53的 50-100、50-800、100-800、175-862等。

siRNA也可指核苷酸的RNA双链体，或在一些其它方面，其可指靶向 诸如感兴趣的基因等核酸的单个RNA分子(在一些实施方式中，此单个 RNA分子可具有诸如环的二级结构以形成shRNA)。“RNA双链体”是指通 过RNA分子至少两个区域之间的互补配对形成的结构。因此，“RNA双链 体”可包括1、2、3或更多个RNA分子。siRNA“靶向”这样的基因，其中siRNA 双链体部分的核苷酸序列与所靶向基因的核苷酸序列互补。因此，通过使 用靶基因的序列，可常规地设计和制备任何siRNA。在一些实施方式中， siRNA双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施方式中，siRNA双链体 的长度大于30个核苷酸。在一些实施方式中，双链体的长度可为40、39、 38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个或更少个核苷 酸。在一些实施方式中，双链体的长度为19-25个核苷酸。siRNA的RNA 双链体部分可为发夹结构的一部分。一方面，在本发明的siRNA中无发夹 结构。除了双链体部分，发夹结构还可包含位于形成双链体的两个序列之 间的环部分。环的长度可以改变。在一些实施方式中，环的长度为2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12或13或更多个核苷酸。发夹结构也可包含3′ 或5′突出部分。在一些实施方式中，突出部分为0、1、2、3、4或5个核 苷酸长度的3′或5′突出部分。siRNA可由核酸序列编码，且核酸序列也可包 括启动子。核酸序列也可包括聚腺苷酸化信号。在一些实施方式中，聚腺 苷酸化信号为合成的最小聚腺苷酸化信号。siRNA可整体或部分地由合成 的核苷酸、天然碱基或修改的碱基组成。靶向感兴趣的毒蛋白基因的siRNA 分子，如本文所述的毒蛋白1基因、毒蛋白2基因或毒蛋白2A基因可使用 本领域熟知的算法来设计。

对于RNAi技术的进一步描述，参见例如美国专利5,034,323；6,326,527； 6,452,067；6,573,099；6,753,139；和6,777,588。也参见国际专利公布 WO 97/01952、WO 98/36083、WO 98/53083、WO 99/32619和WO 01/75164； 和美国专利公布2003/0175965、2003/0175783、2003/0180945、2004/0214330、 2005/0244858、2005/0277610、2007/0265220、2009/0215860、2009/0308041 和2010/0058498。

根据本发明的这个方面，毒蛋白缺陷型转基因植物通过转化麻疯树属 植物组织生产。在一个实施方式中，转化为农杆菌介导的转化。在另一实 施方式中，转化为诸如DNA微粒轰击等冲击方法。在另一实施方式中，转 化为诸如电穿孔和微注射等直接引入。在一个实施方式中，如本文所述进 行农杆菌介导的转化。在另一实施方式中，农杆菌介导的转化如2009年1 月7日递交的国际专利申请PCT/SG2009/000015所述来进行，此文献在此 援引加入。如本文所述转化植物细胞。如本文所述选择转化的植物细胞。 如本文所述，转基因植物从转化的植物细胞再生。如本文所述，对稳定并 入RNAi构建体和毒蛋白缺陷的转基因植物进行筛选。

除非另有说明，本发明的实施应用本领域技术人员知晓的化学、分子 生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养 和转基因生物学的常规技术。

参见，例如Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor  Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook et al.，1989， Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring  Harbor，New York)；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)； Ausubel et al.，1992)，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley &  Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press， Oxford)；Russell，1984，Molecular biology of plants：a laboratory course manual  (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y)；Anand， Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York， 1992)；Guthrie and Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology  (Academic Press，New York，1991)；Harlow and Lane，1988，Antibodies，(Cold  Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Nucleic Acid  Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And  Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells  (R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL  Press，1986)；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the  treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Methods In  Enzymology，Vols.154and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In  Cgll And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London， 1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and  C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential Immunology，6th Edition， Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Fire et al.，RNA Interference  Technology：From Basic Science to Drug Development，Cambridge University  Press，Cambridge，2005；Schepers，RNA Interference in Practice，Wiley-VCH， 2005；Engelke，RNA Interference(RNAi)：The Nuts & Bolts of siRNA  Technology，DNA Press，2003；Gott，RNA Interference，Editing，and  Modification：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)，Human  Press，Totowa，NJ，2004；Sohail，Gene Silencing by RNA Interference： Technology and Application，CRC，2004。

实施例

本发明通过参考以下实施例来描述，这些实施例以说明的方式提供且 不意在以任何方式限制本发明。使用本领域熟知的标准技术或以下具体描 述的技术。

实施例1：材料和方法

植物材料和生长条件：除特别说明外，实验使用麻风树(印尼目录 (JC-MD))。植物在新加坡的试验田中生长，白天的温度为32℃，夜晚温度 为26℃，平均相对湿度为85％，且光周期为12-13小时。

