具有D-乳酸脱氢酶活性的多肽、编码该多肽的多核苷酸和D-乳酸的制造方法

摘要

为了表达具有高于现有技术的D-乳酸脱氢酶活性的下述(A)～(C)的任一多肽，通过将编码该多肽的多核苷酸导入宿主细胞而得的转化体，来实现生产性高的D-乳酸发酵。(A)包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多肽；(B)包含在序列号1或2所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列、且具有D-乳酸脱氢酶活性的多肽；(C)包含与序列号1或2所记载的氨基酸序列的序列同一性至少为80％以上的氨基酸序列、且具有D-乳酸脱氢酶活性的多肽。

说明书

技术领域

本发明涉及用于制造D-乳酸的新的具有D-乳酸脱氢酶活性的多肽、 编码该多肽的多核苷酸和导入了该多核苷酸的转化体，还涉及包含培养该 转化体的步骤的D-乳酸的制造方法。

背景技术

以作为可再生资源的生物质为原料的聚乳酸(PLA)从碳中和的考虑受 到强烈关注。PLA成本比较的低，熔点也约为170℃具有耐热性，被期待 作为可溶融成型的生物降解性聚合物。而且，已知通过混合聚-L-乳酸和聚 -D-乳酸，可获得聚乳酸立构复合物(专利文献1～3)。已知聚乳酸立构复 合物与单独的聚合物相比显示高熔点和高结晶性，作为纤维、膜、树脂成 型品而可制成有用的成型品，作为其原料的L-乳酸、D-乳酸均要求高纯度 且高效率的制造方法。

自然界存在乳酸菌等高效地生产乳酸的细菌，有的已经在使用它们的 乳酸制造方法的中被实用化。例如，作为高效地生产L-乳酸的细菌，有德 氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)等。另外，作为高效地生产D-乳酸的 细菌，已知Sporolactobacillus laevolacticus的微生物等(专利文献4)。任一 情况下均通过厌氧培养而乳酸的积累量达到高水平，但作为副产物，在L- 乳酸发酵时生成D-乳酸，在D-乳酸发酵时生成L-乳酸，造成光学纯度降 低。而且，分离这些副产物非常困难。

这里，作为高光学纯度的乳酸的制造方法，研究了在本来不具有乳酸 生产能的酵母中导入编码L-乳酸或D-乳酸脱氢酶的基因，使用该酵母的 L-乳酸和D-乳酸发酵(专利文献4～6、非专利文献1)。关于利用基因重组 酵母的L-乳酸发酵，通过导入编码高活性的来源于爪蟾的L-乳酸脱氢酶的 基因，可以实现高效率且高光学纯度的乳酸发酵(专利文献4)。另一方面， 关于利用基因重组酵母的D-乳酸发酵，虽然可得到与L-乳酸发酵同样高光 学纯度的D-乳酸，但D-乳酸收率存在课题(专利文献5和6、非专利文献 1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开昭61-36321号公报

专利文献2：特开昭63-241024号公报

专利文献3：特开平2000-17163号公报

专利文献4：WO2007/043253

专利文献5：特开2007-074939号公报

专利文献6：WO2004/104202

非专利文献

非专利文献1：Ishida N，Journal biosci bioeng(2006)，101，172-7.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题是通过具有高于现有技术的D-乳酸脱氢酶活性的多肽 和编码该多肽的多核苷酸，来实现生产性高的D-乳酸发酵。

用于解决课题的方法

本发明者们对于各种D-乳酸脱氢酶进行了深入研究，结果发现了使 D-乳酸的产生量增大、同时副产物生成少的具有D-乳酸脱氢酶活性的多肽 和编码该多肽的多核苷酸，从而完成了本发明。

即，本发明包括以下方式。

(1)下述(A)～(C)的任一多肽，

(A)包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多肽，

(B)包含在序列号1或2所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/ 或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并具有D-乳酸脱氢酶活性的多 肽，

(C)包含与序列号1或2所记载的氨基酸序列的序列同一性至少为80 ％以上的氨基酸序列，并具有D-乳酸脱氢酶活性的多肽。

(2)下述(a)～(e)的任一多核苷酸，

(a)包含序列号3或4所记载的碱基序列的多核苷酸，

(b)包含在序列号3或4所记载的碱基序列中置换、缺失、插入和/或 添加了1个或数个碱基的碱基序列，并编码具有D-乳酸脱氢酶活性的多肽 的多核苷酸，

(c)与包含序列号3或4所记载的碱基序列的多核苷酸或其互补链的全 部或其一部分在严格条件下杂交、且编码具有D-LDH活性的多肽的多核 苷酸，

(d)包含与序列号3或4所记载的碱基序列的序列同一性至少为80％ 以上的碱基序列、且编码具有D-乳酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸，

(e)编码(1)所述的多肽的多核苷酸。

(3)DNA构建体，是使(2)所记载的多核苷酸与能表达该多核苷酸的启动 子连接而得的。

(4)根据(3)所述的DNA构建体，其特征在于，所述启动子是丙酮酸脱 羧酶1基因(PDC1基因)、指数缺陷的抑制1基因(SED1基因)或甘油醛-3- 磷酸脱氢酶3基因(TDH3基因)的启动子。

(5)根据(3)或(4)所述的DNA构建体，其中，所述启动子选自下述(I)～ (III)中的任一项，

(I)包含序列号5～7的任一项所记载的碱基序列的启动子，

(II)包含下述碱基序列的启动子，所述碱基序列与包含序列号5～7的 任一项所记载的碱基序列或其一部分的碱基序列在严格条件杂交，

(III)包含在序列号5～7的任一项所记载的碱基序列中缺失、置换和/ 或添加了1个或数个碱基的碱基序列的启动子。

(6)转化体，其中，导入有(2)所述的多核苷酸或(3)～(5)的任一项所述 的DNA构建体。

(7)转化酵母，其中，导入有(2)所述的多核苷酸或(3)～(5)的任一项所 述的DNA构建体。

(8)根据(7)所述的转化酵母，所述转化酵母的丙酮酸脱羧酶1基因 (PDC1基因)、指数缺陷的抑制1基因(SED1基因)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶 3基因(TDH3基因)中的至少1种基因，被置换成(2)所述的多核苷酸或(3)～ (5)的任一项所述的DNA构建体。

(9)根据(8)所述的转化酵母，所述基因中的至少1种基因是PDC1基 因。

(10)D-乳酸的制造方法，包括培养(6)所述的转化体或(7)～(9)的任一项 所述的转化酵母的工序。

(11)转化体，其中，导入了编码来源于鲎科的D-乳酸脱氢酶的多核苷 酸或连接有该多核苷酸和能够表达该多核苷酸的启动子的DNA构建体。

(12)转化酵母，其中，导入了编码来源于美洲鲎属的D-乳酸脱氢酶的 多核苷酸或连接有该多核苷酸和能够表达该多核苷酸的启动子的DNA构 建体。

(13)根据(12)所述的转化酵母，所述转化酵母的丙酮酸脱羧酶1基因 (PDC1基因)、指数缺陷的抑制1基因(SED1基因)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶 3基因(TDH3基因)中的至少1种基因，被置换成所述编码来源于鲎科的 D-乳酸脱氢酶的多核苷酸或连接有该多核苷酸和能够表达该多核苷酸的启 动子的DNA构建体。

(14)D-乳酸的制造方法，包括培养(11)所述的转化体或者(12)或(13)所 述的转化酵母的工序。

发明的效果

根据本发明，提供适合D-乳酸发酵生产的具有D-乳酸脱氢酶活性的 多肽和编码该多肽的多核苷酸。另外，通过本发明的多核苷酸可以容易地 获得能够高产D-乳酸的转化体，而且通过培养该转化体可以高效且高纯度 地生产D-乳酸。

附图说明

图1是表示本发明的酵母SU042株之一的制作步骤的图。

图2是表示本发明的酵母SU042株的利用膜的连续培养结果的图。

具体实施方式

以下对于本发明的实施方式进行详细说明。

D-乳酸脱氢酶(以下也称为D-LDH)活性，是将还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸(NADH)和丙酮酸转换成D-乳酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)的活性。

本发明的特征在于，含有包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多 肽或其类似物(homolog)，该多肽具有D-LDH活性。

包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多肽是来源于属于鲎科 (Lomulidae)美洲鲎属(Limulus)的美洲鲎(Limulus polyphemus)的多肽。

作为包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多肽的类似物，可列举 例如，具有在序列号1或2所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/ 或添加1个或数个、优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1 或2个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有D-LDH活性的多肽。

