在患有呼吸困难的对象中检测细菌感染

摘要

本发明的领域是在患有呼吸困难的对象中对细菌感染的诊断和/或预测和/或后续治疗。本发明的主题是提供用于在患有呼吸困难的对象中对细菌感染进行诊断和/或预测和/或后续治疗的方法。

说明书

本发明的领域是在患有呼吸困难的对象中对细菌感染的诊断和/或预测和/或后续治疗。本发明的主题是提供用于在患有呼吸困难的对象中对细菌感染进行诊断和/或预测和/或后续治疗的方法。

心力衰竭(HF)是常见的、与高发病率和死亡率相关的、并且难以诊断的，在急诊科(ED)尤其如此(Cheland等：《欧洲心力衰竭调查方案：在欧洲的心力衰竭患者中对于护理质量的调查》(The EuroHeartFailure survey programme-a survey on the quality of care amongpatients with heart failure in Europe).《部分1：患者的特征和诊断》(Part1：patient characteristics and diagnosis).Eur Heart J 2003，24：442-63；Mosterd A.，Hoes A.W.：《心力衰竭的临床流行病学》(Clinicalepidemiology of heart failure).Heart 2007，93：1137-46)。呼吸困难是大多数HF患者的主要症状。相应地，这些患者的主要风险是可能存在的细菌感染。遗憾的是，病历和体格检查都不能准确地区分由HF所致的呼吸困难与由其它原因如肺部疾病所致的呼吸困难(Mueller C.等：《充血性心力衰竭的急诊诊断：体征和症状的影响》(Emergency diagnosis ofcongestive heart failure：impact of signs and symptoms).Can J Cardiol2005，21：921-4；Wang C.S.等：《急诊科的这名呼吸困难患者患有充血性心力衰竭吗？》(Does this dyspneic patient in the emergency departmenthave congestive heart failure？)JAMA 2005，294：1944-56)。然而，准确的诊断对于大多数适当治疗的选择来说是必须的。

降钙素原(PCT)已成为大家接受的用于败血症诊断的生物标志物：PCT反映了细菌感染的严重度，且特别地用于监测感染向败血症、严重败血症、或败血性休克的进展。使用PCT来测量全身炎症反应的活性、控制治疗的成功、以及估计预后是可能的(Assicot M等：《败血症和感染患者中的高血清降钙素原浓度》(High serum procalcitoninconcentrations in patients with sepsis and infection.)Lancet 1993，341：515-8；Clec’h C等：《降钙素原在败血性休克患者中的诊断和预后价值》(Diagnostic and prognostic value of procalcitonin in patients withseptic shock).Crit Care Med 2004；32：1166-9；Lee YJ等：《降钙素原(PCT)水平、动脉血中酮体比率(AKBR)、APACHEIII评分、以及多器官功能障碍评分(MODS)在全身炎症反应综合征(SIRS)中的预测性比较》(Predictive comparisons of procalcitonin(PCT)level，arterial ketone bodyratio(AKBR)，APACHE III score and multiple organ dysfunction score(MODS)in systemic inflammatory response syndrome(SIRS))，Yonsei MedJ 2004，45，29-37；Meisner M.：《败血症的生物标志物在临床上有用吗？》(Biomarkers of sepsis：clinically useful？)Curr Opin Crit Care 2005，11，473-480；Wunder C等：《IL-6、IL-10、以及PCT的血浆浓度对于严重败血症的后果预测来说可靠吗？与APA CHE III和SAPS II的对比》(AreIL-6，IL-10 and PCT plasma concentrations reliable for outcomeprediction in severe sepsis？A comparison with APACHE III and SAPS II).Inflamm Res 2004，53，158-163)。在败血症患者中PCT水平的增加与死亡相关(Oberhoffer M等：《在败血症患者中通过传统和新的炎症标志物进行的后果预测》(Outcome prediction by traditional and new markers ofinflammation in patients with sepsis).Clin Chem Lab Med 1999；37：363-368)。