构建体：为了构建使用GFP作为报告基因的表达载体，我们使用引物 对GFPPstIF和GFPKpnIR(表1)从质粒pSSZ41扩增出包含GFP编码序列 的PstI-KpnI片段(Kolesnik et al.，2004)。将PCR产物用限制性酶PstI和KpnI 消化，并随后插入pCAMBIA1300载体以产生pCGFP。将毒蛋白1终止子 克隆入pCGFP的KpnI和EcoRI位点之间的区域，以产生pCGFPT1。将毒 蛋白基因的启动子克隆入pCGFPT中HindIII和PstI位点之间的区域，以 产生最终的表达构建体。将pC1305.1中的CaMV35S启动子通过用HindIII 和NcoI消化来去除，并将载体片段在末端补齐并自连接以产生 pC1305.1(-35S)。将毒蛋白基因的启动子克隆入pC1305.1(-35S)中KpnI和 PstI之间的区域，以驱动构建体中的GUS报告基因。用于毒蛋白基因的 RNAi构建体基于pANDA载体pANDA35HK来制备(Miki and Shimamoto  2004)。简而言之，毒蛋白1的部分编码序列使用引物Curcin 1TOPO-F and  JCG-R来扩增(表1)。扩增产物的序列如SEQ ID NO：53所示。将PCR产物 克隆入pENTR D-TOPO(Invitrogen)，并使用Gateway技术最终转移入 pANDA35HK载体以产生pANDA35HKC1(Hartley et al.，2000)。

表1：DNA寡核苷酸引物

麻风树属转化：将5-7天龄幼苗的子叶切割为0.5×0.5cm²圆片，并与 悬浮在农杆菌悬浮培养基(液体MS盐、B5维生素、1.5mg/L BA(6-苄基氨 基嘌呤)、0.1mg/L NAA(α-萘乙酸)、20mg/L AS(乙酰丁香酮)、0.5g/L MES (2-(N-吗啉代)乙磺酸)、30g/L蔗糖、10g/L葡萄糖，pH 5.0-5.2)中的农杆菌 (OD₅₉₅＝0.25-0.35)在22℃黑暗中共培养2-3天。之后，将共培养的子夜圆 片用无菌水清洗若干次，随后用300mg/L头孢噻肟清洗一次。之后，将子 叶圆片在愈伤组织形成培养基(MS盐、B5维生素、1.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、3.5mg/L潮霉素、100mg/L头孢噻肟、10mg/L柠檬酸、150mg/L 谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解产物、0.5g/L MgCl₂、30g/L蔗糖、2.5g/L 植物凝胶(phytagel)，pH 5.8-6.0)中在25℃黑暗下培养3周。将新生的潮霉 素抗性愈伤组织在枝条再生培养基I(MS盐、B5维生素、10mg/L柠檬酸、 150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解产物、0.5g/L MgCl₂、30g/L蔗 糖、1.5mg/L 6-BA、0.05mg/L IBA(吲哚-3-丁酸)、2mg/L腺嘌呤、3.5mg/L 潮霉素、100mg/L头孢噻肟、2.5g/L植物凝胶，pH 5.8-6.0)中在25℃、16 小时光/8小时黑暗的光周期下继代培养3周。在此期间，任何从愈伤组织 再生出的枝条均需要继代培养在枝条再生培养基II(MS盐、B5维生素、10 mg/L柠檬酸、150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解产物、30g/L蔗糖、 pH 5.8-6.0、1.5mg/L 6-BA、0.05mg/L IBA、0.5mg/L GA(赤霉酸)、4mg/L 潮霉素、100mg/L头孢噻肟、7g/L琼脂)上。将未再生出枝条的愈伤组织继 代培养在用于进一步再生枝条的枝条再生培养基III(MS盐、B5维生素、 10mg/L柠檬酸、150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解产物、0.5g/L MgCl₂、30g/L蔗糖、1.5mg/L 6-BA、0.05mg/L IBA、3.5mg/L潮霉素、 100mg/L头孢噻肟、2.5g/L植物凝胶，pH 5.8-6.0)上。将再生的枝条在枝 条伸长培养基(MS盐、B5维生素、10mg/L柠檬酸、150mg/L谷氨酰胺、 100mg/L酪蛋白水解产物、30g/L蔗糖、0.3mg/L 6-BA、0.1mg/L GA、7g/L 琼脂，pH 5.8-6.0)中在25℃、16小时光/8小时黑暗的光周期下继代培养3 周。使约2.5cm长度的伸长的枝条在根诱导培养基(MS盐、B5维生素、0.07 mg/l IBA、0.5g/L MES、30g/L蔗糖、2.2g/L植物凝胶，PH 5.8)中生根。 通常，生根要经过大于1个月的时间。

BAC文库构建：如Peterson et al(2000)所述，麻风树的BAC文库使用 BAC载体pIndigoBAC-5来制备。简而言之，根据此方案中所述的方法 OPTION X，从新鲜叶中分离高分子量(HMW)DNA。将HMW DNA用 HindIII消化，并选择100-150kb大小的片段连接入pIndigoBAC-5载体。将 连接产物转移入大肠杆菌DH10感受态细胞，并在384孔板中分析转化体。 制备高密度杂交膜，并用于BAC克隆筛选。