另外，序列号3或4所记载的多肽的类似物可以是具有与序列号1或 2所记载的氨基序列的序列同一性为至少80％以上、优选为90％以上、更 优选为95％以上的氨基酸序列、且具有D-LDH活性的多肽。此外，氨基 酸序列的序列同一性可以使用作为本领域通用软件的BLAST容易地研究。 BLAST任何人都可以在NCBI(美国国家生物技术信息中心，National  Center for Biotechnology Information)的主页上使用，使用默认的参数可以 容易地研究同一性。

另外，包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多肽的类似物可以是 来源于属于鲎科的生物、优选为来源于属于美洲鲎属或鲎属的生物、更优 选为来源于美洲鲎属的美洲鲎(Limulus polyphemus)或鲎属的东方鲎 (Tachypleus tridentatus)、南方鲎(Tachypleus gigas)或圆尾鲎(Tachypleus  rotundicauda)、且具有D-LDH活性的多肽。

包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多肽可以通过公知的方法从 美洲鲎中提取，或者使用作为肽合成法公知的方法来制备，另外，还可以 使用编码序列号1或2所记载的氨基酸序列的多核苷酸通过基因重组技术 来制备。包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多肽可以通过公知的方 法从属于鲎属的生物中提取，或者使用作为肽合成法公知的方法来制备， 另外，还可以使用编码该多肽的氨基酸序列的多核苷酸通过基因重组技术 来制备。

包含序列号1或2所记载的氨基酸序列的多肽的类似物，与包含序列 号1或2所示氨基酸序列的多肽相比，可以D-LDH活性提高，也可以热 稳定性提高。这里，所谓“D-LDH活性提高”，是指对作为底物的丙酮酸 和/或NADH的底物亲和性和/或分子活性(Kcat)提高，和/或另外，该多肽 的酶活性的最适pH值向适合表达该多肽的细胞的生长的pH值靠近。这 样的多肽可以基于包含序列号1或2所示氨基酸序列的多肽人工地设计， 可以从天然分离。另外，可以通过分子进化工程学方法对D-乳酸脱氢酶基 因随机地引入突变，由此筛选优选的多肽。

本发明的特征在于，含有包含序列号3或4所记载的碱基序列的多核 苷酸或其类似物，该多核苷酸编码具有D-LDH活性的多核苷酸。这里， “多核苷酸”可以是任何来源的cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、 合成RNA、复制子RNA等，优选为DNA或RNA，更优选为DNA。另外， 可以是单链也可以是具有其互补链的双链。另外，还可以含有天然的或人 工的核苷酸衍生物。

包含序列号3或4所记载的碱基序列的多核苷酸的特征在于，是来源 于美洲鲎的多核苷酸，编码所述具有D-LDH活性的多肽。

作为序列号3或4所记载的多核苷酸的类似物，可列举例如，包含在 序列号3或4所记载的碱基序列中置换、缺失、插入和/或添加1个或数个、 优选为1～40个、更优选为1～30个、进一步优选为1～20个、特别优选 为1～10个、最优选为1～5个碱基而得的碱基序列、且同时编码具有 D-LDH活性的多肽的多核苷酸。

另外，作为序列号3或4所记载的多核苷酸的类似物，可列举与包含 序列号3或4所记载的碱基序列的多核苷酸或其互补链的全部或其一部分 在严格条件下杂交、同时编码具有D-LDH活性的多肽的多核苷酸。这里， 所谓“在严格条件下杂交的多核苷酸”，例如，以选择了一个或多个原碱 基序列的任意至少20个、优选为25个、更优选为至少30个连续的序列的 多核苷酸作为探针，使用公知的杂交技术(Current Protocols I Molecular  Biology edit.Ausubel et al.，(1987)Publish.John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4)等杂交的多核苷酸。这里作为严格条件，例如，通过在50％甲酰胺 存在下在杂交温度为37℃、作为更严格的条件为42℃、作为进一步严格的 条件为65℃下，使用0.1～2倍浓度的SSC(saline-sodium citrate)溶液(1 倍浓度的SSC溶液的组成：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)进行洗涤 来实现。

另外，序列号3或4所记载的多核苷酸的类似物可以是包含相对于序 列号3或4所记载的碱基序列具有至少80％以上、更优选为90％以上、进 一步优选为95％以上的序列同一性的碱基序列、同时编码具有D-LDH活 性的多肽的多核苷酸。这里所谓的多核苷酸的碱基序列的序列同一性通过 上述基因分析程序BLAST等来确定。

另外，序列号3或4所记载的多核苷酸的类似物还可以是来源于属于 鲎科的生物、优选为来源于属于美洲鲎属或鲎属的生物、更优选为来源于 美洲鲎、东方鲎、南方鲎或圆尾鲎、且编码具有D-LDH活性的多肽的多 核苷酸。

所述多核苷酸可以从属于鲎科、优选为鲎科美洲鲎属的生物(以下将它 们总称为鲎)克隆来制备，但也可以采用化学合成或作为长链DNA的合成 方法已知的藤本等的方法(藤本英也，合成遺伝子の作製法、植物細胞工学 シリ一ズ7植物のPCR実験プロトコ一ル(合成基因的制作法、植物细 胞工程学系列7植物的PCR实验方案)、1997、秀润社、第95-100页)来 合成。从鲎的克隆，可以使用通常公知的方法来分离，作为这样的方法， 例如，由从鲎血细胞分离的polyA(+)RNA制作的cDNA，使用以在D-乳 酸脱氢酶中高度保守的序列为基础合成的引物进行部分片段的扩增、序列 确定，然后通过5’RACE和3’RACE法确定全ORF序列，然后通过PCR 扩增来获得。另外，还可以通过D-乳酸脱氢酶的功能互补来进行。其原理 详细记载于(DOMINIQUE，G.，Appl Environ Microbiol，United States (1995)61 266-272)。这样，一旦具有确定的碱基序列的本发明的多核苷酸 可以再次从鲎血细胞获得，也可以将其直接用DNA合成装置进行化学合 成。

此外，所述多肽或多核苷酸可以通过在氨基酸序列或碱基序列中使用 位点特异性变位导入法(Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel etal.，(1987)Publish.John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5)等适宜导 入置换、缺失、插入、和/或添加突变来适宜改变。另外，这样的多肽的氨 基酸序列或多核苷酸的碱基序列的改变不限于人工导入或合成突变的改 变，也包含基于人工的突变处理或通过不限于此的自然界中的氨基酸突变 来生成的改变。

所述多核苷酸可以用于通过基因重组来制作D-乳酸产生细胞。为了使 通过基因重组而导入了本发明的多核苷酸的宿主细胞(以下也称为转化体) 产生D-乳酸，需要在转化体内表达由该多核苷酸所编码的具有D-LDH活 性的多肽，此时，作为表达具有D-LDH活性的多肽的方法之一，利用连 接有能够表达该多核苷酸的启动子的DNA构建体、即在该启动子的3’末 端侧连接有该多核苷酸的DNA构建体是有用的，该DNA构建体也包含在 本发明中。本发明的DNA构建体，通过将本发明的多核苷酸(DNA)、和能 够表达该多核苷酸的启动子分别用适当的限制性酶切割，插入到后述的载 体DNA的限制性酶位点或多克隆位点进行连接的方法，和/或将本发明的 多核苷酸(DNA)与该启动子通过PCR连接的方法来制作。

作为所述DNA构建体的优选方式，使该DNA构建体在质粒(DNA)、 噬菌体(DNA)、反转录转座子(DNA)、人工染色体(YAC、PAC、BAC、 MAC等)等的载体中保持。根据该DNA构建体的导入形态(宿主基因组内 或宿主基因组外)和/或宿主细胞的种类，适宜选择本领域中公知的原核细 胞性载体、真核细胞性载体、动物细胞性载体或植物细胞性载体。

此外，作为质粒，可列举例如，pRS413、pRS415、pRS416、YCp50、 pAUR112或pAUR123等YCp型大肠杆菌-酵母穿梭载体、pYES32或 YEp13等YEp型大肠杆菌-酵母穿梭载体、pRS403、pRS404、pRS405、 pRS406、pAUR101或pAUR135等YIp型大肠杆菌-酵母穿梭载体、来源 于大肠杆菌的质粒(pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、 pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396或pTrc99A等ColE系质 粒、pACYC177或pACYC184等p1A系质粒、pMW118、pMW119、 pMW218或pMW219等pSC101系质粒等)、来源于枯草杆菌的质粒(例如， pUB110、pTP5等)等。作为噬菌体，可列举λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、 EMBL3、EMBL4、λgt100、gt11、zap)、M13mp18或M13mp19 等。作为反转录转座子，可列举Ty因子等。作为YAC，可列举pYACC2 等。