为数越来越多的研究讨论了PCT在其它感染性疾病如肺炎、细菌性脑膜炎、以及疟疾中的潜在作用(Bugden SA，Coles C，Mills GD.《在持续性脑膜炎球菌流行病期间降钙素原在发烧青壮年的急诊科管理中的潜在作用》(The potential role of procalcitonin in the emergencydepartment management of febrile young adults during a sustainedmeningococcal epidemic).Emerg Med Australas 2004，16，114-119；Chiwakata CB等：《降钙素原在恶性疟原虫致疟症的患者中作为疾病严重度和死亡风险的参数》(procalcitonin as a parameter of diseaseseverity and risk of mortality in patients with Plasmodium falciparummalaria).J Infect Dis 2001，183，1161-1164；Schwarz S等：《细菌性脑膜炎中的血清降钙素原水平》(Serum procalcitonin levels in bacterial and abacterial meningitis)，Crit Care Med 2000，28，1828-1832)。

期望在本技术领域中能够对在初诊日时单独使用PCT无法检测到的细菌感染或败血症进行预测。选择＞0.1ng/ml的PCT水平作为细菌感染或败血症存在的临界值(cut-off)。

已知患者体液中的新蝶呤浓度的升高与细胞介导的免疫反应在其中发挥作用的疾病相关。在免疫反应的进程中产生了γ干扰素，且其刺激了新蝶呤的产生和释放。(Fuchs D.等.《新蝶呤：作为细胞免疫反应标志物的生化和临床应用》(Neopterin，biochemistry and clinical use as amarker for cellular immune reactions).Int Arch Allergy Immunol 1993，101：1-6)。

新蝶呤的测定反映了在不同疾病的初始和后续阶段期间细胞免疫系统的激活状态，且具有重要的意义。在人类体液中新蝶呤水平的测定提供了用于监测与细胞介导免疫的激活相关的疾病的有用创新工具。新蝶呤的实验室测定在自身免疫病和免疫刺激治疗监测中有价值，同样其亦有助于HIV感染的预后以及献血者样本的筛查(Murr C.等：《新蝶呤作为免疫系统激活的标志物》(Neopterin as a marker for immunesystem activation).Curr Drug Metab 2002，3：175-87)。新蝶呤是细胞免疫系统激活的常规标志物。

本发明的主题是在患有呼吸困难的对象中对细菌感染进行诊断和/或预测和/或后续治疗的体外方法，其包含新蝶呤与一种或多种心血管或神经体液或细胞因子标志物的组合使用。

特别优选的是用于在患有呼吸困难的对象中对细菌感染进行预测、或用于在患有呼吸困难的对象中对细胞感染进行预后、和/或后续预测或预后的所述体外方法。

本发明的优选主题是在患有呼吸困难的对象中对细菌感染进行预测、或在患有呼吸困难的对象中对细胞感染进行预后、和/或后续预测或预后的体外方法，其包含组合使用作为标志物的新蝶呤与选自如下的一种或多种标志物：细胞因子以及心血管标志物或神经体液标志物或其前体或片段或所述前体的片段。

对于上述方法来说，可对所述对象进行样本采集以测定各个标志物。

在涉及预后或预测的体外方法中，在从所述对象取样时，所述对象不具有细菌感染。

如果取自对象的选自血液、血清、以及血浆的样本中降钙素原的浓度等于或小于0.1ng/ml的话，则认为所述对象不具有细菌感染。

用于测定样本中降钙素原水平的分析在本技术领域中是公知的。

根据本发明，出乎意料地显示了，与现有技术状态对患有呼吸困难的对象中细菌感染的诊断和/或预测和/或后续治疗相比，新蝶呤与一种或多种心血管或神经体液或细胞因子标志物的组合可显著地增强对所述对象中细胞感染的诊断和/或预测和/或后续治疗的效率。