DNA印迹和RNA印迹分析：DNA凝胶印迹分析根据前述的标准方法 进行(Sambrook et al.，1989)。如前所述，植物基因组DNA从叶中分离 (Dellaporta et al.1983)。在DNA印迹分析的每条泳道中使用约2μg DNA。 将用引物对CantigenF1和CantigenR1(表1)扩增的毒蛋白1编码序列用作 BAC文库筛选和DNA印迹分析的探针。通过Rediprime II随机引物标记系 统，用[³²P]-dCTP标记探针(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA)。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：根据生产商说明书，使用RNeasy  Plant Mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)从不同组织中分离总RNA。将总 RNA样品用DNase I处理。根据生产商说明书，使用SMART^TM MMLV逆 转录酶(Clontech)从1μg总RNA中合成第一链cDNA。

cDNA末端的快速扩增(RACE)和热不对称交错(TAIL)PCR：根据生产商 说明书进行5’RACE和3’RACE(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。用于毒蛋 白15’RACE的引物为引物对GSP1和AAP，以及引物对GSP1A和AUAP (表1)。用于毒蛋白13’RACE的引物为引物对C2RTF2和AUAP，以及引 物对3’RACEF4和AUAP(表1)。用于毒蛋白2A 5’RACE的引物为引物对 C2RTR2和AAP，以及引物对5’RACEG4和AUAP(表1)。用于毒蛋白2A 3’ RACE的引物为引物对CTRTF2和AUAP，以及引物对3’RACEF1和AUAP (表1)。TAIL-PCR根据前述公布的步骤进行(Liu et al.1995)。用于TAIL-PCR 的任意简并(AD)引物为AD2(表1)。

实时RT-PCR：实时定量RT-PCR根据Chen et al(2007)所述的方法进行， 并在Bio-Rad iCycler iQ5实时PCR系统上进行。总RNA从麻疯树种子或发 育时期的叶中提取。总RNA样品首先用DNase I处理，随后根据生产商说 明书使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)逆转录为第一链cDNA。用于 实时RT-PCR的寡聚引物根据每个基因的3’UTR来设计。为了确保定量PCR 期间最大的特异性和效率，通过建立5或6个系列的10倍稀释的标准曲线 来进一步测试寡聚引物对应答的线性。标准的反应混合物(15μl)由2μl cDNA模板、1x SsoFast EvaGreen Supermix以及500nM正向和反向引物组 成。PCR反应由95℃下持续30秒的初始变性步骤、随后95℃下持续5秒 共计40个循环和60℃下持续10秒组成。解链曲线反应紧随扩增后，其持 续加热10秒，起始于65℃且以0.5℃增加。PCR产物特异性通过解链曲线 分析和2％的琼脂糖凝胶电泳确认，以确保PCR反应中没有引物二聚体和 非特异性扩增子。麻疯树肌动蛋白基因用作内标，以对全部样品的总RNA 的相对量进行标准化。对于每个所选基因，在96孔板上将PCR反应一式三 份(包括激动蛋白对照和一式两份的阴性对照(无cDNA模板的反应样品))准 备并进行。对每个板重复进行实时RT-PCR实验，以确保可获得相似的结果。

微粒轰击和GFP或GUS的瞬时表达：根据生产商说明书(Bio-Rad，CA， USA)，将1.0μg的金粒子用质粒DNA包被。将来自6周龄发育时期的未 成熟麻疯树种子的胚乳手工切割为约0.5mm厚度的薄片。对于每次轰击， 使用PDS-1000/He系统(Bio-Rad)，以1100psi和15cm的飞行距离轰击5 至6片切片。将轰击的样品在培养皿中的湿过滤纸上，在22-25℃下过夜培 养。用荧光立体显微镜(Model SZX12，Olympus，Japan)筛选轰击样品中的 GFP表达，并在LSM510META倒置共焦显微镜(Zeiss，Jena，Germany)上， 在488nm下和505-530nm的通过频带下拍照。将pSSZ41中的玉米泛素启 动子和其融合GFP基因(Kolesnik et al.，2004)用作GFP分析的阳性对照。对 于瞬时GUS表达，将大小为2x2cm²的叶圆片用于微粒轰击。GUS活性 根据前述方法检测(Hiei et al，1994)。GUS活性的X-Gluc染色通过Nikon  SMZ 1500立体显微镜观察，并通过相连的Nikon DIGITAL SIGHT DS-SMC 相机拍照。将pC1305.1中的CaMV35S启动子和其融合基因GUS用作GUS 活性分析的阳性对照。空载体pC1300用作GFP和GUS瞬时表达分析的阴 性对照。

