一株用于防治苏门白酒草的小孢茎点霉

摘要

一株对苏门白酒草具有生防活性的小孢茎点霉菌株SMBC022，属农业杂草生物防治领域。此菌从自然环境寄主上分离获得，根据形态特征和分子生物学鉴定为小孢茎点霉。该菌生长最适培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，最适温度28℃，最适pH7.2。用真菌培养液经乙酸乙酯萃取可得到致病粗毒素。该菌体悬浮液及其毒素液对水稻等13种重要作物都没有不良影响。SMBC022菌体制剂和毒素液对恶性杂苏门白酒草具有很强致病杀草作用，经发酵菌体或毒素仿生合成技术可生产环保型真菌除草剂，具有重要的商业开发应用价值。

说明书

技术领域

    本发明涉及农业杂草的生物控制技术领域，特别是涉及用对农业杂草有很强致病作用和控制效果的病原微生物作为环境友好型生物除草剂，具体是一株用于防治苏门白酒草的小孢茎点霉。

背景技术

苏门白酒草原产于南美洲，19世纪中期引入中国，近年来苏门白酒草生长迅速，繁殖速度快，产生大量的种子，分布广泛（特别是长江沿岸地区），在它们生长的周围，几乎看不到本地植物生长，特别是“破土”的地方，由于原有的植被受到破坏，这种植物乘虚而入，抢先生长，形成生长优势，不仅造成大田粮食作物大量减产，影响经济结构和社会稳定，而且由于其大量生长在长江流域一带，很容易引发生态安全，造成严重的后果，是典型的恶草，现阶段国内对苏门白酒草的研究较少,主要集中于对其形态特征、发生特点与危害等生物学和生态学特性及防除对策等方面，而国外对苏门白酒草的研究多集中于黄菊属植物的系统进化、 生殖繁育特征和光合生理特性及遗传学等方面。我国防除苏门白酒草的措施主要是人工拔除和使用草甘膦等化学除草剂，人工除草费工费时且难以达到理想的效果，而过多地使用化学除草剂会造成环境污染和残留问题 (娄远来等，2002)。

苏门白酒草在我国的发生区域仍然在不断扩大，危害和造成的经济损失越来越严重。因此，寻求对这种恶性杂草有强致病性和生防控制作用的病原微生物，由此进一步研制无残留、不污染环境的生物除草剂，将不仅能安全有效地控制苏门白酒草的为害，以避免由此造成的巨大经济损失，而且具有重要的商业开发应用价值。

发明内容

    本发明的目的是提供一株用于防治苏门白酒草的小孢茎点霉，该真菌菌株对苏门白酒草有很强的致病作用和控制效果。根据形态学特征和基于“内转录间隔区”基因(ITS)的分子生物技术将其鉴定为小孢茎点霉(Phoma microspora)，通过生物学特性试验测定确定了它生长产孢和侵染致病的最适条件，并对其构建了系统亲缘性进化树，研究发现其通过产生毒素使杂草植株发病死亡的致病机理，分析了病菌及其毒素的寄主专化性。

1.小孢茎点霉SMBC22菌株分离纯化和筛选：在重庆不同季节多次采集苏门白酒草自然发病植株，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，经室内组织培养和纯化得到不同类型的真菌，用柯赫氏证病方法确定其中的致病菌，最后经过致病性试验比较筛选获得这种对苏门白酒草具有很强致病作用的杀草病原真菌(SMBC022菌株)。

2.SMBC022致病菌株的形态特征(图1)鉴定：将分离得到的强致病性病原菌smbc022接种到PDA平板上培养，长成的菌落呈圆形或近圆形，边缘整齐，轮纹状生长，后期同心轮纹隆起较明显。表面菌丝白色，菌落较薄，气生菌丝不发达，绒状，3天内菌落基部为白色，3天后部分逐渐转变成黑褐色，最终基部形成黑灰相间的纶纹状。菌落适宜生长温度为15-30℃，最适生长温度为28℃。菌丝无色，分枝，具隔，宽3.1-4.6μm，菌落在PDA培养基上光暗12h/12h下培养12d左右产孢。分生孢子器黑色，散生、埋生或半埋生于培养基中，球型或近球形，直径72～140μm，顶端有孔，产孢方式为瓶梗式。分生孢子椭圆形或卵形，无色，单胞，部分细胞中部有溢缩，大小为（4.5～5.8）μm×（1.6～2.1）μm，有1-2个油球。根据Sutton（1980）和 Boerema et al.(2004)的分类系统，参考相关的资料将该病原菌初步鉴定为小孢茎点霉。