所述DNA构建体中的“启动子”，意味着参与从基因的mRNA转录 起始的碱基序列，通常是指存在于染色体中的基因的5’末端侧的上游序列。 作为启动子的碱基序列长，优选为1～3000bp、更优选为1～1000bp，只 要是能够使存在于下游的基因的mRNA的转录起始的碱基序列即可，不特 别限制。另外，提高启动子的转录活性的突变和/或操作是公知的，“启动 子”中包含通过公知的方法改变而得的启动子。所述DNA构建体中的启 动子只要在导入了该DNA构建体的转化体内具有启动子活性即可，不特 别限制，如后所述，由于本发明的DNA构建体优选被导入酵母，因此优 选是在酵母中发挥功能的启动子。

作为在酵母中发挥功能的启动子的优选例，可列举酸性磷酸酶基因 (PHO5)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH1，2，3)、醇脱氢酶基因(ADH1， 2，3，4，5，6，7)基因、半乳糖代谢系基因(GAL1，7，10)、细胞色素c 基因(CYC1)、磷酸丙糖异构酶基因(TPI1)、磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)、 磷酸果糖激酶基因(PFK1)、丙酮酸脱羧酶基因(PDC1，5，6)的启动子，在 国际申请PCT/JP2008/072129中被记载、利用的、作为在酵母培养开始后 50小时以后的基因表达量为全基因的平均相对表达量的5倍以上的启动子 的、烯醇化酶1基因(ENO1)、细胞壁关联蛋白质2基因(CWP2)、指数缺 陷的抑制1基因(SED1)的启动子。

作为在酵母中发挥功能的启动子的更优选例，可列举在酵母的乙醇发 酵途径中高表达的PDC1启动子或TDH3启动子，或在长时间的酵母培养 时高表达的SED1启动子，更具体可列举，序列号5所记载的PDC1启动 子、序列号6所记载的SED1启动子或序列号7所记载的TDH3启动子。

另外，PDC1启动子、SED1启动子或TDH3启动子在具有该启动子 活性的范围内，可以是在序列号5～7的任一项所记载的碱基序列中缺失、 置换和/或添加1个或数个、优选为1～40个、更优选为1～30个、进一步 优选为1～20个、特别优选为1～10个、最优选为1～5个碱基序列而得的 碱基序列。

另外，PDC1启动子、TDH3启动子或SED1启动子在具有该启动子 活性的范围内，还可以是与包含序列号5～7的任一项所记载的碱基序列或 其一部分的碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列。这里，所谓“在严格 条件下杂交的多核苷酸”，例如，以选择了一个或多个原碱基序列的任意 至少20个、优选为25个、更优选为至少30个连续的序列的多核苷酸作为 探针，使用本领域技术人员公知的杂交技术(Current Protocols I Molecular  Biology edit.Ausubel et al.，(1987)Publish.John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4)等杂交的多核苷酸。这里作为严格条件，例如，通过在50％甲酰胺 存在下在杂交温度为37℃、作为更严格的条件为42℃、作为进一步严格的 条件为65℃下，使用0.1～2倍浓度的SSC(saline-sodium citrate)溶液(1 倍浓度的SSC溶液的组成：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)进行洗涤 来实现。

将所述多核苷酸或DNA构建体导入宿主细胞而得的转化体也包含在 本发明中。作为宿主细胞，只要是稳定保持该多核苷酸或DNA构建体的 细胞即可，不特别限制，可列举大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌等细菌、酵 母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞，因为酵母为耐酸性，在由于表达具 有D-LDH活性的多肽而高产D-乳酸的情况下也可以生长，所以优选使用。

作为酵母，可列举属于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属 (Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenura)、亚罗酵母属 (Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、 德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、伊萨酵母属(Issachenkia)、Fellomyces 属的酵母，优选为属于酵母属、假丝酵母属或克鲁维酵母属的酵母，更优 选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或产朊假丝酵母(Candida utilis)、 光滑假丝酵母(Candida glabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)、博伊丁 假丝酵母(Candida boidinii)、Candida sonorensis或乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。

另外，如果酵母为多倍体酵母，则可以在简便的操作条件下长时间稳 定地维持D-乳酸的高生产性，从而可以以低成本稳定地生产D-乳酸，因 此在本发明中优选使用。这里，“多倍体酵母”是指细胞内具有2组以上 染色体的酵母。对多倍体酵母的染色体的组数不特别限制，优选为具有2 组染色体的2倍体酵母。多倍体酵母可列举例如，在发酵工业中常用的面 包酵母、清酒酵母、红酒酵母、啤酒酵母等酵母等。所使用的多倍体酵母 可以是从自然环境中分离出的，还可以是通过突变和/或基因重组来改变其 一部分性质而得的。

另外，如果酵母为非营养缺陷型，则在可以使用营养素比现有技术少 的培养基、即低成本的培养基的同时，可以在简便的操作条件下长时间稳 定地维持D-乳酸的高生产性，从而可以以低成本稳定地生产乳酸，因此在 本发明中优选使用。这里，“营养缺陷型”意味着，野生型酵母所具有的 营养合成基因中由于某些原因而发生了突变，结果缺失了该营养的合成能 力。即，“非营养缺陷型酵母”是不具有显示营养缺陷型的基因型，或者 营养缺陷型被互补的酵母。作为恢复营养缺陷型酵母的营养缺陷型而制作 非营养缺陷型酵母的方法，可列举：通过基因重组方法导入营养合成基因， 使营养缺陷型恢复的方法；以及重复使具有不同营养缺陷型的酵母彼此接 合、形成子囊，从而使目标的营养缺陷型恢复的过程，最终使营养缺陷型 全部恢复，制成非营养缺陷型酵母的方法等。此外，作为是否是非营养缺 陷型酵母的判定方法，可以以是否能够在作为酵母的基本培养基的SD培 养基中生长作为判断基准。

另外，酵母是旺盛地进行乙醇发酵的微生物，其代谢途径是将作为糖 酵解途径产物的丙酮酸用丙酮酸脱羧酶转换成乙醛，再将该乙醛用醇脱氢 酶转换成乙醇。因此，通过以作为乙醇代谢途径起点的丙酮酸脱羧酶基因 被破坏的酵母株作为宿主，可以将本来应在乙醇代谢途径中被代谢的丙酮 酸用于D-乳酸代谢途径，因此是优选的。

特别是在酿酒酵母的情况下，编码丙酮酸脱羧酶的基因中存在丙酮酸 脱羧酶1(PDC1)基因、丙酮酸脱羧酶5(PDC5)基因、和丙酮酸脱羧酶6 (PDC6)基因的3种基因，其中仅PDC1和PDC5被指出在酵母细胞内具有 丙酮酸脱氢酶活性，因此优选使用PDC1基因或PDC5基因被破坏的菌株， 更优选使用PDC1基因被破坏的菌株。另外，在PDC1基因被破坏的菌株 中，如特开2008-048726号公报所记载的那样，优选具有带有使得PDC5 活性降低的突变的突变型PDC5基因的菌株，更优选具有温度敏感性的突 变型PDC5基因的菌株。这里，“温度敏感性的突变型PDC5”是指，具 有与野生型PDC5相比，在某培养温度下显示相同程度的丙酮酸脱羧酶活 性，但如果改变培养温度使其为特定培养温度以上，则显示PDC5活性消 失或降低的性质的突变型PDC5。酿酒酵母的通常培养温度为28～30℃， 显示温度敏感性的温度越接近通常的培养温度，则改变培养温度所需的热 量可以越少，越可以降低培养成本，因此是优选的。具体来说，温度敏感 性突变型PDC5优选在34℃以上显示温度敏感性。

作为将所述多核苷酸或DNA构建体导入酵母、并在转化酵母内表达 具有D-LDH活性的多肽的方法，可列举如上所述的将包含该DNA构建体 的载体导入酵母染色体外的方法、将该多核苷酸或DNA构建体导入酵母 染色体的方法，均可以采用。

作为将所述多核苷酸导入酵母染色体的方法，本发明的多核苷酸优选 使用具备作为与酵母染色体相同的序列的同源重组用DNA片段的构建体 (以下也称为同源重组用DNA构建体)。同源重组用DNA片段是与酵母染 色体中要导入本发明的多核苷酸的靶部位附近的DNA序列同源的DNA序 列。同源重组用DNA片段至少具备1个，优选具备2个。在具备2个同 源重组用DNA片段的情况下，优选将2个同源重组用DNA片段作为与染 色体上的靶部位的上游侧和下游侧的DNA相同的DNA序列，在这些DNA 片段之间连接本发明的多核苷酸。

对通过同源重组用DNA构建体来进行同源重组的方法不特别限制， 可采用通过PCR来扩增同源重组用DNA构建体，将该PCR片段插入质 粒并导入酵母的方法，将该PCR片段导入酵母的方法。另外，同源重组用 DNA构建体中优选包含用于控制本发明的多核苷酸的表达的终止子。这 里，“终止子”是指使从基因的mRNA转录终结的序列，通常是指存在于 染色体中的基因的3’末端侧的下游序列。