毒蛋白抗体的产生：毒蛋白1的N和C末端编码序列分别用引物对 Cantigen F1和Cantigen R2(用于毒蛋白1N)，以及引物对Cantigen F2和 Cantigen R3(用于毒蛋白1C)(表1)扩增。将PCR产物克隆入载体pQE30 (Qiagen)以产生pQCF1R2和pQCF2R3。将构建体随后引入大肠杆菌BL21 株以用于抗原表达。抗原蛋白用多个组氨酸标记的蛋白纯化试剂盒 (MACHEREY-NAGEL，Duren，Germany)来提取并纯化。抗毒蛋白1N或抗毒 蛋白1C抗体根据兔多克隆抗体生产的标准步骤来产生。

蛋白印迹分析：使用来自植物不同组织的20μg总蛋白进行蛋白印迹分 析。蛋白在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后印迹在硝酸纤维素膜上。 根据产品手册，毒蛋白通过抗毒蛋白1N或抗毒蛋白1C的抗体以及辣根过 氧化物酶偶联的二抗(Bio-Rad)来检测。

免疫金电镜：免疫金电镜根据前述的步骤进行(Chye et al.，1999)。将种 子或叶切片在真空以及在0.5％戊二醛和2％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液 的溶液中固定4小时。将样品用50mM磷酸盐缓冲液清洗45分钟。在梯 度乙醇中脱水后，将样品浸入LR白树脂(EMS，Hatfield，PA19440，USA)并 在明胶胶囊中包埋。样品使用Leica Ultracut切片机以80nm切片，并置于 Formvar包被的狭缝载网上。毒蛋白通过用抗毒蛋白的多克隆抗体以及随后 用15nm金缀合的羊抗兔IgG抗体来检测(EMS)。兔的免疫前血清用于对照 实验。将载网上的样品用2％乙酸双氧铀和1％柠檬酸铅来进一步染色。样 品用在120kv下运行的透射电镜(JEOL JEM-1230，JEO LTD，Tokyo 196-8558， Japan)观察，并用数字显微照相系统(Gatan Inc.，Pleasanton，CA94588，USA) 拍照。

实施例2：毒蛋白1和毒蛋白2的分离

为了从麻疯树中分离毒蛋白基因，构建麻疯树BAC文库，并从此BAC 文库中鉴定出7个BAC克隆以包含毒蛋白基因中的1至2个成员(图1)。 BAC克隆121E10携带两个毒蛋白基因拷贝(图1)。BAC 121E10通过鸟枪 法测序，显示BAC中的插入物为64,841bp。BAC插入物中的两个毒蛋白 基因紧密连接并以串联方式排列。一个毒蛋白基因编码293个氨基酸的毒 蛋白，而另一个编码309个氨基酸的毒蛋白2样蛋白。随后将两个毒蛋白 基因分别命名为毒蛋白1(293个氨基酸)和毒蛋白2(309个氨基酸)。毒蛋白 1和毒蛋白2彼此相距8-kb，且毒蛋白1位于毒蛋白2的3’端。将剩余6 个BAC克隆中的毒蛋白基因亚克隆并测序。BAC克隆127F22、147I10和 176I18中的毒蛋白基因包含毒蛋白1和毒蛋白2，而213H9和221F16中的 毒蛋白基因分别携带毒蛋白1。BAC克隆187G09也携带毒蛋白1，但其序 列显示出在毒蛋白1编码序列下游-2463bp处有突变。

我们进行了cDNA文库筛选以及5’RACE和3’RACE RT-PCR，以分离 毒蛋白1和毒蛋白2的全长cDNA克隆。将毒蛋白1对应的cDNA从未成 熟麻疯树种子的胚乳中分离(图2)。毒蛋白1cDNA由1388个核苷酸组成， 不包括3’多腺苷序列(图2)。其包含66bp的5’非翻译区(5’UTR)和213bp 的3’UTR(图2)。比较毒蛋白1cDNA和其基因组序列，在5’UTR中鉴定 出227bp的内含子(图2)。内含子位于起始密码子上游12bp处(图2)。在 RIP基因典型的毒蛋白1基因的3’非翻译区中有2个规范的多腺苷化信号 (AATAAA)(Lin et al.，2003；Chow et al.，1999)。第一个多腺苷化信号位于终 止密码子下游80bp处，而第二个多腺苷化信号位于多腺苷化位点上游20bp 处(图2)。虽然毒蛋白2的基因组序列与毒蛋白1的基因组序列显示出高相 同性，我们通过上述技术仍未从未成熟种子或叶组织中分离处毒蛋白2的 cDNA。原因是毒蛋白2基因在正常发育条件下可能不表达。图3显示出用 毒蛋白2的基因组序列、5’UTR中的推定的内含子和其推导的氨基酸残基 来注释毒蛋白2。