    3.SMBC022致病菌株分子技术鉴定：通过氯仿/异戊醇法抽提得到SMBC022的因组DNA，将所提取的样品基因组DNA溶液分别稀释作为模板进行PCR扩增，PCR扩增采用rDNA ITS区段通用引物ITS4和ITS5。ITS4:5′-CCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，将PCR产物经纯化回收并测序后，得到此真菌的rDNA ITS区段基因序列，其长度为524bp，在Genbank的登录号为HQ645974。将获得的菌株序列登陆NCBI网站，通过BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 进行比对，比对结果表明，smbc-022ITS区段序列与NCBI GenBank中已登录的DQ474092序列相似性为99 %，且具有唯一性。去掉18s和28s将病原菌SMBC022与Genbank中选取同源性较高的相似种属的ITS序列用分析软件进行精确比对，另外使用序列分析软件采用Neighbor-joining法将所得序列与相近序列构建系统进化树。结合病原菌的形态学特征最终鉴定该菌为小孢茎点霉。其拉丁名是：Phoma microspora,其属于真菌界Mycota,半知菌门 Deuteromycota， 腔胞纲 Coelomycetes， 球壳孢目Sphaeropsidales中的茎点霉属 phoma，中文名称为小孢茎点霉。

    该菌种的活体纯培养已于2010年12月08日保藏于‘中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心’，保藏号：CGMCC No. 4417。

    4.苏门白酒草茎点霉的最佳培养和接种侵染条件：该真菌菌落生长和产生分生孢子的最适培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，最适温度28℃，最适酸碱度为pH7.2，在这些条件下，菌落生长快，产生分生孢子器和大量分生孢子；光照对真菌生长产孢无明显影响。病菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在10⁵个/mL数量级或更高，接种后保湿和暗光24h，并在整个侵染期保持温度23～28℃。

    5.苏门白酒草茎点霉的致病性和专化性：苏门白酒草茎点霉对苏门白酒草有良好的致病作用。主要侵染植株叶片和茎秆。在室内用病菌的分生孢子悬浮液直接喷雾接种后，3天即可发病，病植株率达100%，叶片失水变黑；接种7天后叶片枯死，其对苏门白酒草的控制效果与草甘膦相当。在田间接种后效果显现稍延迟，第5天植株顶部全部黄化，2周后萎蔫死亡。

    在适宜条件下用高浓度分生孢子悬浮液(10⁸个/mL)接种试验结果表明，该真菌对水稻、小麦、玉米、豌豆、油菜、辣椒、番茄、棉花等重要作物在内的6科13种水、旱作物都不致病，也不影响它们的种子萌发和植株生长，这说明苏门白酒草茎点霉是苏门白酒草的专性致病菌，若用于研制苏门白酒草除草剂，可以保证生境中其它植物的安全。

    6.苏门白酒草粗毒素：用真菌的培养液，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素。用该毒素的水液分别浸渍苏门白酒草叶片和茎秆后24h内即表现毒性症状，72h内叶片成浸渍状变黑。用此粗毒素溶液处理前述13种植物的种子和植株后未观察到毒性症状，说明这种毒素也是高度专化的。

本发明的优点是：

    从自然生长的苏门白酒草上分离获得的小孢茎点霉SMBC022菌株，是首次发现并鉴定的一个新菌株，其分生孢子接种体对我国的重要外来入侵杂草——苏门白酒草(C. sumatrensis)具有很强的致病控制作用，它产生的毒素对这种杂草也具有很强的毒性致死功效。病菌的菌剂和毒素对重要作物及环境中其它植物都没有不良影响，表现出针对苏门白酒草的高度专化杀草活性，可通过发酵菌体或仿生合成技术生产无残留的环保型真菌性除草剂，在对苏门白酒草的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。

附图说明

图1小孢茎点霉菌落的形态特征：A为菌落；B为菌丝；C 为分生孢子器；D为分生孢子

图2小孢茎点霉菌对苏门白酒草的室内和室外致病性效果：A室外接种SMBC022后苏门白酒草叶发病情况对照图（a1=1d，a2=3d，a3=7d）；B.室内接种smbc022后苏门白酒草叶的发病情况对照图（b1=1d，b2=3d，b3=8d）；C.室内离体接种与CK对照图（c1=1d，c2=3d，c3=6d）