新蝶呤与一种或多种心血管或神经体液或细胞因子标志物的组合在所有涉及预后和预测的方法中尤其有效。

在本发明的实施方案中，根据本发明的体外方法包含在取自所述对象的样本中测定新蝶呤和所述一种或多种心血管标志物的水平。

在本发明的实施方案中，根据本发明的体外方法包含使用一种或多种免疫分析在取自所述对象的样本中测定新蝶呤和所述一种或多种心血管标志物的水平。

根据本发明，所述样本可优选地选自血液样本、血清样本、以及血浆样本。

在本发明的一个方面中，所述一种或多种心血管标志物选自MR-proADM、MR-proANP、CT-ProET-1、CT-proAVP、BNP和NT-proBNP及其片段和/或其前体或所述前体的至少12个氨基酸的片段。

根据本发明的体外方法可包含使新蝶呤的水平与所述一种或多种心血管标志物相关联，并基于所述关联的结果来确定是否所述患者患有细菌感染。

在本发明的一个实施方案中，细菌感染表现为肺炎。在本发明的另一个实施方案中，细菌感染表现为败血症。败血症的一个症状可以是气促，这在本技术领域中是公知的(Bozkurt和Mann 2003，Circulation，108，e11-e13，第二页右列，行5ff)。

在根据本发明的体外方法的优选实施方案中，新蝶呤的临界值(cutoff value)是＞10nmol/l的水平。

在根据本发明的体外方法的特别优选的实施方案中，MR-proADM的临界值为＞1nmol/l、CT-proAVP的临界值为＞10pmol/l、CT-proET-1的临界值为＞100pmol/l、MR-proANP的临界值为＞100pmol/l、NT-proBNP的临界值为＞600pg/ml、以及BNP的临界值为＞280pg/ml。

本发明的另一个主题是使用测定样本中新蝶呤和一种或多种心血管标志物的水平的分析、或测定新蝶呤水平的分析连同测定一种或多种心血管标志物水平的一种或多种分析来检测细菌感染。

本发明的另一个主题是用于在患有呼吸困难的患者中检测细菌感染的上文中所说明的应用。

本发明的另一个主题是用于检测细菌感染的上文中所说明的应用，其中所述细菌感染表现为肺炎。

本发明的另一个主题是用于检测细菌感染的上文中所说明的应用，其中所述细菌感染表现为败血症。

在用于检测细菌感染的上述应用的优选实施方案中，新蝶呤的临界值为＞10nmol/l的水平。

根据所述应用的所述一种或多种心血管标志物优选地选自MR-proADM、MR-proANP、CT-ProET-1、CT-proAVP、BNP、和/或NT-proBNP和/或其前体或所述前体的至少12个氨基酸的片段。

优选地，MR-proADM的临界值为＞1nmol/l、CT-proAVP的临界值为＞10pmol/l、CT-proET-1的临界值为＞100pmol/l、MR-proANP的临界值为＞100pmol/l、NT-proBNP的临界值为＞600pg/ml、以及BNP的临界值为＞280pg/ml。

如表1中所示，就比值比(odds ratio)来说，作为标志物的新蝶呤(＞10nmol/l)与MR-proADM、CT-proET-1、CT-proAVP、MR-proANP、BNP、或NT-proBNP的组合导致了在患有呼吸困难的对象中对细菌感染的诊断和/或预测和/或后续治疗的显著增加的效率(参见表1)。