另外，同源重组用DNA构建体中除了包含本发明的多核苷酸或DNA 构建体之外，为了容易地进行转化酵母的选择，优选还包含选择标记。作 为这里所谓的选择标记，可列举URA3或TRP1等营养缺陷型互补基因或 G418耐性基因或新霉素耐性基因等耐药性基因。

通过PCR来制备包含所述多核苷酸、终止子和选择标记的同源重组用 DNA构建体的方法，例如可以通过下述步骤1～3的工序来进行。

步骤1：以在本发明的多核苷酸的下游连接有终止子的质粒作为模板， 以引物1、2为引物组，通过PCR来扩增包含本发明的多核苷酸和终止子 的片段。引物1设计成添加与导入目标位置的上游侧同源的序列40bp以 上那样，引物2以终止子的下游的来源于质粒的序列为基础来设计。

步骤2：以具有选择标记的质粒、例如pRS400、pRS424、pRS426等 为模板，以引物3、4为引物组，通过PCR来扩增包含选择标记的片段。 引物3设计成添加与步骤1的PCR片段的终止子的下游的序列具有同源性 的序列为30bp以上那样，引物4设计成在其中添加与导入目标位置的下 游侧相当的序列40bp以上那样。

步骤3：将步骤1、2所得PCR片段混合作为模板，以引物1、4为引 物组进行PCR，从而得到在两末端添加了相当于导入目标位置的上游侧和 下游侧的序列的、包含本发明的多核苷酸、终止子和酵母选择标记的同源 重组用DNA构建体。

为了将所述同源重组用DNA构建体导入酵母，可以使用转染、共转 染或电穿孔等方法。具体来说，例如有使用乙酸锂的方法、原生质体法等。

在通过同源重组在酵母染色体中导入所述多核苷酸的情况下，可以导 入成该多核苷酸可通过酵母染色体上的固有基因的启动子来控制那样。这 种情况下，还可以通过所述多核苷酸的导入同时破坏本来应被该启动子控 制的固有基因，从而代替该固有基因而表达外来的本发明的多核苷酸。本 方法特别是在该启动子是如上所述在酵母中高表达的启动子的情况下、破 坏以抑制酵母的D-乳酸代谢途径的方式发挥功能的固有基因的情况下是 有用的。

作为将所述多核苷酸导入酵母染色体时的靶的固有基因，可列举酸性 磷酸酶基因(PHO5)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH1，2，3)、醇脱氢酶 基因(ADH1，2，3，4，5，6，7)、半乳糖代谢系基因(GAL1，7，10)、细 胞色素c基因(CYC1)、磷酸丙糖异构酶基因(TPI1)、磷酸甘油酸激酶基因 (PGK1)、磷酸果糖激酶基因(PFK1)、丙酮酸脱羧酶基因(PDC1，5，6)作 为优选例。另外，国际申请PCT/JP2008/072129中记载、利用的、在酵母 培养开始后50小时以后基因表达量为全基因的平均相对表达量的5倍以上 的烯醇化酶1基因(ENO1)、细胞壁关联蛋白质2基因(CWP2)、指数缺陷 的抑制1基因(SED1基因)的启动子也可作为优选例列举。特别是在酵母的 乙醇发酵途径中高表达的PDC1基因或TDH3基因、或长时间的酵母培养 时高表达的SED1基因可作为更优选的例子列举，另外如上所述，通过以 至少破坏作为乙醇发酵途径起点的PDC1基因或PDC5基因、优选为PDC1 基因的方式导入所述多核苷酸，可以将在乙醇发酵途径中代谢的丙酮酸用 于D-乳酸代谢途径，因此是进一步优选的。

另外，作为将所述DNA构建体导入酵母染色体的方法，可以与上述 将多核苷酸导入酵母染色体的情况同样地制成同源重组用DNA构建体， 通过同源重组导入目标染色体上的位置。此外，由于所述DNA构建体已 经包含能够表达所述多核苷酸的启动子，因此没有必要导入使得所述多核 苷酸能够由酵母染色体上的固有基因的启动子控制。

此外，酵母染色体上的所需的位置是否导入了所述多核苷酸或DNA 构建体的确认可以通过PCR法、DNA杂交(Southern hybridization)法来 进行。例如，从转化酵母制备DNA，通过导入位点特异性引物来进行PCR， 对于PCR产物，通过在电泳中检测预期的条带来确认。或者也可以通过用 荧光色素等标记的引物来进行PCR来确认。这些方法在本领域技术人员中 是公知的。

包括培养所述转化体的工序的D-乳酸的制造方法也包含在本发明中。 如果培养所述转化体，则该转化体内具有D-LDH活性的多肽的表达被新 赋予或增强，D-乳酸代谢途径被新赋予或增强，其结果是可通过实施从培 养物中分离D-乳酸的工序来获得D-乳酸。培养物包含培养上清、以及转 化体或转化体的破碎物。

对所述转化体的培养方法不特别限制，可采用公知的方法。例如，作 为所述转化酵母的培养方法，可以使用“M.D.Rose et al.，“Methods In  Yeast Genetics”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)”等记载的方 法。此外，在包含所述DNA构建体的质粒、同源重组用DNA构建体中包 含选择标记的情况下，可以通过在适应选择标记的营养非添加培养基或药 剂添加培养基中培养来选择所需的转化体。

作为培养所述转化体的培养基，只要是含有该转化体能够同化的碳源、 氮源、无机盐类等、能够有效地进行该转化体的培养的培养基即可，可以 使用天然培养基、合成培养基的任一种。例如，在转化酵母的情况下，作 为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、棉子糖、海藻 糖、山梨糖、纤维二糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、菊粉、木糖、阿拉伯糖、 核糖、鼠李糖、葡糖胺、赤藓糖醇、核糖醇、甘露糖醇、葡糖醇、水杨苷、 淀粉(starch)、淀粉等碳水化合物、乙酸、丙酸、柠檬酸等有机酸、乙醇、 丙醇等醇。作为氮源，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等 无机酸或有机酸的铵盐或其他含氮化合物、以及胨、肉提取物、玉米浆等。 作为无机物，可以使用磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、 硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

所述转化体的培养，通常在从振荡培养或通气搅拌培养等的好氧条件 下、至不进行通气的厌氧条件下的范围内，设定乳酸的生产性良好的条件， 优选使用从微好氧至厌氧的条件。培养温度可以在25～37℃进行，优选在 28～35℃进行。由于随着D-乳酸在培养基中积累培养物的pH值降低，因 而还可以用氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、氨气等碱性 物质中和。另外为了使后段中的乳酸的纯化容易，也可以不进行中和地培 养。另外，作为培养方法，只要是能够发酵生产作为目标的D-乳酸的方式 即可，不特别限制，可以采用分批培养、补料分批培养、恒化器培养、连 续培养等。优选为分批培养，或者WO2007/097260所记载的利用膜的连续 培养，该利用膜的连续培养是，利用不易引起堵塞的膜从而通过分离膜将 发酵培养物分离成滤液和未过滤液，在从滤液回收所需的发酵生产物的同 时，使未过滤液保持或回流至发酵培养物中。

对所述培养物中获得的D-乳酸的测定法不特别限制，例如，有使用 HPLC的方法、使用F-试剂盒(ロシユ社制)的方法等。

所述发酵培养物中所含的D-乳酸的分离、纯化可以组合现有技术中已 知的浓缩、蒸馏和晶析等方法来进行，可列举例如：使过滤、分离发酵液 的pH值为1以下，然后用乙醚、乙酸乙酯等提取的方法；在离子交换树 脂中吸附洗涤然后溶出的方法；在酸催化剂存在下使其与醇反应而作为酯 蒸馏的方法；作为钙盐、锂盐进行晶析的方法；WO2009/004922所公开的 组合纳滤膜和蒸馏的分离、纯化方法等。