实施例3：毒蛋白2A的分离

在我们尝试从麻疯树中分离毒蛋白2cDNA期间，我们获得了与毒蛋白 2cDNA显示出同源性的cDNA克隆。在cDNA和毒蛋白2之间的ORF区 域有59个单核苷酸多态性(SNP)。cDNA克隆的开放阅读框(ORF)编码具有 309个氨基酸残基的毒蛋白，其与GenBank中的2类毒蛋白(Acc.No.： ABZ04128)相同。我们将此毒蛋白基因命名为毒蛋白2A。毒蛋白2A的基 因组克隆通过PCR分离。初始，毒蛋白2A的1216bp基因组区域通过PCR， 使用源自毒蛋白2基因组克隆的引物C2PF4和源自毒蛋白2A cDNA的 C1CDSR(表1)分离。此1216bp的片段包含881bp毒蛋白2A启动子。其 次，对应于此881bp区域上游处的毒蛋白2A启动子5’调节区的982bp片 段通过TAIL-PCR，使用引物对C2AFAR3和AD2(表1)分离。毒蛋白2A 的832bp 3’基因组区域使用源自毒蛋白2A cDNA的C2ACDSF和基于毒蛋 白2基因组序列的C2TR2EcoRI(表1)扩增。我们共计获得3774bp的毒蛋 白2A的基因组克隆，包括在转录起始位点上游处得1793bp启动子和在终 止密码子下游处的758bp 3’调节区。毒蛋白2A的基因结构与毒蛋白1的那 些基因结构类似。图4显示出用毒蛋白2A的基因组序列、5’UTR中的内含 子和其推导的氨基酸残基来注释毒蛋白2A。

至此，我们已从麻疯树中分离出3种毒蛋白基因。之前，我们从麻疯 树BAC文库中获得了7个BAC克隆。然而，DNA测序表明7个BAC克 隆均不包含毒蛋白2A。BAC克隆121E10、127F22、147I10和176I18携带 毒蛋白1和毒蛋白2，BAC克隆187G09包含毒蛋白1，且BAC克隆213H9 和221F16包含毒蛋白2。为了进一步确认毒蛋白2A在麻疯树基因组中的 存在，我们设计了一对通用引物CF2和CR2(表1)，以从基因组DNA中扩 增3种毒蛋白基因，以及从BAC 121E10中扩增毒蛋白1和毒蛋白2。将 PCR产物用Sau3AI消化并在2％琼脂糖凝胶上分离。毒蛋白1和毒蛋白2 均产生3个片段(对于毒蛋白1为195bp、243bp和582bp；对于毒蛋白2 为195bp、243bp和580bp)，然而毒蛋白2A产生2个片段(243bp and 775 bp)，这是因为在此基因的编码序列中仅存在一个Sau3AI位点(图4)。如图 5所示，从BAC 121E10扩增的PCR产物在用Sau3AI消化后产生3条带(582 bp和580bp片段无法在1.2％琼脂糖凝胶上分离)，而来自麻疯树基因组的 产物具有4条带，其中包括来自毒蛋白2A的另外的775bp带。此结果说 明麻疯树基因组中存在毒蛋白1、毒蛋白2和毒蛋白2A。

实施例4：毒蛋白

毒蛋白已通过与ABZ04128相同的毒蛋白2A鉴定。总共有7种不同类 型的毒蛋白(图6)。毒蛋白AAL58089的最初42个氨基酸残基编码信号肽， 此信号肽在成熟蛋白中被切割(Lin et al.，2003a)。此N末端的42个氨基酸 信号肽在全部毒蛋白中是保守的(图6)。在这些毒蛋白中，本研究中鉴定的 毒蛋白1与AAL58089更接近，且二者均属于具有293个氨基酸的1类毒 蛋白(图7)。毒蛋白2A(ABZ04128)，AAR083395和ABW17545属于具有 309个氨基酸的2类毒蛋白。这3种2类毒蛋白在进化上彼此密切相关(图 7)。有趣地，毒蛋白2比2类毒蛋白更接近于1类毒蛋白，如毒蛋白1和 AAL58089(图7)。

实施例5：麻疯树中毒蛋白1和毒蛋白2A的表达

之前的RT-PCR分析表明毒蛋白2在正常发育条件下在麻疯树种子和叶 中不表达。我们随后使用共同的正向引物CF和两个特异反向引物中的任一 种(对于毒蛋白1为C1SR，对于毒蛋白2A为C2ASR)(表1)，通过RT-PCR 在2个组织中确定了毒蛋白1或毒蛋白2A的表达。引物CF覆盖了毒蛋白 1或毒蛋白2A的外显子1和外显子2之间的剪接连接区域。如图8A所示， 毒蛋白1转录物在胚乳中检测到。相反，毒蛋白2A转录物仅存在于叶中。 我们进一步确定毒蛋白1在发育种子的胚乳(图8B)以及不同发育时期或受 昆虫侵扰的叶(图8C)中临时表达。在授粉后第6周(WAP)检测到高水平的毒 蛋白1转录物(图8B)。在2、4和6WAP时未检测到或检测到极低水平的 毒蛋白1转录物(图8B)。毒蛋白2A转录物仅在新叶(YL)中检测到，而未在 完全展开的叶(FL)、老叶(OL)和受粉蚧感染的叶中检测到(图8C)。