新蝶呤与选自细胞因子和心血管标志物或神经体液标志物或其前体或片段或所述前体的片段的组合，尤其是作为标志物的新蝶呤与选自MR-proADM、MR-proANP、CT-proET-1、CT-proAVP、BNP、以及NT-proBNP和/或其片段和/或其前体或所述前体的具有至少12个氨基酸的片段的一种或多种标志物的组合在涉及预测和预后的根据本发明的方法中特别有效，参见表2。表2中所示的值基于与表1中所示的值相同的原始数据。根据表2所挑选的临界值导致了对于所有标志物和标志物组合来说基本上相同的阴性预测值，而与单独的新蝶呤相比，新蝶呤与MR-proADM、MR-proANP、CT-proET-1、CT-proAVP、BNP、或NT-proBNP的组合的阳性预测值显著增加。因此，相应地获得的阳性预测值表明了所述标志物与所述标志物组合的预后能力。如可在表2中看出的，所述标志物组合的预测能力高于单独作为标志物的新蝶呤。当考虑比值比或相对比值比时，所述标志物组合的预测能力也可以从表1中获得。根据表1计算出的灵敏度和特异性不能完全表示预测能力，因为灵敏度和特异性都是可变的。

诊断性分析或分析或免疫分析可以是在诊断学领域中应用的任何类型，其包括但不限于基于如下的分析方法：

-酶促反应

-发光

-荧光

-放射化学

优选的检测方法包含试纸条测试(strip tests)、放射性免疫分析、化学发光-和荧光-免疫分析、免疫印迹分析、酶联免疫分析(ELISA)、液相芯片基珠阵列(Luminex-based bead array)、以及蛋白质微阵列分析。

分析类型还可以是微量滴定板基、芯片基(chip-based)、珠基的，其中生物标志物蛋白可以附着在表面上或在溶液中。

所述分析可以是同质性或异质性分析、竞争性和非竞争性分析。在特别优选的实施方案中，所述分析的形式是夹心式分析(sandwichassay)，其是非竞争性免疫分析，其中将待检测和/或量化的分子与第一抗体以及第二抗体结合。所述第一抗体可以与固相如珠子、孔或其它容器的表面、芯片或试纸条结合，且第二抗体是例如使用染料、放射性同位素、或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适当的方法来测量与分析物结合的标记抗体的量。与“夹心式分析”相关的常规组合物和程序是已为大家接受的，且是专业人员所了解的。(《免疫分析手册》(The Immunoassay Handbook)，David Wild编辑，Elsevier LTD，Oxford；第三版.(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006年2月；10(1)：4-10.PMID：16376134，遇过参考被纳入本文)。在本发明的情况中，捕获分子是可用于结合来自样本的靶分子或目标分子、即分析物(在本发明的情况中即为心血管肽)的分子。因此捕获分子必须要在空间上并且根据表面特征如表面电荷、疏水性、亲水性、lewis供体和/或受体的存在或缺乏来进行充分的塑造以特异性地与靶分子或目标分子结合。在此，所述结合可以例如通过如下进行调节：离子、范德华(van-der-Waals)、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用、或捕获分子与靶分子或目标分子之间两种以上上述相互作用的组合。在本发明的情况中，捕获分子可例如选自核酸分子、碳水化合物分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽、或糖蛋白。优选地，捕获分子是抗体，包括对靶或目标分子具有充分亲和力的其片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段、以及所述抗体以化学和/或生化方法修饰的衍生物或来源于变异链的长度为至少12个氨基酸的其片段。

在本发明的含义中，样本可以是生物流体如淋巴液、尿、脑脊液、血液、血清、血浆、唾液、粪便、精液。所述样本采集自患者或接受根据本发明的诊断。

在适当的情况下，样本在应用于本发明之前可能需要被均质化、或使用溶剂提取以便获得液体样本。在此，液体样本可以是溶液或悬浮液。

在应用于本发明之前可对液体样本进行一种或多种预处理。这类预处理包括但不限于稀释、过滤、离心、浓缩、沉降、沉淀、透析。

预处理还可包括向溶液中添加化学或生化物质，例如酸、碱、缓冲剂、盐、溶剂、活性染料、去垢剂、乳化剂、螯合剂。

在本发明的含义中，除非另有说明，否则可将“患者”或“对象”理解为是所有的人，无论他们是否表现出病理改变。在本发明的含义中，采集自细胞、组织、器官等的任何样本都可以是待诊断的患者样本。在优选实施方案中，根据本发明的患者是人。在本发明的更优选的实施方案中，患者是患有呼吸困难的人。

