一种适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基及其应用

摘要

本发明公开了一种适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基及其应用。本发明所述液体培养基由碳源、氮源、大量元素、微量元素和水组成。该液体培养基不仅适合白腐真菌的生长，还能够促进真菌分泌漆酶，与普通PDA液体培养基相比，同种真菌的漆酶产量提高了4~50倍。本发明所述液体培养基还具有配制方便、发酵周期短等优点，适合推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及真菌培养技术领域，具体涉及一种适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基及其应用。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，其作用底物广泛，能够有效降解木质素及催化氧化多种酚和芳胺类化合物，在生物能源、环境保护、造纸工业、食品工业、生物检测等领域均具有广阔的应用前景和潜在应用价值。大部分能够引起木本或草本植物腐化的真菌均能产生漆酶。其中，白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌的统称，具有突出的木质素降解能力，主要为担子菌，少部分为子囊菌，包括革盖菌属（Coriolus）、卧孔菌属（Poria）、多孔菌属（Polyporus）、原毛平革菌属（Phanerochaete）、侧耳属（Pleurotus）、烟管菌属（Bjerkandera）和栓菌属（Trametes）等。

白腐真菌多为好氧微生物，培养温度一般在28~30℃左右，在pH3.0～8.0的范围均能稳定产酶。白腐真菌的产酶能力与其培养条件密切相关。碳源、氮源、无机盐及各类诱导物是提高漆酶产量的关键因素。

碳源和氮源对于微生物的生长和代谢是必不可少的。然而，来源不同的微生物对培养基成分的要求有很大差异。对于白腐真菌，常见的碳源有葡萄糖、蔗糖、甘油、玉米粉、麦草粉、麸皮等；常用的氮源为(NH₄)₂SO₄ 、NH₄Cl等无机氮源，酵母提取物、蛋白胨等有机氮源以及玉米粉、马铃薯、麦麸等天然含氮物质。

此外，许多金属离子和化合物以不同的方式添加到培养基中，以诱导漆酶基因表达，提高漆酶产量。常见的金属离子诱导物有Cu²⁺、Mn²⁺等，常见的诱导剂有香兰素、愈创木酚和丹宁酸等。一些天然的含木质素的物质，如麸皮、麦草粉、木屑木汁、蔗渣等，不仅为培养基提供碳氮源，同时也可用于诱导漆酶的产生。

目前，最常见的用于培养白腐真菌的培养基是新鲜土豆所制成的PDA液体培养，通常于培养基中添加适量的麦麸诱导漆酶产生。然而，于PDA液体培养基中培养白腐真菌，虽然菌体生长快速，但是漆酶产量却十分低下，不足以用于纯化利用。本发明涉及的适合白腐真菌生长和高产漆酶的液体培养基，不仅为菌体生长提供充足的营养成分，还能促进菌体分泌漆酶。与一般的PDA液体培养基相比，同种真菌的漆酶产量可提高5至50倍，足以分离纯化并加以利用。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种不仅适合白腐真菌的生长，还能够促进白腐真菌分泌漆酶的液体培养基。

本发明另一目的在于提供上述液体培养基的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述液体培养基的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种适合白腐真菌生长的液体培养基，由碳源、氮源、大量元素、微量元素和水组成；其中，所述碳源为甘油，所述氮源为酸水解干酪素与麦麸或麦麸水解物的混合；所述大量元素为磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、琥珀酸钠、五水硫酸铜、维生素B1和吐温-80；所述微量元素为氯化钠、一水硫酸锰、氯化钙、七水硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钴、十二水硫酸铝钾、钼酸钠和硼酸。

作为一种优选方案，上述液体培养基由如下组分组成：0.001~10%（v/v）甘油，0.001~10%（w/v）酸水解干酵素，0.001~10%麦麸或麦麸水解物，0.01~10g/L磷酸氢二铵，0.01~10g/L磷酸二氢钾，0.01~10g/L七水硫酸镁，0.01~10g/L琥珀酸钠，0.01~10g/L五水硫酸铜，0.001~10g/L维生素B1，0.001~10% (v/v)吐温-80，0.0001~0.1g/L氯化钠，0.0001~0.1g/L一水硫酸锰，0.0001~0.1g/L氯化钙，0.0001~0.1g/L七水硫酸亚铁，0.0001~0.1g/L硫酸锌，0.00001~0.01g/L氯化钴，0.00001~0.01g/L十二水硫酸铝钾，0.00001~0.01g/L钼酸钠， 0.00001~0.01g/L硼酸。

本发明上述液体培养基的制备方法是将各组分混合，搅拌均匀，调节pH至2.0~8.0后，分装灭菌而得。

本发明上述液体培养基可以用于培养白腐真菌，还可以促进白腐真菌分泌漆酶。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1. 本发明所涉及的一种适合白腐真菌生长及产漆酶的液体培养基，含有多种营养成分和金属离子，不仅能为白腐真菌的生长繁殖提供足够的营养，而且促进白腐真菌分泌漆酶，同一来源的白腐真菌在本发明所涉及的液体培养基中生长比在一般的PDA液体培养基中生长，漆酶活力提高5~50倍。

2. 本发明所涉及的液体培养基，原料获取方便、配制简单。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例

1. 量取10 mL甘油、0.5 mL吐温-80。

2. 称量15 g酸水解干酪素、2 g磷酸氢二铵、1 g磷酸二氢钾、1.5 g七水硫酸镁、1.3 g琥珀酸钠、2 g五水硫酸铜、0.01g维生素B1。

3. 将上述成分混合，加入500mL水充分溶解。

4. 分别配制微量元素各个成分的母液，按比例加入上述溶液中，加水至大约800 mL，充分混匀，调节pH至5.0，定容1000mL。

5. 往上述培养基中加入10目的麦麸15g，混匀，分装，灭菌，待用。

6. 将栓菌属白腐真菌按接种量5%接种于上述培养基中，培养13天。

7. 上述培养物胞外漆酶活力达50U/mL。

分别采用PDA液体培养基以及上述方法制得的液体培养基培养栓菌属真菌11天，从第5天起每隔一天收集粗酶液，用ABTS法测定漆酶酶活力，产酶情况如下：（酶活力单位U/mL）

培养基种类5天7天9天11天PDA液体培养基0.16 0.32 0.52 0.53 本发明培养基0.78 45.10 55.85 53.33