实施例

以下用实施例说明本发明的实施方式，但这些是本发明的例示，并不 限制本发明。

(实施例1)来源于美洲鲎的编码具有D-LDH活性的多肽的多核苷酸 (以下称为来源于美洲鲎的D-LDH基因)的碱基序列确定

为了制作美洲鲎的cDNA，进行polyA(+)RNA的纯化。polyA(+)RNA 从美洲鲎的血细胞中分离出。从美洲鲎(从Marine Biological Laboratory (USA)购入)的血细胞，使用AGPC法(参照实验医学Vol.9(1991)、1937-1940 页)分离总RNA。使用分离的总RNA，使用“Oligotex-dT30 Super试剂 盒”(タカラバイオ社制)来分离polyA(+)RNA。接着，使用“SuperScript II Reverse Transcriptase”(インビトロジエン社制)以Oligo d(T)为引物合成 cDNA。接着，使用该反应液作为模板，以关注在D-LDH基因中高度保守 的DNA序列设计出的序列号8和序列号9所记载的寡聚DNA为引物进行 PCR，扩增来源于美洲鲎的D-LDH基因的部分序列。PCR在以下条件下 进行。95℃(3分钟)：{95℃(30秒)-45℃(30秒)-72℃(30秒)}×35循环：72℃ (5分钟)。接着通过使用1.0％琼脂糖凝胶的电泳来进行扩增DNA片段的确 认，使用“QIA quick Gel extraction kit”(株式会社キアゲン制)纯化600bp 的扩增片段，然后克隆到质粒载体“pGEMt-easy”(プロメガ株式会社制) 中，进行DNA序列的确定。碱基序列的确定使用“Taq DyeDeoxy  Terminator Cycle Sequencing Kit”(アプライドバイオシステムズ社制)按 照Sanger的方法来进行。其结果是，获得了认为是相当于来源于美洲鲎的 D-LDH基因的2种序列(D-LDH1、D-LDH2)的部分序列。

接着，使用5’RACE和3’RACE法来明确D-LDH1和D-LDH2的全 ORF序列。5’RACE通过以下方法来进行。首先，将配置成100μM的序 列号10记载(D-LDH1用)的寡聚DNA或序列号11记载(D-LDH2用)的寡 聚DNA 50μL、T4多核苷酸激酶(タカラバイオ社制)50单位、10×激酶缓 冲液(500mM Tris-HCl pH7.6、100mMMgCl₂、50mM DTT、1mM亚精 胺、1mM EDTA)10μL、100mM ATP 1μL、蒸馏水34μL混和，在37℃ 静置1小时，从而进行寡聚DNA的5’末端的磷酸化，再通过酚-氯仿-异戊 醇处理、乙醇沉淀来纯化。接着，以美洲鲎的polyA(+)RNA为模板，使用 “SuperScript II Reverse Transcriptase”(インビトロジエン株式会社制)， 以上述磷酸化寡聚DNA为引物进行cDNA的合成。以下，使用“5’-Full RACE Core Set”(タカラバイオ株式会社制)来进行利用连接反应的单链 cDNA的多联体化，生成多联体化cDNA，以该多联体化cDNA为模板， 以序列号12和序列号13记载(D-LDH1用)的寡聚DNA、或序列号14和序 列号15记载(D-LDH2用)的寡聚DNA为引物进行第1次PCR，再以该反 应液为模板，以序列号16和序列号17记载(D-LDH1用)的寡聚DNA、或 序列号18和序列号19记载(D-LDH2用)的寡聚DNA为引物进行第2次 PCR。扩增片段的确认、纯化和碱基序列的确定如上所述地进行。

3’RACE通过以下方法进行。首先，以美洲鲎的polyA(+)RNA为模板， 使用“SuperScript II Reverse Transcriptase”(インビトロジエン株式会社 制)，以Oligo d(T)为引物进行cDNA的合成。接着，以该反应液为模板， 以Oligo d(T)和序列号13记载(D-LDH1用)的寡聚DNA、或序列号15记 载(D-LDH2用)的寡聚DNA为引物进行第1次PCR，进而，以该反应液 为模板，以Oligo d(T)和序列号17记载(D-LDH1用)的寡聚DNA、或序列 号19记载(D-LDH2用)的寡聚DNA为引物进行第2次PCR。扩增片段的 确认、纯化和碱基序列的确定如上所述进行。

来源于美洲鲎的D-LDH1基因的氨基酸序列(序列号1)和cDNA的 ORF序列(序列号3)、或D-LDH2的氨基酸序列(序列号2)和cDNA的ORF 序列(序列号4)，通过结合上述方法所得的序列来确定。此外，利用BLAST 获得的序列号1和序列号2所记载的氨基酸序列之间的序列同一性为93 ％，序列号3和序列号4所记载的碱基序列之间的序列同一性为82％。

(实施例2)来源于美洲鲎的D-LDH基因表达质粒的构建

以相当于在实施例1中确定的被认为是来源于美洲鲎的D-LDH基因 的D-LDH1基因和D-LDH2基因(以下分别称为Lp.D-LDH1基因、 Lp.D-LDH2基因)的ORF5’侧和ORF3’侧的序列号20和序列号21记载的 寡聚DNA、或者序列号22和序列号23记载的寡聚DNA为引物组，以由 美洲鲎的polyA(+)RNA合成的cDNA为模板进行PCR，从而进行基因的 克隆。将所得的DNA片段用限制性酶XhoI和NotI切割，导入到同样地 用限制性酶XhoI和NotI切割的酵母表达用载体pTRS11(带有TDH3启 动子和选择标记URA3基因，参照特开2006-280368号公报。其中，TDH3 启动子和终止子表述为GAPDH启动子和终止子。)的切割部位，制作包含 连接有TDH3启动子、Lp.D-LDH1基因或Lp.D-LDH2基因的DNA构建 体的质粒载体。然后，将这些质粒载体作为pTRS205(保持Lp.D-LDH1) 和pTRS206(保持Lp.D-LDH2)。这里，pTRS11载体是通过将pNV11载 体(参照Nature，vol.357，25JUNE 1992，p.700)用限制性酶XhoI切割，除 去插入片段之后自身连接而制成的。

(实施例3)来源于美洲鲎的D-LDH基因表达质粒向酵母的导入

将如实施例2所得的pTRS205和pTRS206导入作为酵母的酿酒酵母 SW029-1B株(基因型：MATa ura TRP(Δpdc1::TRP1)his ade lys leu)(以 下称为SW029-1B株)中。质粒的导入是使用“YEASTMAKER Yeast  Transformation System”(クロンテツク社制)通过乙酸锂法进行的(详细参 照附带的方案)。作为宿主的SW029-1B株是缺失了尿嘧啶合成能力的菌 株，由于pTRS205和206所具有的选择标记URA3基因的作用，可以在 尿嘧啶非添加培养基上选择导入了pTRS205和206的转化酵母。向这样得 到的转化体中的D-LDH基因表达载体导入的确认，可以从在尿嘧啶非添 加的液体培养基中培养的转化株中，用基因组DNA提取试剂盒“Genとる くん”(タカラバイオ株式会社制)提取包含质粒DNA的基因组DNA，使用 该基因组DNA作为模板通过PCR来进行。引物分别使用克隆来源于美洲 鲎的D-LDH基因时所用的引物。其结果确认了，在所有转化酵母中分别 导入了各来源于美洲鲎的D-LDH基因。

(实施例4)D-乳酸生产性试验1

使用如实施例3所得的导入了pTRS205和206的酿酒酵母SW029-1B 株(以下称为SW029-1B/pTRS205株、SW029-1B/pTRS206株)进行D-乳酸 生产性试验。

在试管中取从表1所示组成的SC3培养基中除去尿嘧啶后的培养基 (SC3-Ura培养基)10mL，在其中接种少量的各菌株，在30℃培养一夜(前 培养)。接着，将SC3-Ura培养基10mL装入试管，分别接种各前培养液 100μL，在30℃振荡培养(主培养)。将主培养开始后40小时的培养液进 行离心分离，在下述所示的条件下通过HPLC测定上清所含的乳酸。

柱：“Shim-Pack SPR-H”(株式会社岛津制作所制)

移动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)

反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流 速0.8mL/分钟)

检测方法：电导率

温度：45℃。

另外，D-乳酸的光学纯度，是由在以下条件下通过HPLC法测定的 D-乳酸和L-乳酸浓度的测定结果，基于下式计算的。

柱：“TSK-gel Enantio LI”(注册商标：東ソ一株式会社制)

移动相：1mM硫酸铜水溶液

流速：1.0ml/分钟

检测方法：UV254nm

温度：30℃。

光学纯度(％e.e.)＝100×(D-L)/(D+L)

光学纯度(％)＝100×D/(D+L)

这里，L表示L-乳酸的浓度，D表示D-乳酸的浓度。

[表1]

其结果是，D-乳酸的积累浓度在SW029-1B/pTRS205株中为13g/L， 在SW029-1B/pTRS206株中为12g/L。另外，培养液中仅检测到D-乳酸， L-乳酸为检测限以下。可以确认，通过将从美洲鲎克隆的D-LDH基因导 入酵母，从而该转化酵母产生D-乳酸。

(实施例5)来源于美洲鲎的D-LDH基因向酵母染色体的导入

通过以下步骤1～3来制作包含来源于美洲鲎的D-LDH基因的同源重 组用DNA构建体。

[步骤1]