图3小孢茎点霉菌毒素对苏门白酒草的致病效果： A和B为对照，A为无菌水处理的叶片 B.为用乙酸乙酯提取的粗毒素稀释液处理的叶片

图4小孢茎点霉（P.microspora）根据同源性分析建立的系统发育树

图5小孢茎点霉菌的内转录间隔基因ITS序列。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述

实施例1.小孢茎点霉的分离纯化与筛选

1.1真菌分离培养用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)，其配方是去皮的新鲜马铃薯200g, 葡萄糖和琼脂各20g，加自来水至1000mL。先加水将马铃薯煮烂，双层纱布过滤后加入蔗糖和琼脂，补充适量的水至1000mL,充分搅和均匀后装入三角瓶中，放入消毒器中灭菌后放置。使用前加热熔融，倒入灭菌培养皿或试管中制成平板或斜面培养基，供真菌分离培养或菌种保存用。

1.2分离培养和纯化：从自然条件下采集具有典型病害症状的苏门白酒草植株样品，漂洗干净后剪取叶片病斑与健康部分交界的组织小块儿(2 mm),放入5%次氯酸钠溶液中表面消毒以后用灭菌水漂洗3次，置于PDA平板中，在25^oC温箱中培养并每天观察，待不同菌落长出后，转移到新的PDA平板上继续培养成纯的菌落，再转移到PDA试管斜面培养基上，并编号标明菌株，保存备用。

1.3强致病菌筛选：根据柯赫氏证病律步骤确定病原菌。用病叶组织分离纯化后获得各种真菌给健康苏门白酒草植株叶片涂抹或针刺点滴接种，保证避光保湿24h，在28^oC下生长，观察发病情况。引起接种叶片发病，表现相同症状的真菌即可确定为病原菌。将上述试验确定所有病原菌以相同的方法(涂抹雾或针刺点滴)给苏门白酒草植株接种，并在相同而适宜条件下培养观察接种植株上叶片病害的严重程度，比较筛选出引起苏门白酒草发病严重的菌株，由此，本发明中筛选获得了苏门白酒草茎点霉菌。

1.4 强致病菌株SMBC022的田间控制效果：田间实验在西南大学南区后山一片主要生长苏门白酒草植株的（没有喷施任何农药，苏门白酒草长势基本一致）试验地进行。将试验地随机划分为不同的小区，每个小区选取苏门白酒草10株。将配好的smbc022和其他致病菌菌落孢子悬浮液分别装于手动喷雾器中，喷于植株叶片表面，以无菌水为对照试验，每个菌株和对照处理三个小区，定时检查苏门白酒草植株受害程度。菌落喷施后气温持续在25-35 ℃，一周内没有降雨。从喷洒菌落日起，每天调查一次，每个小区随意选取5株苏门明白酒草，记录每株苏门白酒草植株受害程度，依据病情分级标准计算防治效果，连续调查10 d。

    1.5病原菌的鉴定：（1）形态学观察与鉴定. 在PDA平板上培养病原菌，适时观察菌落形态、分生孢子器和分生孢子的显微特征；（2）分子生物学鉴定. 根据Geiser建立的技术，提取菌株的基因组DNA，用真菌转录间隔区通用引物ITS4:5′-CCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’做PCR扩增得到此真菌的转录间隔区基因序列，测序，并将序列登录到Genbank中；对该序列做Blast分析，对比相似度最高的序列名称。另外使用序列分析软件Mega4.1，Clustal等程序，采用Neighbor-joining法将所得序列与相近序列构建系统进化树并以自展（bootstrap）做可信度分析（重复1000次）。确定该病菌的分类地位。

    实施例2.小孢茎点霉菌的培养和接种条件试验

    2.1温度试验：在培养5d的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基平板上用打孔器取直径为0.5cm的SMBC22菌株的菌丝块，接种于PDA培养基上，分别设10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃ 8个温度处理，每个处理重复3次。置于7个预先设定好所需温度的光照培养箱中培养，并用垂直十字法逐日测量菌落大小，每24h测量1次，连续测量5次，记录数据。PDA培养基的酸碱度约为pH7.0。由此确定小孢茎点霉的最适生长温度。

    2.2酸碱度实验：实验采用PDA培养基，共设置11个酸碱度处理。分别用1.0 mol/L的NaOH和HCl溶液将培养基的pH值分别调节到4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0 (用电子pH计测定)，每个处理重复5次；病菌接种和生长测量方法同2.1。接菌处理后置于25℃下培养，每24h测量一次菌落直径，连续测量6次。由此确定小孢茎点霉菌生长的最佳pH值。