实施例6：检测麻疯树中的毒蛋白

制备抗毒蛋白1C末端区域的多克隆抗体。蛋白印迹分析表明毒蛋白1 仅在胚乳中检测到，而毒蛋白2A仅在叶中检测到(图9)。检测到的毒蛋白1 应为分子量约28kDa(MW＝27.8kD)的成熟毒蛋白1(图9)(Lin et al.，2003a， 2003b)。然而，检测到的毒蛋白2A具有约34至35kDa的分子量，且它们 似乎为完整的毒蛋白2A或毒蛋白2A的前体(MW＝34.9kD)(图9)。应提及 的是，通过抗毒蛋白1抗体检测出2种未知的蛋白。一种蛋白具有约39kDa 的分子量大小，且在叶、愈伤组织和种子中检测到，但根中未检测到(图9)。 另一种蛋白具有16kDa的分子量大小，且在种子中检测到(图9)。

实施例7：毒蛋白1和毒蛋白2A的亚细胞定位

毒蛋白的亚细胞定位通过免疫金电镜确定。因为毒蛋白1仅在发育后 期的胚乳中表达，我们采集了6周龄的胚乳组织以用于毒蛋白1的亚细胞 免疫金定位分析。油体和蛋白体是6周龄的胚乳细胞中的两种主要细胞器 (图10A)。在此时期的胚乳细胞内也观察到少数具有淀粉体的质体(图10A)。 通过免疫金电镜中的金粒子表明毒蛋白1仅定位于蛋白体(图10C)。胚乳细 胞之间的细胞壁为初生细胞壁，在此初生细胞壁中未检测到毒蛋白1或仅 检测到背景标记(图10D)。当使用免疫前抗体对照时，未检测到蛋白体的免 疫标记(图10B)。由于抗毒蛋白1抗体也识别麻疯树种子中的16kDa非特 异性蛋白(图9)，所以在此研究中由免疫金电镜检测到得信号应包括此非特 异性识别。

虽然抗毒蛋白1抗体识别来自麻疯树叶的毒蛋白2A和39kDa非特异 性蛋白(图9)，但将其用于通过免疫金电镜分析来检测两种蛋白在麻疯树叶 中的亚细胞定位。免疫金电镜分析表明金粒子免疫定位于叶肉细胞的液泡 内容物(图11D)和叶管状分子的次生细胞壁中(图12C和12D)。毒蛋白2A 和/或39kDa非特异性蛋白在叶管状分子的次生细胞壁中的定位于未成熟 的管状分子中，在此未成熟的管状分子中细胞经历了程序性细胞死亡(图 12A和12C)。在对照实验中，当使用免疫前血清时，在叶肉细胞的液泡内 容物(图11A和11B)或叶管状分子的次生细胞壁(图12B)中未检测到免疫标 记信号或仅检测到背景信号。

实施例8：毒蛋白1和毒蛋白2A启动子的表征

毒蛋白1在发育晚期的胚乳中特异地表达。我们对毒蛋白1启动子中 的植物顺式作用调节DNA元件进行了PLACE分析 (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)。鉴定出参与胚乳特异性 或储存蛋白基因表达的DNA元件。在-1388bp位鉴定出被称为″RY重复 (CATGCAY)″或″豆球蛋白盒″的DNA元件(转录起始位点被指定为+1位)。 豆球蛋白盒发现于诸如大豆(Glycine max)等豆类的种子储存蛋白基因中 (Fujiwara and Beachy，1994)。在-1534bp处鉴定出被称为AACA元件的另一 种DNA元件。AACA元件的核心发现于水稻(Oryza sativa)谷蛋白基因中， 并参与控制胚乳特异性表达(Wu et al.，2000)。在AACA元件的上游，有若 干E盒元件位于-2649bp至-2273bp处。位于-2649bp的其中一个E盒也发 现于油菜籽(Brassica napus)的napA储存蛋白基因中(Stalberg et al.，1996)。 包含全部这些顺式元件(C1P3和C1P4)的毒蛋白1启动子足以驱动胚乳特异 性基因表达(表2，图13A)。E盒元件(C1P2)或E盒元件、豆球蛋白盒和AACA 元件(C1P1)的缺失减弱或消除了胚乳特异性基因表达(表2)。在叶组织中未 检测到毒蛋白1启动子的活性(表2)。

表2：毒蛋白基因启动子的表征

^a空载体pC1300用作阴性对照。pC1305.1中的CaMV35S启动子和pSSZ41中的泛素启 动子(Kolesnik et al.，2004)分别用作胚乳和叶组织中的阳性对照。

^b每个启动子的转录起始位点被指定为+1。“Δ内含子”表明在毒蛋白基因5’UTR处的内 含子已被缺失。

^c对于瞬时GFP分析，通常观察显示瞬时GFP表达的单个细胞。对于瞬时GUS表达分 析，我们仅对蓝色斑点进行计数。一个蓝色斑点被认为是一次成功的递送。

^d对于每次轰击，使用2x2cm²大小的一片叶圆片。对于GUS瞬时分析，轰击25个叶 圆片。即使对于用pC1305.1轰击的阳性对照，也并非全部受轰击的叶圆片显示出表示 GUS活性的蓝色斑点。