以实施例2所得的保持Lp.D-LDH1基因的pTRS205和保持 Lp.D-LDH2基因的pTRS206为模板，以序列号24和25记载的寡聚DNA、 或者序列号26和25记载的寡聚DNA为引物组，通过PCR来扩增包含各 D-LDH基因的约1.1kb的DNA片段。这里序列号24、26记载的寡聚DNA 设计成添加与PDC1基因的上游65bp具有同源性的序列那样。

[步骤2]

接着，以质粒pRS424(GenBank Accession Number：U03453)为模板， 以序列号27和28记载的寡聚DNA为引物组，通过PCR来扩增包含作为 酵母选择标记的TRP1基因的约1.4kb的DNA片段。这里序列号28所记 载的寡聚DNA被设计成添加有与PDC1基因的下游65bp具有同源性的序 列那样。

[步骤3]

将DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用“QIA quick Gel  extraction kit”(キアゲン株式会社制)进行纯化。将这里所得的包含D-LDH 基因的1.1kb片段、包含TRP1基因的1.4kb片段分别混合，以混合物作 为模板，以序列号24和28记载的寡聚DNA、或者序列号26和28记载的 寡聚DNA作为引物组，通过PCR来扩增连接有各D-LDH基因、TDH3 终止子和TRP1基因的约2.5kb的同源重组用DNA构建体。

将如上所述制作的同源重组用DNA构建体，转化作为使酿酒酵母 NBRC10505株(以下称为NBRC10505株)的赖氨酸营养缺陷型恢复而得的 菌株的酿酒酵母SW092-2D株(以下称为SW092-2D株)。

此外，SW092-2D株的制作法如下。以フナコシ株式会社制的酿酒酵 母BY4741株的基因组DNA为模板，以寡核苷酸(序列号29，30)为引物组， 通过PCR来扩增LYS2基因的前半约2kb的PCR片段。将上述PCR片 段用1％琼脂糖凝胶电泳分离，按照常规方法纯化，然后对NBRC10505 株进行转化操作，解除LYS2基因的琥珀型突变。通过在赖氨酸非添加培 养基中培养，选择出赖氨酸合成能力恢复了的转化株(NBRC10505(LYS2) 株)。如下确认转化株是解除了LYS2基因的琥珀型突变的酵母。首先，使 所得的转化体与具有野生型的LYS2基因的酿酒酵母L0GY7株接合而获 得2倍体细胞，使该2倍体细胞在子囊形成培养基中进行子囊形成。用显 微操作器解剖子囊获得各个单倍体细胞(四分体)，研究各个单倍体细胞的 营养缺陷型。确认了取得的所有单倍体细胞都具有赖氨酸合成能力。使所 得的NBRC10505(LYS2)株和NBRC10506株接合，用显微操作器进行子囊 解剖，从而获得SW092-2D(基因型：MATa ura3 leu2 trp1 his3 ade2 LYS2) 株。

使用上述同源重组用DNA构建体转化SW092-2D株，在色氨酸非添 加的培养基中进行培养，从而筛选转化酵母。将这样获得的转化酵母作为 SW092-2D(Δpdc1::Lp.D-LDH1-TRP1)株和SW092-2D(Δpdc1::Lp.D- DLH2-TRP1)株。

(实施例6)D-乳酸生产性试验2

使用实施例5所制作的SW092-2D(Δpdc1::Lp.D-LDH1-TRP1)株、 SW092-2D(Δpdc1::Lp.D-LDH2-TRP1)株，使用微型发酵罐(丸菱バイオエ ンジ株式会社制，5L)进行发酵评价。

在试管中取表1所示的SC3培养基10mL，在其中接种少量的各菌株， 在30℃培养一夜(前前培养)。接着，在加入了45mL的SC3培养基的三 角烧瓶中加入前前培养液5mL，在30℃进一步培养8小时(前培养)。在加 入了1L的SC3培养基的微型发酵罐中接种前培养液的总量，培养30小时。 培养条件在以下显示。

pH值：pH值5

通气：100mL/分钟

搅拌：120转/分钟

中和剂：1N氢氧化钠。

用“グルコ一ステストワコ一C”(注册商标)(和光纯药株式会社制)测 定培养结束时的培养液量和培养液中的D-乳酸浓度和葡萄糖浓度，由该乳 酸、和由葡萄糖浓度计算出的加入葡萄糖，求算出乳酸对糖收率。其结果 可以确认，SW092-2D(Δpdc1::Lp.D-LDH1-TRP1)以对糖收率45％生产D- 乳酸，SW092-2D(Δpdc1::Lp.D-LDH2-TRP1)以对糖收率42％生产D-乳酸。

(比较例1)来源于乳酸菌的D-LDH基因的克隆、发酵评价

作为能够在转化酵母中高效地发酵生产D-乳酸的D-LDH基因，来源 于肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)ATCC9135株的D-LDH基因 是公知的(参照WO2004/104202)，通过克隆该D-LDH基因(以下称为 Lm.D-LDH基因)导入酵母并发酵，从而进行与来源于美洲鲎的 Lp.D-LDH1基因或Lp.D-LDH2基因的D-LDH活性的比较研究。

Lm.D-LDH基因的克隆，使用参考WO2004/104202所记载的碱基序 列设计的引物组(序列号31、32)，以ATCC9135株为模板，通过菌落PCR(使 用东洋纺株式会社制“KOD-Plus-polymerase”)来进行。纯化PCR扩增片段， 将末端用“T4多核苷酸激酶”(タカラバイオ株式会社制)磷酸化，然后与 pUC118载体(用限制性酶HincII切割、将切割面进行脱磷酸化处理后的载 体)连接。连接使用“DNA Ligation Kit Ver.2”(タカラバイオ株式会社制) 来进行。用连接质粒产物转化大肠杆菌DH5α，回收质粒DNA，从而获得 亚克隆有Lm.D-LDH基因的质粒。将插入有所得的Lm.D-LDH基因的 pUC118质粒用限制性酶XhoI和NotI消化，将所得的各DNA片段插入到 酵母表达用载体pTRS11的XhoI/NotI切割部位。这样获得Lm.D-LDH基 因表达质粒pTRS207。

接着，以pTRS207为模板，使用序列号33所示的引物组代替序列号 24或26所示的引物，除此之外，用与实施例5同样的方法将Lm.D-LDH 基因导入酿酒酵母SW092-2D株的染色体中的PDC1基因座。将制作的转 化酵母作为SW092-2D(Δpdc1::Lm.D-LDH-TRP1)。接着，用与实施例6 同样的方法，进行分批培养的D-乳酸生产性的评价。其结果是，SW092-2D (Δpdc1::Lm.D-LDH-TRP1)的对糖收率为38％。与实施例6的结果合并示 于表2。

[表2]

(参考例1)来源于爪蟾的L-LDH基因导入酵母的制作

通过特开2008-029329号公报所记载的方法，制作将来源于爪蟾的 L-LDH基因(X.L-LDH基因)导入PDC1基因座而得的酵母。此外，作为向 染色体进行导入的酵母，使用使NBRC10506株的腺嘌呤营养缺陷型恢复 而得的菌株(SU013-1D株)。以下显示SU013-1D株的制成方法。以质粒 pRS422为模板，以寡核苷酸(序列号34，35)为引物组，通过PCR来扩增 ADE2基因的PCR片段约2kb。将上述PCR片段通过1％琼脂糖凝胶电泳 分离，按照常规方法纯化，然后进行转化操作，解除ADE2基因的突变。 通过用腺嘌呤非添加培养基进行培养，来选择出腺嘌呤合成能力恢复了的 转化株。

如下确认如上所述获得的转化株是解除了AED2基因的突变的酵母。 首先，使所得的转化体与带有野生型的ADE2基因的酿酒酵母L0GY77株 接合而获得2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊形成培养基中进行子囊形 成。用显微操作器解剖子囊而取得各个单倍体细胞(四分体)，研究各个单 倍体细胞的营养缺陷型。确认了取得的全部单倍体细胞都具有腺嘌呤合成 能力。使所得的NBRC10506(ADE2)株与NBRC10505株接合，通过用显 微操作器进行子囊解剖来获得SU013-1D株(基因型：MATαura3 leu2 trp1 his3 ADE2 lys2)。将所得的转化酵母作为SU013-1D (Δpdc1::X.L-LDH-TRP1)株。

(实施例7、比较例2)D-乳酸生产性试验3

使如参考例1那样制作的SU013-1D(Δpdc1::X.L-LDH-TRP1)株分别 与实施例5和比较例1所制作的SW092-2D(Δpdc1::Lp.D-LDH1-TRP1)株、 SW092-2D(Δpdc1::Lp.D-LDH2-TRP1)株和SW092-2D(Δpdc1::Lm.D- LDH-TRP1)株接合，制作在PDC1基因座杂合有L-LDH基因和D-LDH 基因的2倍体酵母。将所制作的2倍体酵母分别作为Lp1-X株、Lp2-X株、 Lm-X株。