    2.3培养基种类的筛选：实验共比较了6种培养基对小孢茎点霉菌菌落生长的影响，除了马铃薯葡萄糖培养基(PDA)外，另外五种培养基分别是：1）马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)：水1000mL、 马铃薯200g、 葡萄糖20g和琼脂粉20g；2）清水洋菜培养基(WA)：水1000 mL及琼脂粉20g；3）胡萝卜培养基(CAA)：水1000mL、胡萝卜200g、琼脂粉20g；4）苏门白酒草根茎煎汁培养基(ARS)：水1000 mL、苏门白酒草根茎200g及琼脂粉20g；5) 苏门白酒草叶片煎汁培养基(ALA)：水1000 mL、 苏门白酒草叶片200g和琼脂粉20g。在配制PDA、CAA、ARS及ALA时，先将所需量的马铃薯、胡萝卜、杂草根茎或叶片切碎并放入水中煮烂（约煮沸30分钟），而后过滤除掉残渣并定容至1000 mL，最后再加入所需量的化学物质成分，搅拌均匀，分别盛入三角瓶中湿热灭菌后备用。各种培养基的pH值约为6.8-7.0，培养温度25℃。由此确定病菌培养的最佳培养基。

    2.4光照试验的影响：在培养5d的PDA平板上用打孔器取直径为0.5cm的SMBC022菌株的菌丝块，接种于PDA培养基上，光照梯度设置为在1500Lux 下分别照射0、6、12、18和24h。每个光照梯度做5次重复，用垂直十字法逐日测量菌落大小，每24h测量1次，连续测量5次。由此分析致病菌的在不同光照下生长状况。

    实施例3.病原菌粗毒素分离

    3.1病菌培养滤液的准备：在500mL三角瓶中分别倒入250 mL 马铃薯葡萄糖(PD)培养液，灭菌后待用。选取培养6-7d长势良好的菌落，用打孔器取Φ6 mm大小的菌饼，接种到装有250mL PS培养液的三角瓶中，每瓶接种8片，在25℃培养箱中12h光照/天条件下静止培养15天。在超净工作台上，用定性滤纸(中速)过滤，即可得到培养滤液。由此准备足够的病菌培养滤液供毒素分离提取之用。

    3.2毒素的萃取及活性试验：有机溶剂萃取：用乙酸乙酯对培养滤液进行萃取，每一体积的培养滤液用等体积的乙酸乙脂萃取3次，每次用1/3体积的乙酸乙脂，然后合并有机相，经旋转蒸发，回收有机溶剂后即可得到浓缩物。

    将乙酸乙酯萃取获得粗毒素分别用水溶解后用作对水葫芦叶片浸渍处理，测定其活性。结果提取物对苏门白酒草叶片都表现出很强的毒性。

    实施例4.病原菌及其毒素的安全(专化)性测定

    4.1供测试的作物：选择了6个科的13种重要水旱作物，包括禾本科的水稻、小麦、玉米，茄科的番茄、辣椒和烟草，葫芦科的黄瓜和西瓜、丝瓜、冬瓜，十字花科的萝卜、甘蓝、油菜和白菜，豆科的花生、豌豆、蚕豆、大豆和绿豆，以及锦葵科的棉花。

    4.2种子萌发试验：选择前述13种作物的健康种子，分别用菌丝和孢子悬浮液、病菌粗毒素溶液和清水(对照)浸泡12～36h(小粒种子处理时间短，大粒种子处理时间长)，放置在湿滤纸上，在25^oC生长箱中萌发后记载种子萌发率。结果表明所测试的作物种子萌发率与对照都没有显著差异。

    4.3作物植株生长试验：用温水浸泡12～36h (根据种子大小而定)，放置在湿滤纸上，在25^oC生长箱中催芽。待胚芽露出后播种到盆栽钵中。钵内加入经过水洗和高温烘干的沙土，然后加入一定量营养液(水中加入适量的尿素、硫酸铵和磷酸钾)。播种后在温室条件下生长，待植株长到20厘米高时，分别用菌丝和孢子悬浮液、病菌粗毒素溶液和清水(对照)喷雾处理，同时以处理苏门白酒草为发病对照。处理后每天观察记录各种植物的病变情况，到第15d时收获植株，测定不同处理的生长量。结果表明，用小孢茎点霉菌菌液和毒素液处理后苏门白酒草分别在处理后第3天和第2天即表现出明显的病害和毒素症状，而所有13种作物植株在处理15天后也没有任何病变，用菌液和毒素液处理后的植株生长量与清水对照植株的生长量之间没有显著差异。这说明病菌及其毒素对供试作物无任何不良影响。