在本发明中，术语预测表示对象(例如患者)的健康状况将如何进展的预后。这可包括对所述对象的康复几率或不良后果几率的估计。

诊断和/或预后测试的灵敏度和特异性不仅取决于所述测试的分析“质量”，它们还取决于是什么构成了异常结果的定义。实际上，接受者操作特征曲线(ROC曲线)典型地通过将变量值相对于其在“正常”(即表观健康的)和“患病”人群(即患有细菌感染的患者)中的相对频率进行作图来计算。对于任何特定的标志物来说，有和没有患病的对象的标志物水平的分布将可能会重叠。在这样的情况下，测试不会以100％的精确度来绝对地区分正常与患病的，且重叠的区域表明在那里测试不能区分正常与患病的。挑选一个阈值，高于其(或低于其，取决于标志物如何随着疾病而改变)则认为测试是异常的，且低于其则认为测试是正常的。ROC曲线下面积是对观察到的测量结果将可以正确鉴别病况的概率的度量。甚至当测试结果不一定会给出精确数值时也可以使用ROC曲线。只要人们可以对结果进行等级评定，则人们就可以创建ROC曲线。例如，“患病”样本的测试结果可以根据程度(例如1＝低、2＝正常、以及3＝高)来评定等级。这一等级评定可以与“正常”人群中的结果以及创建的ROC曲线相关联。这些方法在本技术领域中是公知的(Hanley等1982.Radiology 143：29-36)。优选地，挑选一个阈值以提供大于约0.5、更优选大于约0.7、还更优选大于约0.8、甚至更优选大于约0.85、以及最优选大于约0.9的ROC曲线面积。在这种情况中术语“约”是指给出的测量结果的+/-5％。

ROC曲线的横轴代表(1-特异性)，其随着假阳性率而增加。所述曲线的纵轴代表灵敏度，其随着真阳性率而增加。因此，对于所挑选的具体临界值来说，可以确定(1-特异性)的值，并可获得相应的灵敏度。ROC曲线下面积是对所测得的标志物水平将可以正确鉴别疾病或病况的概率的度量。因此，ROC曲线下面积可用于确定所述测试的有效性。

比值比是对效果大小的度量，其描述了两个二元数据值之间的联系或非独立性的强度(例如事件在测试阴性组中发生的可能性与其在测试阳性组中发生的可能性的比率)。

阳性预测值(PPV)，或准确率，是具有阳性测试结果的患者被正确地诊断和/或预测的比例。它反映了阳性测试可反映出被测试的潜在病况的概率。阴性预测值(NPV)是具有阴性测试结果的患者被正确地诊断和/或预测的比例。

总精确度是使用所述测试正确分类的所有患者的百分率。

在本发明的情况中，术语“神经体液标志物”用于影响神经内分泌系统的包括它们的前体及其片段在内的激素和肽，其包括但不限于：脑啡肽、速激肽、内啡肽、强啡肽、后叶催产素、血管升压素、促肾上腺皮质激素、胆囊收缩素、肾素、血管紧张素、血管活性肠多肽、神经肽Y、降钙素基因相关肽、降钙素、生长抑素、蛙皮素、神经紧张素、促肾上腺皮质素释放激素、促甲状腺素释放激素、促性腺激素释放激素、儿茶酚胺(例如去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺)。术语“神经体液标志物”包括所有其前体、其片段、以及所述前体的片段。