接着，将Lp1-X株、Lp2-X株、Lm-X株在与实施例5同样的条件下 进行分批培养，评价所生产的乳酸的光学纯度(表3)。

[表3]

其结果是，具有来源于美洲鲎的D-LDH基因的酵母以光学纯度50％ 以上产生D-乳酸，与此相对，由具有来源于肠膜明串珠菌的D-LDH基因 的酵母产生的D-乳酸的光学纯度为44.4％。由于认为各酵母所生产的D- 乳酸的对糖收率和D-乳酸的光学纯度与D-LDH基因转化酵母内的D-LDH 活性成比例，因而由表2和表3的结果可以确认，与来源于肠膜明串珠菌 的D-LDH基因相比，来源于美洲鲎的D-LDH基因在导入酵母的情况下编 码更高活性的多肽。

(实施例8)向酵母染色体中的D-LDH基因的多拷贝导入和温度敏感 性突变型PDC5酵母的制作

接着，为了进一步提高D-乳酸收率，研究了在PDC1基因座以外的基 因座也导入了来源于美洲鲎的D-LDH基因的酵母的制作，导入到了特开 2008-029329号公报中记载了导入效果的TDH3基因座和国际申请 PCT/JP2008/072129中记载了导入效果的SED1基因座中。另外，还导入 了特开2008-048726号公报所记载的温度敏感性突变型PDC5基因。

[向TDH3基因座的D-LDH基因导入]

为了向TDH3基因座的导入，与特开2008-029329号公报所记载的 pTRS150的制作方法同样地，制作将保持Lp.D-LDH1基因的pTRS205的 TDH3终止子置换成ADH1终止子的质粒pTRS208。接着，使用序列号 36所示的引物代替特开2008-029329号公报中的序列号8，以pTRS208为 模板，获得了TDH3基因座导入用的同源重组用DNA构建体。

作为导入上述同源重组用DNA构建体的酵母，使用SU013-1D株的亮 氨酸非缺陷型株(SW087-2C株)。以下显示SW087-2C株的制成方法。以 质粒pRS425为模板，以寡核苷酸(序列号37，38)为引物组，通过PCR来 扩增LEU2基因的PCR片段约2kb。将上述PCR片段用1％琼脂糖凝胶 电泳进行分离，按照常规方法纯化，然后进行SU013-1D株的转化操作， 解除LEU2基因的突变。通过在亮氨酸非添加培养基中进行培养，来选择 出亮氨酸合成能力恢复了的转化株。如下确认这样获得的转化株是解除了 LEU2基因的突变的酵母。首先，使所得的转化体与带有野生型的LEU2 基因的酿酒酵母L0GY77株接合获得2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊 形成培养基中进行子囊形成。用显微操作器解剖子囊取得各个单倍体细胞 (四分体)，研究各个单倍体细胞的营养缺陷型。确认了所取得的全部单倍 体细胞都具有亮氨酸合成能力。使所得的SU013-1D(LEU2)株与 NBRC10505株接合，通过利用显微操作器的子囊解剖来获得SW087-2C 株(基因型：MATαura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2)。

使用上述同源重组用DNA构建体转化SW087-2C株，在尿嘧啶非添 加培养基中进行选择，从而获得在TDH3基因座导入了Lp.D-LDH1基因 的转化酵母。将所得转化酵母作为SW087-2C(ΔTDH3::Lp.D-LDH-URA3) 株。

[向SED1基因座的D-LDH基因导入]

向SED1基因座的导入法是改变国际申请PCT/JP2008/072129的实施 例2所记载的方法来进行的。即，作为PCR的模板，使用pTRS205代替 pTRS102，另外使用序列号39所示的引物代替上述公报中的序列号14， 扩增SED1基因座导入用的同源重组用DNA构建体。

作为导入上述同源重组用DNA构建体的酵母，使用使实施例5所制 作的NBRC10505(LYS2)株与参考例1所制作的NBRC10506(ADE2)株接 合，通过利用显微操作器的子囊解剖分离而得的SW092-7D株(基因型： MATa ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 LYS2)。

使用上述同源重组用DNA构建体转化SW092-7D株，用组氨酸非添 加培养基进行选择，从而获得在SED1基因座导入了Lp.D-LDH1基因的 转化酵母。将所得的转化酵母作为SW092-7D(ΔSED1::Lp.D-LDH-HIS3) 株。

[温度敏感性突变型PDC5基因(pdc5ts-9)的导入]

作为导入有温度敏感性突变型PDC5基因的酵母，使用特开 2008-048726号公报所记载的、带有温度敏感性突变型PDC5基因(pdc5ts-9) 的酵母SW015株。使SW015株与SW087-2C株接合，通过利用显微操作 器的子囊解剖来分离，从而获得SW095-4B株(基因型：MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2 pdc5ts-9 Δpdc1::TRP1)。进一步使SW095-4B株与 SW092-2D株接合，通过利用显微操作器的子囊解剖来分离，从而获得 SW098-21B株(基因型：MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 LYS2 pdc5ts-9)。

[向PDC1、TDH3和SED1基因座的D-LDH基因导入、以及温度敏 感性突变型PDC5基因(pdc5ts-9)的导入]

使用所制作的SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH1-TRP1)株、SW087-2C (ΔTDH3::Lp.D-LDH1-URA3)株、SW092-7D(ΔTDH3::Lp.D-LDH1-HIS3) 和SW098-21B，重复2倍体接合、四分体，获得在PDC1、TDH3和SED1 基因座具有Lp.D-LDH1基因、具有温度敏感性突变型PDC5(pdc5ts-9)、 且在2倍体中不具有腺嘌呤、亮氨酸、赖氨酸的营养缺陷型的SU042株。 图1显示SU042株的制作步骤。

(实施例9)D-乳酸生产性的试验4

使用如实施例8所制作的SU042株，进行分批培养的D-乳酸生产性的 试验。培养基使用表1所示的SC3培养基或原料糖培养基(100g/L“优糖 精”(ムソ一株式会社制)、1.5g/L硫酸铵)。首先，将SU042株在试管中用 5mL的SC3培养基或原料糖培养基振荡培养一夜(前前培养)。将前前培 养液接种到新鲜的SC3培养基或原料糖培养基50ml中，用500ml容量的 坂口烧瓶振荡培养24小时(前培养)。在微型发酵罐(Able社制、2L)中加 入1L的SC3培养基或原料糖培养基，进行温度调节(32℃)、pH值控制(pH 值5、5N氢氧化钙)，一边通气、搅拌(200mL/分钟，400转/分钟)一边进行 培养。其结果是在SC3培养基中，培养在30小时结束，对糖收率为63％。 另外，在原料糖培养基中，培养在50小时结束，对糖收率为70％。由该 结果可以确认，通过Lp.D-LDH1基因向PDC1、TDH3、SED1基因座的 导入和向PDC5基因的温度敏感性突变的导入，D-乳酸的发酵性能提高。

(实施例10)利用连续培养的D-乳酸生产性试验

使用SU042株，进行使用WO2007/097260所记载的分离膜的连续培 养的研究。培养基使用原料糖培养基(75g/L“优糖精”(ムソ一株式会社制)、 1.5g/L硫酸铵)。下述显示培养条件。

发酵槽容量：2(L)

培养液容量：1.5(L)

使用分离膜：PVDF过滤膜(在WO2007/097260的参考例2中记载)

膜分离构件有效过滤面积：120cm²

温度调节：32(℃)

发酵反应槽通气量：空气0.02(L/分钟)、氮气0.18(L/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH值调节：用5N氢氧化钙调节成pH值5

灭菌：包含分离膜构件的培养槽、和使用培养基经121℃、20分钟用 高压釜进行高压蒸气灭菌。

首先，将SU042株在试管中用10mL的原料糖培养基以30℃振荡培养 一夜(前前前培养)。将所得的培养液的总量接种到新鲜的原料糖培养基 100ml中，用500ml容量的坂口烧瓶以24小时振荡培养30℃(前前培养)。 将前前培养液接种到加入有1.5L的原料糖培养基的膜一体型的连续培养 装置(WO2007/097260的图2所示的装置)中，从培养开始50小时起开始用 ペリスタポンプ(泵)抽出培养液(200mL/小时)，培养至400小时，测定作 为生产物质的乳酸浓度和乳酸生产速度。图2显示结果。此外，连续培养 中的乳酸生产速度使用以下式(1)计算出。