毒蛋白2A在麻疯树叶中特异地表达。全部1793bp的毒蛋白2A启动 子从麻疯树中分离。对1793bp片段进行的PLACE研究表明一些光调节的 顺式元件(Terzaghi and Cashmore，1995)存在于毒蛋白1启动子中，这满足了 其在诸如叶等绿色组织中起到有活性的特异性启动子的作用。这些光调节 的顺式元件包括在-64、-548、-590、-712、-768、-861、-916、-1315、-1316、 -1329、-1411、-1539、-1683和-1703位的GT-1结合位点(Villain et al.，1996)， 在-548、-861、-916和-1533位的I盒(Giuliano et al.，1988)，在-454和-1581 位的T盒(Chan et al.，2001)，和在-548、-861、-916、-1093、-1533和-1747 位的GATA盒(Lam and Chua，1989)。虽然并非全部这些推定的顺式元件均 有功能，但这些元件在毒蛋白2A启动子中的存在支持了其作为叶或绿色组 织特异性启动子的功能。PLACE研究在毒蛋白2A启动子中也鉴定出一些 胁迫诱导性顺式元件。这些胁迫诱导性顺式元件包括在-54和-161位的 NPR1类W盒(Yu et al.，2001)，在-702位的ERF3类W盒(Nishiuchi et al.， 2004)，在-160、-261、-702和-1453位的含TGAC的W盒(Eulgem et al.，1999)， 和在-157和-294位的MYB结合位点(Urao et al.，1993)。毒蛋白2A启动子 中这些推定的胁迫诱导性顺式元件的存在提示毒蛋白2A基因可能参与植 物防御。启动子缺失研究表明在-811和-1793位之间毒蛋白2A启动子处的 光调节和胁迫诱导性顺式元件(表2中的C2AP3)是其叶特异性活性所需的 (表2，图13B)。在-811位上游携带顺式元件的毒蛋白2A启动子(C2AP2) 仍具有活性，但丧失其作为叶特异性启动子的特异性，这是因为其仅在胚 乳中具有低水平的活性，而在叶组织中无活性(表2)。

毒蛋白2在正常发育条件下在麻疯树的叶和胚乳中未表达，因为在这 些组织中未检测到毒蛋白2转录物。胚乳或叶组织中的瞬时GFP或GUS 分析在这些组织中也未检测到毒蛋白2启动子的任何活性(表2)。毒蛋白1 和毒蛋白2启动子的3kb DNA序列的DNA比对表明两种启动子仅在毒蛋 白2启动子-1至-275位(毒蛋白1启动子-1至-286位)显示出同源性。毒蛋 白2和毒蛋白2A启动子之间的同源序列起始于毒蛋白2启动子的-1至-1229 位(或毒蛋白2A启动子的-1至-1345位)。虽然对毒蛋白2启动子的PLACE 分析鉴定出许多顺式元件，但其中毒蛋白2启动子独有的2种元件为-269 位的T/G盒(Boter et al.，2004)和-782位的乙烯响应元件(ERE)(Tapia et al.， 2005)。在番茄蛋白酶抑制剂II(pin2)和亮氨酸氨基肽酶(LAP)基因中发现的 T/G盒参与这些基因的茉莉酮酸酯(JA)诱导(Boter et al.，2004)，然而发现 ERE基序介导智利番茄(Lycopersicon chilense)中TLC1.1反转录转座子家族 中U3启动子区域的乙烯诱导的活化(Tapia et al.，2005)。毒蛋白2启动子中 T/G盒和ERE基序的存在提示此基因可通过昆虫袭击时的茉莉酸(JA) (Howe and Jander，2008)和/或防御反应或叶老化期间的乙烯(van Loon，et al.， 2006)来活化。

毒蛋白1和毒蛋白2A在它们的5’UTR中均分别具有227bp和228bp 长度的内含子(图2和4)。毒蛋白2也可具有227bp的内含子(图3)。将长 度多达-2888位的毒蛋白1启动子中的内含子缺失(C1P3D和C1P4D)不影响 它们的活性和特异性(表2)。然而，将长度多达-200位(C1P1D)或-1746位 (C1P2D)的毒蛋白1启动子中的内含子缺失显著增加它们的活性，且突变的 启动子仍保持对胚乳的特异性(表2)。这些结果表明毒蛋白15’UTR中的内 含子抑制其表达。将长度多达-42位的毒蛋白2A启动子的5’UTR中的内含 子缺失(C2AP1D)使得此启动子在胚乳中具有可检测的活性，然而相同长度 的野生型启动子(C2AP1)即使在叶组织中也未显示出任何活性。将毒蛋白 2A启动子C2AP25’UTR中的内含子缺失(C2AP2D)未显著改变其活性，此 活性仅在胚乳中检测到(表2)。最后，将毒蛋白2A启动子C2AP35’UTR中 的内含子缺失(C2AP3D)改变其特异性，且在胚乳而非在叶组织中检测出活 性(表3)。对毒蛋白2A启动子的缺失研究提示毒蛋白2A 5’UTR中的内含子 影响其在叶组织中的活性和特异性。