在本发明中术语“心血管标志物”被定义为与心血管疾病的诊断和/或预后相关的标志物：例如肌红蛋白；肌钙蛋白T(cTnT)和I(cTnI)；肌酸激酶MB(CK-MB)；FABP；GDF-15；ST-2；降钙素原(PCT)；C反应蛋白(CRP)；肾上腺髓质素原及其片段，包括中间区肾上腺髓质素原(MR-proADM)、肾上腺髓质素、PAMP、C端肾上腺髓质素原(CT-proADM)；内皮素原-1及其片段，包括C端内皮素原-1(CT-proET-1)、大-内皮素-1、内皮素-1、NT-内皮素原-1；proANP及其片段，包括中间区心房利钠肽原(MP-proANP)、N端proANP(NT-proANP)、ANP；血管升压素原及其片段，包括C端精氨酸加压素肽原(pro-arginine vasopressin peptide)(CT-proAVP)、血管升压素；后叶激素运载蛋白II；proBNP及其片段，包括BNP、以及N端proBNP(NT-proBNP)。术语“心血管标志物”包括所有其前体、其片段、以及所述前体的片段。

标志物可以归属于这两个组，假如这个标志物影响了神经内分泌系统且与心血管疾病的诊断和/或预后相关，那么它可以是神经体液标志物和心血管标志物。

在本发明中，术语“细胞因子”被定义为由发挥免疫调节功能的免疫系统的特定细胞分泌的蛋白质，其包括选自但不限于IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、以及IL-1β的淋巴因子、白细胞介素、以及趋化因子。

附图说明

图1至图7显示了新蝶呤以及新蝶呤与其它标志物的组合的接受者操作特征(ROC)图。真阳性率对应于灵敏度，而假阳性率对应于对“-特异性”的表述。

图1：新蝶呤的ROC图。曲线下面积(AUC)＝0.625(p＜0.05)。

图2：新蝶呤加上(CT-proAVP)的ROC图。AUC＝0.701(p＜0.05)。

图3：新蝶呤加上MR-proANP的ROC图。AUC＝0.647(p＜0.05)。

图4：新蝶呤加上MR-proADM的ROC图。AUC＝0.660(p＜0.05)。

图5：新蝶呤加上CT-proET-1的ROC图。AUC＝0.668(p＜0.05)。

图6：新蝶呤加上BNP的ROC图。AUC＝0.640(p＜0.05)。

图7：新蝶呤加上NT-proBNP的ROC图。AUC＝0.646(p＜0.05)。

实施例

964名在ED就诊的急诊病人有呼吸困难的症状，且随后被接收入院，主要是因为充血性心力衰竭和肺炎。在ED就诊时采集第一份血液样本，并在住院期间再采集一至三份血液样本。

应用PCT测量来诊断细菌感染，临界值为0.1ng/ml。

在ED就诊时有呼吸困难症状的964名患者中，有428名从去ED就诊直至出院时都没有发展为细菌感染(组A)，因为在此期间所有测得的PCT值都＜0.1ng/ml。在剩下的536名患者中有416例(77.6％，组B)，在初诊时通过使用PCT测量已检测出了感染(PCT水平＞0.1ng/ml)。在所述536名患者组中剩下的120名患者(22.4％，组C)在就诊时具有低PCT水平(＜0.1ng/ml PCT)，且至少在一个后续测量时间点(第1天、3天、5天、出院时)上PCT的水平高于0.1ng/ml，且因此被确定为发展为细菌感染的患者。

新蝶呤是免疫激活的非特异性标志物。在ED就诊时测得的新蝶呤水平在60％的C组患者中是增加的(＞10nmol/l)。然而，相同的增加导致了A组患者中感染预测的假阳性结果数(42％/176假阳性)。

出乎意料地，已显示出作为标志物且临界值为＞10nmol/l的新蝶呤与在急诊科就诊时测量且选自中间区肾上腺髓质素原(MR-proADM)、C端内皮素原-1(CT-proET-1)、C端血管加压素原(CT-proAVP)、中间区心房利钠肽原(MR-proANP)、B型利钠肽(BNP)、或N端B型利钠肽原(NT-proBNP)的其它标志物的组合导致就比值比、阳性预测值(PPV)、以及总精确度来说，感染预测效率显著增加(参见表1和2)。

表1：

表2：