乳酸生产速度(g/L·h)＝抽出液中的生产物浓度(g/L)×发酵培养液抽 出速度(L/小时)÷装置的运转液量(L)···(式1)。

使用分离膜进行连续培养的结果可以确认，D-乳酸的对糖收率进一步 提高到85％左右，另外，D-乳酸生产速度提高到7.5g/L·小时。

(实施例11)向产朊假丝酵母的美洲鲎D-LDH的导入

接着，使用作为Crabtree-阴性酵母的产朊假丝酵母进行D-乳酸的研 究。

(a)美洲鲎D-LDH基因导入用载体的制作

首先，进行用于在产朊假丝酵母染色体中的PDC1基因座导入来源于 美洲鲎的D-LDH基因的载体构建。将产朊假丝酵母NBRC0988株(以下 简称为NBRC0988)接种到YPD培养基(1％Bacto酵母提取物，2％Bacto 蛋白胨、2％葡萄糖)中，在30℃培养一夜。按照常规方法从所得的菌体提 取基因组DNA作为接下来的PCR的模板。首先，以序列号40、41的寡 聚DNA作为引物组，扩增包含PDC1基因的终止子区域的片段。此外， DNA聚合酶使用KOD-plus-(东洋纺株式会社制)按照附带的方案进行，但 不限于此。将所得的约1kb的片段用限制性酶BssHI切割，将其纯化之后， 与同样地用限制性酶BssHI预先切割的pBluescriptIISK(+)连接。将所得 的质粒作为pKS01。

接着，同样地以NBRC0988的基因组DNA为模板，以序列号42，43 的寡聚DNA为引物组进行PCR，从而扩增包含PGK启动子的片段。将 所得的约1kb的片段纯化用于接下来的实验。接着，以带有能够赋予对作 为抗生素的一种的潮霉素B的耐性的基因的hph基因的质粒pLC1-hph为 模板，以序列号44、45的寡聚DNA为引物组，通过PCR来扩增、纯化 包含hph基因的片段，得到约1.1kb的片段。另外，以NBRC0988的基因 组DNA为模板，以序列号46、47的寡聚DNA为引物组，通过PCR来扩 增、纯化包含GAP终止子的片段，得到了约500bp的片段。

将如上所述得到的包含PGK启动子的片段、包含hph基因的片段和 包含GAP终止子的片段混合，以序列号48、49的寡聚DNA为引物组， 通过PCR来扩增连接有PGK启动子、hph基因和GAP终止子的片段。 将所得的约2.6kb的片段的末端磷酸化，然后与预先将pUC118用HincII 切割而脱磷酸化的产物连接。将所得的质粒作为pKS02。

接着，同样地以NBRC0988的基因组DNA为模板，以序列号50、51 的寡聚DNA为引物组，通过PCR来扩增、纯化包含PGK终止子的片段， 得到了约500bp的片段。另外，以如上所述得到的pKS02为模板，以序列 号52、53的寡聚DNA为引物组，通过PCR来扩增、纯化连接有PGK启 动子、hph基因和GAP终止子的片段，得到了约2.6kb的片段。

将如上所述得到的包含PGK终止子的片段与连接有PGK启动子、hph 基因和GAP终止子的片段混合，以序列号50、53的寡聚DNA为引物组， 通过PCR来扩增连接有PGK终止子、PGK启动子、hph基因和GAP终 止子的片段。将所得的约3kb的片段用限制性酶BamHI和ClaI切割，将 其纯化之后，与同样地预先用限制性酶BamHI和ClaI切割的pKS02连接。 将所得的质粒作为pKS03。

接着，同样地以NBRC0988的基因组DNA为模板，以序列号54、55 的寡聚DNA为引物组，通过PCR来扩增、纯化包含PDC1启动子区域的 片段，得到了约2.1kb的片段。另外，以实施例2所制作的pTRS205为模 板，以序列号56、57的寡聚DNA为引物组，通过PCR来扩增、纯化包 含来源于美洲鲎的D-LDH基因的片段，得到了约1kb的片段。

将如上所述获得的包含PDC1启动子区域的片段和包含来源于美洲鲎 的D-LDH基因的片段混合，以序列号54、57的寡聚DNA为引物组，通 过PCR来扩增连接有包含PDC1启动子区域的片段和包含来源于美洲鲎 的D-LDH基因的片段的片段，将所得的约3.1kb的片段用限制性酶NotI 和BglII切割，将其纯化之后，与预先用限制性酶NotI和BamHI切割了 的pKS03连接。将所得的质粒作为pKS04。

(b)美洲鲎D-LDH基因向PDC1基因座的导入

将如上所述获得的pKS04用限制性酶BglII切割后的产物通过电穿孔 法导入NBRC0988。在YPD培养基中接种少量的菌体，在30℃培养一夜。 离心去掉上清之后，将菌体用灭菌水和1M山梨糖醇洗涤，最后使菌体悬 浮在1M山梨糖醇中。接着，将菌体与用限制性酶BglII切割后的pKS04 混合，在冰上放置5分钟之后，移至电穿孔用的杯，在电容(25μF)、电压 (0.75kV)和电阻(800Ω)的条件下进行电穿孔。然后，移至加有1M山梨糖 醇的YPD培养基中，在30℃培养4小时左右，涂布在添加了600μg/L的 潮霉素B的YPD培养基上。从所得的潮霉素B耐性菌株提取基因组，以 序列号54、57和序列号56、51的寡聚DNA为引物组，通过PCR来确认 分别约3kb和2kb的片段的扩增，从而确认获得了在PDC1基因座导入了 来源于美洲鲎的D-LDH基因的转化酵母。将所得的转化酵母作为 CuLpLDH株。

(比较例2)向产朊假丝酵母的来源于乳酸菌的D-LDH的导入

用与实施例11同样的方法导入来源于乳酸菌肠膜明串珠菌的D-LDH 基因。此外，使用序列号58的寡聚DNA代替实施例11中的序列号55， 另外代替实施例2的pTRS205以比较例1的pTRS207为模板，同时使用 使用序列号59、60的寡聚DNA代替序列号56、57。将所得的质粒作为 pKS05。

将如上所述获得的质粒用与实施例11同样的方法导入NBRC0988株 中。将所得的在PDC1基因座导入了来源于乳酸菌肠膜明串珠菌的D-LDH 基因的菌株作为CuLmLDH株。

(实施例12、比较例3)产朊假丝酵母的D-乳酸生产性试验

使用实施例11和比较例2所制作的CuLpLDH株、CuLmLDH株评 价D-乳酸生产性。在500mL的坂口烧瓶中加入50mL的YPD培养基，在 其中接种少量的CuLpLDH株和CuLmLDH株，在30℃振荡培养一夜(前 培养)。将培养液进行收集菌体，用新鲜的YPD培养基洗涤，然后加入到 添加有1L的YPD10培养基(含有10％葡萄糖)的微型发酵罐中进行培养。 以下显示培养条件。

初期植菌量：接种至OD₆₀₀＝10

pH值：pH值6

通气：100mL/分钟

搅拌：120转/分钟

中和剂：1N氢氧化钙

培养温度：35℃。

培养进行40小时，分析40小时时刻的培养液的乳酸浓度、葡萄糖浓 度。葡萄糖被消耗尽。另外，相对于每份消耗葡萄糖的生产性(对糖收率) 和D-乳酸光学纯度如表4所示，可知在产朊假丝酵母中导入了D-LDH基 因的酵母可以发酵生产D-乳酸，另外收率是导入了来源于美洲鲎的D-LDH 基因的CuLpLDH株较高。

(实施例13、比较例4)产朊假丝酵母的D-乳酸生产性试验2

接着，使用CuLpLDH株、CuLmLDH株，以作为5单糖的木糖为糖 源进行D-乳酸生产性的评价。在500mL的坂口烧瓶中加入50mL的YPD 培养基，在其中接种少量的CuLpLDH株和CuLmLDH株，在30℃振荡 培养一夜(前培养)。将培养液进行收集菌体，用新鲜的YPD培养基洗涤， 然后加入到添加有1L的YPX10培养基(1％酵母提取物、2％Bacto蛋白 胨、4％木糖)的微型发酵罐中进行培养。以下显示培养条件。

初期植菌量：接种至OD₆₀₀＝10

pH值：pH值6

通气：100mL/分钟

搅拌：120转/分钟

中和剂：1N氢氧化钙

培养温度：30℃。

培养进行60小时，分析60小时时刻的培养液的乳酸浓度、木糖浓度。 木糖被消耗尽。另外，相对于每份消耗木糖的生产性(对糖收率)和D-乳酸 光学纯度如表4所示，可知在产朊假丝酵母导入有D-LDH基因的酵母可 以以木糖为原料发酵生产D-乳酸，另外收率是导入了来源于美洲鲎的 D-LDH基因的CuLpLDH株较高。

[表4]

产业可利用性

通过本发明，可以以低成本稳定地生产D-乳酸，另外，所得的D-乳 酸光学纯度高，优选作为聚合物原料使用。