实施例9：毒蛋白缺陷型转基因麻疯树属植物的生产

利用RNAi策略来敲减转基因麻疯树属植物中的毒蛋白基因表达并生 产毒蛋白缺陷型麻疯树属植物。二元构建体pANDA35HKC1包含在其 T-DNA区域中的RNAi盒(图14)。RNAi盒的表达产生毒蛋白1基因的双链 RNA(dsRNA)。pANDA35HKC1用于麻疯树属转化。初始时，在农杆菌介 导的转化后获得10个独立的T₀转基因植物(L3、L4、L11、L17、L19、L22、 L23、L24、L26和L46)。在移植后，在温室中仅存活下4株植物(L17、L23、 L26和L46)(图15)。

使用Gus连接子探针的DNA印迹分析表明全部4株植物均携带完成的 RNAi盒(图16，未显示L46的数据)。使用Hpt探针的DNA印迹分析显示 它们全部携带单拷贝的T-DNA(图16，未显示L46的数据)。

通过实时PCR检测转基因植物新叶中RNAi盒和毒蛋白2A的表达。 对GUS连接子区域的实时PCR分析表明RNAi盒在4株转基因植物的新叶 中表达(图17A)。实时PCR分析显示L17、L26和L46的新叶中毒蛋白2A 转录物是野生型植物中总毒蛋白2A转录物的20％或更低(图17B)。虽然L23 中RNAi盒的表达可与其它转基因植物中RNAi盒的表达相匹配，但L23 新叶中毒蛋白2A转录物高于L17、L26和L46中毒蛋白2A转录物，而与 野生型植物中毒蛋白2A转录物相类似。

通过使用抗毒蛋白1抗体的蛋白印迹分析进一步确认转基因植物新叶 中毒蛋白2A基因的抑制。在野生型植物中，毒蛋白2A仅在新叶中检测到， 而未在完全展开的叶中检测到(图18)。此结果与以下事实一致，即毒蛋白 2A转录物仅在野生型植物新叶中检测到(图8)。毒蛋白2A未在或难以在转 基因植物L17、L26和L46中检测到(图18)。毒蛋白2A在L23中检测到， 但其在L23中的表达水平低于在野生型植物中的表达水平(图18)。这些结 果表明转基因植物中毒蛋白2A的表达被源自RNAi盒表达的dsRNA部分 或完全抑制。

为了进一步核查T-DNA在转基因麻疯树属植物中的传递，我们使L26 的T₁种子以及来自野生型植物的种子在包含10mg/L潮霉素的选择培养基 上发芽。野生型种子也能够在选择培养基上发芽，但新幼苗在1周内死亡(图 19)。L26的50个T₁种子在选择培养基上发芽，且36株幼苗对潮霉素有抗 性(图19)。L26携带单拷贝的T-DNA，且潮霉素抗性和潮霉素敏感性的分 离符合单个基因遗传的孟德尔比率(χ²＝0.240；0.5＜P＜0.8；df＝1)。此结果表 明pANDA35HKC1中的T-DNA区域已经稳定地整合入麻疯树属基因组中， 并传递至转基因植物的子代。

总之，我们已经表征了3种毒蛋白基因的启动子。长度多达-2888位的 野生型毒蛋白1启动子对其胚乳中的高且特异的活性足以，然而长度多达 -1793位的分离的毒蛋白2A启动子在叶组织中具有特异活性。通过使用 RNAi技术抑制毒蛋白基因表达来生产毒蛋白缺陷型转基因麻疯树属植物。 毒蛋白缺陷型麻疯树属转基因植物可用于今后的育种项目。

除非特别指出或者上下文明确相反，否则本发明描述内容(特别是权利 要求的上下文中)中，术语一摂、所述摂和类似词语应理解包括单数和复数。 除非另外提到，否则术语“包括”、“具有”、“含有”、“包含”被认为是开 放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)。文中数值范围的列举仅仅是充 当范围内每个单独数值一个一个提到的简写方法，除非特别指出，否则每 个单独值并入说明书，如同每个单独在此提到。例如，如果公开了范围 10-15，那么11、12、13和14也被公开了。除非特别指出或者上下文明确 相反，否则文中描述的所有方法能以任何适宜顺序进行。任何实施例的使 用，或者文中提供的举例语言(例如“诸如”)，除非文中要求保护，否则 仅仅为了更好说明本发明，并不限制本发明范围。说明书语言不应解释为 代表任何未要求的元素对于实践本发明而言是必不可少的。

应意识到本发明的方法和组合物包括各种形式的实施方案，本文仅仅 公开了一小部分。本发明文中描述的实施方案包括本发明人已知的实施本 发明的最好方式。本领域普通技术人员在阅读以上描述的基础上可显而易 见实施方案的变化。本发明人期望技术人员可以适当应用这些改变，且可 以本文所述不同的方式实施本发明。相应地，本发明包括适用法律允许的 在所附权利要求中所述主题的所有修改和等价物。此外，除非特别指出或 者上下文明确相反，则上述元素的所有可能范围内的任意变化组合均包含 在本发明内。

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